Ćwiczenie nr 6 (09.04.2010)

Oznaczanie aktywności enzymatycznej metaloproteinaz komórkowych

Komórki nowotworowe w dużym stopniu oddziałują na macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i posiadają zdolność do jej niszczenia. Potrafią odłączać się od guza pierwotnego i migrować do odległych tkanek i narządów, gdzie osiedlają się i indukują angiogenezę, wywołując samodzielnie funkcjonujące wtórne ogniska nowotworowe. Wszystkie te cechy charakteryzują tzw. fenotyp inwazyjny nowotworu. Metaloproteinazy macierzowe są dużą rodziną białek o aktywności proteolitycznej rozkładających kolagen, żalatynę czy inne komponenty ECM i błony podstawnej. Aktywne metaloproteinazy macierzowe mogą być inaktywowane przez tkankowe inhibitory metaloproteinaz TIMP, co jest znaczące dla prawidłowego funkcjonowania zdrowych tkanek, w których nadmierna produkcja metaloproteinaz mogłaby prowadzić np. do powstania nowotworu. Zmiany poziomu ekspresji metaloproteinaz transbłonowych (MT-MMP) lub wydzielanych do macierzy zewnątrzkomórkowej (MMP) pozwalają określić inwazyjność poszczególnych linii komórkowych po zastosowaniu stresu np. napromienieniem UV.

Metaloproteinazy (MMP) wydzielane są na zewnątrz komórek, dlatego ich ilość oraz aktywność są oceniane w supernatancie, po odwirowaniu komórek. Wykonuje się test, tzw. zymografię żelatynową, gdzie przeprowadza się elektroforezę na żelu SDS-polyacrylamidowym, z dodatkiem 1% żelatyny. Po rozdziale żel wybarwia się w Coomasie Brillant Blue i obserwuje się aktywność proteolityczną enzymów (żelatynaz, kolagenaz) w postaci jasnych, wytrawionych prążków na ciemnoniebieskim tle. Na podstawie densytometrycznego odczytu intensywności wybarwienia, dokonuje się oceny aktywności badanych enzymów, w porównaniu z aktywnością enzymów w komórkach kontrolnych.

Podział sekcji /materiałów:

Sekcja	Materiał	Rodzaj ekstraktu
1	Komórki kontrolne mrożone: K	MT-MMP
2	Komórki mrożone uszkodzone UV czas: 0h	MT-MMP
3	Komórki mrożone uszkodzone UV czas: 1h	MT-MMP
4	Komórki kontrolne (świeże): K	MT-MMP
5	Komórki uszkodzone UV czas: 0h	MT-MMP
7	Komórki uszkodzone UV czas: 1h	MT-MMP
8	Medium znad komórek kontrolnych: K	MMP
9	Medium znad komórek traktowanych UV czas: 0h	MMP
10	Medium znad komórek traktowanych UV czas: 1h	MMP

MATERIAŁY:

- zamrożone osady komórkowe (traktowane i nietraktowane UV) i hodowle kontrolne (Me45-czerniak, NHDF - zdrowe fibroblasty ludzkie);

- 1 x PBS (sól fizjologiczna w buforze fosforanowym);

- wirówka stołowa wychłodzona w witrynie/wirówka z chłodzeniem;

- bufor do izolacji białek (cytoplazmatyczne):

20 mM Tris:HCl pH 7.6 (bufor)

10 mM KCl

2 mM MgCl₂

1 mM ditiotreitol [DTT] (substancja redukująca)

0.5 mM EDTA (chelator jonów II-wartościowych)

0.5% NP40 (niejonowy detergent)

2.5% glicerol (substancja zagęszczająca);

- mieszanina inhibitorów proteaz (hamują działanie enzymów proteolitycznych);

- wytrząsarka

WYKONANIE

MT-MMP (metaloproteinazy transbłonowe)

1. Zamrożone komórki (kontrolne K, traktowane UV 0h, 1h) rozmrozić w lodzie, zawiesić w 500 μl 1x PBS. Materiał odwirować 10 minut, 180-186xg (RCF), +4ºC.

