BIOLOGIA MOLEKULARNA

ĆWICZENIE VII

TRAWIENIE RESTRYKCYJNE DNA

ANALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA

KWASÓW NUKLEINOWYCH

Agnieszka Mierek-Adamska

Zakład Genetyki

ENZYMY RESTRYKCYJNE

Enzymy izolowane z różnych szczepów bakterii mające zdolność do rozpoznawania

specyficznej sekwencji DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA

Nazewnictwo enzymów opiera się na literowych skrótach: pierwsza litera oznacza

rodzaj, a dwie następne gatunek bakterii z której pochodzi dany enzym; następna
litera oznacza szczep lub typ, a cyfra rzymska kolejne enzymy z danego szczepu
lub typu

Np.

E

co

R

I

–

pierwszy

enzym z

E

scherischa

co

li szczep

R

Y13

Większość enzymów rozpoznaje cztero- lub sześcionukleotydowe palindromowe

sekwencje (posiadające oś symetrii)

Enzymy restrykcyjne mogą generować „tępe” lub „lepkie” końce

Np. HaeIII 5’ GGCC 3’ 5’ GG CC 3’
3’ CCGG 5’ 3’ CC GG 5’ „tępe” końce

EcoRI 5’ GAATTC 3’ 5’ G AATTC 3’
3’ CTTAAG 5’ 3’ CTTAA G 5’ „lepkie” końce

ZASADY TRAWIENIA RESTRYKCYJNEGO

Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi

kompletnie

1 μg DNA wzorcowego w czasie 1 godziny w warunkach optymalnych.

SKŁAD MIESZANINY DO TRAWIENIA RESTRYKCYNEGO

• DNA (genomowe, plazmidowe)

• odpowiedni bufor (1/10 objętości końcowej; wyjątek YellowTango 2x – 2/10)

• enzym restrykcyjny (objętość nie może przekraczać 1/10 objętości końcowej)

• sterylna woda (do objętości końcowej)

!!!! Niektóre enzymy posiadają aktywność

star

!!!!

Większość enzymów działa w temperaturze 37°C

10X Buffer B (blue)

10 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37°C),

10 mM MgCl2,

0.1 mg/ml BSA

10X Buffer G (green)

10 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37°C),
10 mM MgCl2,
50 mM NaCl,

10X Buffer O (orange)

50 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37°C),
10 mM MgCl2,
100 mM NaCl,

10X Buffer R (red)

10 mM Tris-HCl (pH 8.5 at 37°C),
10 mM MgCl2,
100 mM KCl,

10X Buffer Tango™ (yellow)

33 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37°C),
10 mM magnesium acetate,
66 mM potassium acetate,
0.1 mg/ml BSA

ANALIZA JAKOŚCIOWA KWASÓW NUKLEINOWYCH

ELEKTROFOREZA

w żelach agarozowych

w żelach poliakryloamidowych

• polimer pochodnych galaktozy

• pory 100-300 nm

• aparaty poziome

0,7 %

0,8-10 kb

0,9 %

0,5-7 kb

1,2 %

0,4-6 kb

2,0 %

0,1-2 kb

• polimer akryloamidu z
N,N-metylenobisakryloamidu

• rozdział cząsteczek różniących się
wielkością nawet o kilka nukleotydów

• aparaty pionowe

3,5 %

1000-

2000bp

5,0 %

80-500

bp

12,0 %

400-200

bp

20,0 %

6-100 bp

ANALIZA JAKOŚCIOWA KWASÓW NUKLEINOWYCH

ELEKTROFOREZA W ŻELACH AGAROZOWYCH

Bufory do elektroforezy

TAE

TBE

Tris buforowany kwasem octowym

oraz EDTA

Tris buforowany kwasem borowym

oraz EDTA

TPE

Tris buforowany kwasem fosforowym

oraz EDTA

Wizualizacja DNA w żelu

DNA genomowe: A-nietrawione, B-trawione

RNA

DNA plazmidowe:

A,C – nietrawione,

B, D - trawione

A B C D

superzwinięta

forma OC

DNA plazmidowe

liniowa

ANALIZA ILOŚCIOWA KWASÓW NUKLIENOWYCH

POMIAR SPEKTROFOTOMETRYCZNY

Absorbancja – 0,200 – 1,000

Ratio (stosunek A

260nm

/A

280nm

)

Stężenie DNA (µg/µl)

Stężenie białek (mg/ml)

Czystość (%)

ZADANIA NA DZISIAJ

•

strawić restrykcyjne DNA plazmidowe

• przygotować żel agarozowy

• przygotować próby do nałożenia na żel

• przygotować próby do pomiaru stężenia

• nałożyć próby na żel

• zmierzyć stężenia DNA wyizolowanych na poprzednich zajęciach