Wojciech Ślęczek
168560
SPRAWOZDANIE
Aktywność enzymatyczna
Doświadczenie 1
Wstęp teoretyczny:
Bufory - roztwory, których wartość pH po dodaniu niewielkich ilości mocnych kwasów albo zasad, jak i po rozcieńczeniu wodą prawie się nie zmienia. Roztwór buforowy to mieszanina kwasu i zasady czyli mieszanina protonodawcy i protonobiorcy według teorii Brönsteda.
Materiały:
wyciąg (enzym) z ziemniaków
0,1M bufor fosforanowy (pH=7,4)
0,3% roztwór pirokatechiny
woda destylowana
Opis: Do 4 kolejnych probówek dodano wyciąg z ziemniaka, wodę, bufor fosforanowy i pirokatechinę w proporcjach określonych przez poniższą tabelę:
Nr probówki |
Wyciąg z ziemniaka (ml) |
Woda (ml) |
Bufor fosforanowy (ml) |
Pirokatechina (ml) |
1 |
3 |
0 |
0,5 |
1 |
2 |
3 |
1 |
0,5 |
0 |
3 |
3 |
0 |
0,5 |
1 |
4 |
3 |
0 |
0,5 |
1 |
Probówkę nr 3 ogrzano we wrzącej łaźni wodnej i schłodzono do temperatury pokojowej, następnie dodano resztę odczynników. Zawartość wszystkich prób została dokładnie zmieszana i zostawiona na 30min, probówki 1-3 były regularnie wstrząsane co kilka minut.
Obserwacje: Roztwór w probówkach 1 i 4 zmienił barwę na brunatną, ciemno brązową. Barwa roztworów w probówkach 2 i 3 nie uległa zmianie.
Wnioski: Substratem reakcji jest pirokatechina i tlen. Reakcja utleniania pirokatechiny jest katalizowana przez enzymy zawarte w wyciągu z ziemniaka. Produktami tej reakcji są chinony dające brunatne zabarwienie w roztworze; próba nr 1 dała wynik pozytywny zmieniając kolor. W probówce nr 4 zabarwienie było lekko mniej brązowe, ze względu na bardziej ograniczony dostęp tlenu. W probówce nr 3 mimo nieobecności inhibitora, reakcja nie zaszła, ponieważ enzym został zdenaturowany pod wpływem wrzącej wody z łaźni. Próba nr 2 (brak substratu) i 3 to próby kontrolne.
Doświadczenie 2 - Próba benzydynowa
Wstęp teoretyczny:
Peroksydaza jest enzymem bardzo rozpowszechnionym w roślinach. Jej działanie związane jest z obecnością nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru nie jest rozkładany z wydzieleniem tlenu, lecz wykorzystywany przez enzym w reakcjach utleniania substratów (np. fenoli).
Próba benzydynowa polega na wykryciu peroksydaz. W obecności peroksydazy benzydyna ulega utlenieniu przez nadtlenek wodoru do difenochinonodiiminy, która kondensując z cząsteczką zredukowanej benzydyny tworzy błękit benzydynowy.
Materiały:
wyciąg z ziemniak
odczynnik benzydynowy
Opis: Do dwóch przygotowanych probówek nalewamy po 1 ml wyciągu z ziemniaka, a następnie jedną z nich wkładamy do wrzącej łaźni wodnej i oziębiamy do temperatury pokojowej. Do obu probówek dodajemy po kilka kropli świeżo otrzymanego odczynnika benzydynowego i obserwujemy zmiany.
Obserwacje: W probówce 1 (nieogrzewana) roztwór zabarwił się na kolor granatowy, natomiast probówka 2 nie zmieniła zabarwienia.
Wnioski: Niebieskie zabarwienie probówki 1 oznacza obecność peroksydaz (wynik pozytywny). Jego brak w probówce 2 oznacza zdenaturowanie enzymu podczas ogrzewania w łaźni wodnej (próba negatywna).
Doświadczenie 3 - β-amylaza z nasion zbożowych
Wstęp teoretyczny:
β-amylaza jest jedną z trzech rodzajów amylaz. Jest to enzym hydrolityczny z grupy hydrolaz, rozkładający skrobię i inne wielocukry. Występuje w soku trzustkowym i w ślinie (produkowana przez ślinianki). Zapoczątkowuje proces trawienia skrobi. Amylaza jest także syntezowana w owocach wielu roślin podczas dojrzewania powodując, że stają się one słodsze, a także podczas kiełkowania ziaren zbóż.
Materiały:
wyciąg z nasion
płyn Lugola
odczynnik Benedicta
0,5% roztwór skrobi
Wykonanie: Przygotowujemy 6 probówek według tabelki:
Probówka |
Czas inkubacji (min) |
Czynności |
1 |
30 |
Dodać 0,3ml zagotowanego i schłodzonego wyciągu z nasion |
2 |
0 |
dodać 0,3ml wyciągu z nasion; wstawić do wrzącej łaźni wodnej |
3 |
5 |
dodać 0,3ml wyciągu z nasion |
4 |
10 |
dodać 0,3ml wyciągu z nasion |
5 |
20 |
dodać 0,3ml wyciągu z nasion |
6 |
30 |
dodać 0,3ml wyciągu z nasion |
Wszystkie probówki (oprócz 2giej) wstawić do łaźni wodnej o temp. 37oC na czas podany w tabeli. Następnie wstawić je do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut i oziębić. Zawartość każdej probówki rozdzielić na pół - w jednej probówce wykonać próbę Lugola, w drugiej natomiast próbę Benedicta.