2. Ściągnąć i odrzucić supernatant, osad komórek zawiesić w 5-krotnej objętości buforu
   do izolacji EC. Probówkę inkubować 10 minut w lodzie kilkakrotnie mieszając.

3. Po inkubacji komórki lekko wytrząsnąć i odwirować 10 minut, 300-321xg (RCF).

4. Zebrać supernatant do osobnej probówki (podpisać: MT-MMP).

MMP (metaloproteinazy zewnątrzkomórkowe)

1. Znad komórek zebrać po 500μl medium hodowlanego (kontrolne K, traktowane UV 0h, 1h) Materiał Odwirować 10 minut, 180-186xg (RCF), +4ºC.

2. Supernatant przenieść do nowej probówki (podpisać: MMP).

Pomiar ilości białka:

1. Do 798 µl H₂O i odpipetować po 2 µl ekstraktów białkowych. Dodać po 200 µl odczynnika Bradford, wymieszać. Po ok. 5 minutach zmierzyć stężenie białek przy użyciu spektrofotometru (próba ślepa: H₂O + odczynnik Bradford, jedna na grupę).

2. Do obliczeń stężenia białka skorzystać ze wzoru:

C [μg/μl] = A₅₉₅ x b : c

gdzie, b jest współczynnikiem wyznaczanym z krzywej wzorcowej i wynosi 16.2,
c jest ilością białka pobranego do pomiaru (tu: 2 μl).

3. Preparaty MT-MMP i MMP przygotować do nałożenia na żel. Pobrać po 20 μg białka (obliczyć na podstawie oznaczonych stężeń). W razie potrzeby preparaty uzupełnić 0.2 M NaCl (objętość końcowa preparatu = 15 μl). Dodać bufor obciążający 6x stężony (60% glicerol; 300 mM Tris:HCl pH 6.8; 12 mM EDTA; 12% SDS; 864 mM 2-merkaptoetanol; 0.05% błękit bromofenolowy), tak aby był 1 x stężony.

4. Wszystkie próby gotować 3 min. w termobloku (99⁰C), zwirować krótko (przycisk „short”)
   na maksymalnych obrotach, nakładać do kieszonek w żelu.

Przygotowanie żelu do rozdziału białek w warunkach denaturujących:

1.Żel rozdzielający 12%, po zmieszaniu reagentów dodać żelatynę (stok 2%, końcowe stężenie 0.1%)

H2O	2.12 ml
1M Tris:HCl pH 8.8	2.63 ml
40% akrylamid	2.1 ml
20% SDS	35 l
10% APS	70 l
dodać TEMED	6 μl
dodać żelatyny	350 μl
razem:	7 ml

2. Żel zagęszczający 6%, 2 ml:

H2O	1.47 ml
1M Tris:HCl pH 6.8	250 μl
40% akrylamid	254 μl
20% SDS	10 μl
10% APS	20 μl
razem:	2 ml
dodać TEMED	2 μl

3. Bufor do elektroforezy (192 mM glicyna; 0.1% SDS; 25 mM Tris:HCl pH 8.3).

4. Elektroforezę prowadzić pod napięciem 100 V przez 15 min., następnie zwiększyć napięcie
do 200 V (maksymalne natężenie prądu nie może przekraczać 300 mA). Czas trwania elektroforezy - do przejścia barwnika do końca żelu (40-50 min.).

4.Barwnik do żelu (0,25 g Coomassie Blue R; 45 ml H₂O; 45 ml metanolu; 10 ml kwasu octowego 99.9%).

Wybarwianie żelu

1. Po skończonej elektroforezie, aparat rozłożyć, wyjąć szyby i rozdzielić je, posługując się łopatką (uwaga, nie uszkodzić żelu). Zaznaczyć żel.

2. Łopatką odciąć żel zagęszczający i korek, żel ostrożnie przenieść do przygotowanego pudełeczka i zalać barwnikiem (barwnik zawiera metanol, dlatego należy pracować
   pod wyciągiem).

3. Żel postawić na kołysce i barwić 30 min.

4. Ostrożnie zlać barwnik do butelki, a żel zalać odbarwiaczem (również pod wyciągiem).

---