Obserwacje:
Probówki |
Próba Lugola |
Próba Benedicta |
1 |
r-r ciemnogranatowy |
Reakcja nie zachodzi |
2 |
r-r niebieski |
r-r niebieski i osad czerwony |
3 |
r-r fioletowy |
Zielony r-r, osad czerwony |
4 |
r-r fioletowy |
Zielony r-r, osad czerwony |
5 |
r-r fioletowy |
Zielony r-r, osad czerwony |
6 |
r-r fioletowy |
Zielony r-r, osad czerwony |
Wnioski: Próba Lugola dała wynik pozytywny dla wszystkich probówek, jednak w różnym stopniu. W pierwszej probówce ze zdezaktywowanym enzymem nie doszło do rozkładu skrobi, więc kolor roztworu jest najciemniejszy. W pozostałych probówkach odcienie niebieskiego robią się co raz jaśniejsze - im dłuższy czas inkubacji, tym mniej skrobi a więcej cukrów prostych i jaśniejszy odcień koloru niebieskiego.
Próba Benedicta dała wyniki pozytywne we wszystkich probówkach, oprócz pierwszej, gdyż w roztworze nie było rozpuszczonej skrobii. Próbą kontrolną była probówka 1, ponieważ pokazywała wyniki próby Lugola i Benedicta na zdezaktywowanej β-amylazie (w przeciwieństwie do pozostałych prób).
Doświadczenie 4 - Inwertaza z drożdży
Wstęp teoretyczny:
Inwertaza katalizuje hydrolityczny rozkład sacharozy (disacharydu o właściwościach nieredukujących). Hydrolizuje wiązanie glikozydowe sacharozy uwalniając glukozę i fruktozę. Uwolniona glukoza posiada zdolności redukujące, co pozwala na jej wykrycie. Sacharoza takich właściwości nie posiada. Glukoza w środowisku zasadowym redukuje jony Cu2+ do Cu+. Powstaje wtedy trudno rozpuszczalny czerwony osad Cu2O (w środowisku zasadowym fruktoza również może dawać pozytywną próbę, gdyż ulega przekształceniu w glukozę).
Materiały:
roztwór inwertazy
bufor octanowy (pH=4,4)
roztwór skrobi
roztwór sacharozy
odczynnik Benedicta
roztwór węglanu sodu
Wykonanie: Przygotowujemy 4 probówki według tabelki:
Probówka |
Inwertaza (ml) |
Woda (ml) |
Bufor octanowy(ml) |
Skrobia (ml) |
Sacharoza (ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
0 |
0 |
2 |
1 |
0 |
1 |
1 |
0 |
3 |
1 |
0 |
1 |
0 |
1 |
4 |
1* |
0 |
1 |
0 |
1 |
* Zawartość probówki 4 zagotowujemy przed dodaniem pozostałych substratów.
Probówki pozostawić w temperaturze pokojowej przez ok. pół godziny, a następnie dodać roztworu węglanu sodu w celu zobojętnienia oraz wykonać próbę Benedicta.
Obserwacje:
Probówki |
Obserwacje |
1 |
Bez zmian |
2 |
Bez zmian |
3 |
Ceglasty osad |
4 |
Bez zmian |
Wnioski: Próba Benedicta dała wynik pozytywny tylko dla probówki 3 (w niej właśnie inwertaza z drożdży zadziałała i rozłożyła sacharozę na cukry proste). Próba wypadła negatywnie w probówce 1 i 2, ponieważ nie było w nich sacharozy (jedynie na ten cukier działa inwertaza), natomiast w probówce 4 enzym poprzez zagotowanie został dezaktywowany (denaturacja) i nie doszło do rozkładu sacharozy.
Doświadczenie 5 - Enzymatyczna hydroliza skrobi przez α-amylazę śliny
Wstęp teoretyczny:
α-amylaza to enzym białkowy występujący w ludzkiej ślinie. Jego rola polega na trawieniu trafiających do jamy ustnej węglowodanów. Rozcina on wiązanie 1,4-alfa-glikozydowe. Nie powstają jednak zwykle na tym etapie same oddzielne cząsteczki glukozy; trawienie to jest dopiero wstępne, kontynuowane zaś będzie w dalszej części przewodu pokarmowego.
Enzym ten aktywny jest przy pH od 4 do 11, przy optimum ok. 7. Zachowuje działanie jedynie w obecności jonów chlorkowych. Łącznie amylaza ślinowa trawi około 30% skrobi.
Materiały:
1% roztwór skrobi
odczynnik Benedicta
ślina
płyn Lugola
Opis: Do 2 kolejnych probówek wprowadzamy 1ml śliny i 3ml roztworu skrobi, mieszamy i po ok. 10 min przeprowadzamy próbę Benedicta oraz Lugola. To samo doświadczenie powtarzamy dla śliny zagotowanej.
Obserwacje: Probówka nr 1 (ze śliną niezagotowaną) dała wynik pozytywny w próbie Benedicta - roztwór częściowo zmienił zabarwienie na brunatne; przy próbie Lugola natomiast roztwór nie zmienił zabarwienia. Probówka nr 2 (ze ślina zagotowaną) nie wykazała zmian barwy w próbie Benedicta; przy próbie Lugola wynik był pozytywny - roztwór zmienił zabarwienie na granatowy.
Wnioski: Próba Benedicta w probówce nr 1 dała wynik pozytywny, co świadczy o rozkładzie skrobi, w probówce nr 2 enzym ze śliny został uszkodzony poprzez gotowanie i próba dała wynik negatywny. Próba Lugola dała wynik negatywny w probówce nr 1, ponieważ enzym rozłożył skrobię, natomiast w probówce nr 2 próba ta dała wynik pozytywny, ponieważ enzym rozkładający skrobię został uszkodzony w wyniku podgrzewania.