Metody otrzymywania form haploidalnych,

Metody otrzymywania form haploidalnych,

cd.

cd.

Kultury in vitro zarodków, zalążków i

Kultury in vitro zarodków, zalążków i

zalążni w hodowli roślin ozdobnych

zalążni w hodowli roślin ozdobnych

1.

Kultury pylnikowe i mikrospor

2.

Metody oparte na zjawisku eliminacji
chromosomów

3.

Kultura zarodków, zalążków i zalążni

Wykład 2

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Sulechowie

2007

Biotechnologia roślin ogrodniczych

 stanu fizjologicznego rośliny, z
której pobierane są pylniki
 sposobu traktowania ściętych

kwiatostanów przed

wyłożeniem

pylników na

pożywkę
 stadium rozwojowego pyłku
 komponentów pożywek
indukcyjnych i regeneracyjnych
 warunków fizycznych hodowli
pylników

Jest to proces złożony, zależny od wielu
czynników:

Androgeneza cd.

Androgeneza cd.

Linie DH

Linie DH

Linie podwojonych haploidów (linie

DH) są to formy powstałe w wyniku

podwojenia liczby chromosomów u

haploidów.





Podwajanie liczby chromosomów u

haploidów

przeprowadza

się

najczęściej przy użyciu kolchicyny.  

Metody otrzymywania form haploidalnych z

Metody otrzymywania form haploidalnych z

wykorzystaniem zjawiska eliminacji

wykorzystaniem zjawiska eliminacji

chromosomów

chromosomów



Zjawisko eliminacji chromosomów zachodzi w

komórkach zarodka uzyskanego z krzyżowań
międzygatunkowych



Z początkowo normalnie rozwijającego się zarodka
mieszańcowego eliminowane są chromosomy tylko
jednego gatunku



Eliminacja chromosomów zachodzi również w bielmie,
co powoduje jego złe funkcjonowanie i zamieranie



Brak bielma uniemożliwia rozwój zarodka (zarodek
pozbawiony jest substancji odżywczych)



Technika ta wymaga więc prowadzenia zarodków w
kulturze in vitro



Przeniesienie zarodka na
pożywkę

sztuczną

zastępującą

bielmo pozwala również uzyskać
wiele

różnych

mieszańców

międzygatunkowych.

Kultura niezapłodnionych

Kultura niezapłodnionych

zalążków

zalążków

 

 



Jest to metoda alternatywna do techniki
uzyskiwania haploidów drogą androgenezy.
Wykorzystuje się tu zjawisko gynogenezy,
czyli rozwoju zarodków z niezapłodnionych
komórek gametofitu żeńskiego w warunkach
kultury in vitro zarodków). U roślin
ozdobnych stosunkowo łatwo jest uzyskać
haploidy tą techniką u Gerbery



 



Kultury

Kultury

in vitro

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w

zarodków, zalążków i zalążni w

praktycznej hodowli roślin ozdobnych

praktycznej hodowli roślin ozdobnych



W/w techniki stosuje się w celu otrzymania
mieszańców o pożądanej kombinacji cech z
form rodzicielskich wykazujących bariery
samoniezgodności



W`wielu przypadkach bariery te można
przezwyciężyć stosując metody kultur in vitro



Otrzymywanie mieszańców z form

Otrzymywanie mieszańców z form

rodzicielskich wykazujących

rodzicielskich wykazujących

samoniezgodność

samoniezgodność



Bariery niezgodności ujawniają się w różnych
stadiach cyklu rozwojowego

-

w momencie zetknięcia pyłku z znamieniem

-

przerastania łagiewek przez szyjkę lub po
dotarciu do zalążka

-

po zapłodnieniu

-

podczas embriogenezy.

Przykłady wykorzystania kultury

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

ozdobnych

LILIE

LILIE



Krzyżowania międzygatunkowe w hodowli lilii
prowadzi się w celu:

-

Uatrakcyjnienia barwy i kształtu kwiatów

-

Podwyższenia odporności na choroby

-

Podwyższenia odporności na stresy
abiotyczne.

Przykłady wykorzystania kultury

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

in vitro

zarodków,

zarodków,

zalążków i zalążni w hodowli roślin ozdobnych

zalążków i zalążni w hodowli roślin ozdobnych

Lilie, cd

Lilie, cd



Krzyżowano odmiany lilii uprawnych między
innymi z następującymi gatunkami:

-

L. candidum – z uwagi na czystą biel kwiatów,
zapach, tolerancję na niskie temperatury i małą
intensywność światła

-

L. longiflorum – ze względu na możliwość
całorocznego pędzenia, tolerancję na krótki
dzień, dobrą jakość przechowalnicza cebul, siłę
wzrostu i atrakcyjny zapach

-

L. henryi – odporność na choroby wirusowe i
grzybowe

Przykłady wykorzystania kultury

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

ozdobnych

Lilie , cd

Lilie , cd



Dla otrzymania mieszańców stosowano szereg
zintegrowanych technik, między innymi
kulturę całych zalążni, zalążków lub zarodków.



Z 500 wyłożonych na pożywkę zalążków
otrzymuje się średnio 1 roślinę mieszańcową



Wśród uzyskanych mieszańców znajdowano
formy o podwyższonej odporności na choroby,
ciekawym pokroju i barwie kwiatów

Przykłady wykorzystania kultury

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

ozdobnych

Tulipan

Tulipan



Uprawiane na kwiat cięty tulipany należą do
gatunku Tulipa gesenariana



Pomimo zróżnicowanej gamy kolorów, wysokości
i kształtu kwiatów brakuje u tego gatunku źródeł
odporności na choroby



Odporność na choroby próbuje się wprowadzić
między innymi poprzez krzyżowania z T.
kaufmaniana



Uzyskanie form mieszańcowych jest możliwe
tylko poprzez kulturę in vitro zarodków (7-9
tygodniowych)

Przykłady wykorzystania kultury

Przykłady wykorzystania kultury

in vitro

in vitro

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

zarodków, zalążków i zalążni w hodowli roślin

ozdobnych

ozdobnych

Róża

Róża



Podstawowymi problemami w hodowli róż są
trudności w uzyskaniu nasion zarówno z
krzyżowań między –jak i
wewnątrzgatunkowych, niska żywotność i
słabe kiełkowanie nasion.



Pomocne w przezwyciężeniu tych technik są:
kultura zalążków i zarodków

Zapylanie

Zapylanie

in vitro

in vitro

zalążni i zalążków

zalążni i zalążków



Niezgodność gatunkowa często uniemożliwia uzyskanie
metodami klasycznymi interesujących hodowcę form



Bariery niekrzyżowalności można omijać poprzez
zapylanie in vitro zalążni lub zalążków



Pozwala to na:

-

ominięcie barier samoniezgodności i uzyskanie nowych
rekombinantów roślin

-

uzyskanie poprzez indukcję partenogenezy form
haploidalnych

Przygotowanie materiału

Przygotowanie materiału



Zapobieżenie niekontrolowanemu zapyleniu



Sterylizacja materiału (odpowiednich dla danego
gatunku eksplantatów np. słupki, słupki z szypułką
kwiatową i fragmentami okwiatu



Przygotowanie pyłku do zapylenia

Przykłady wykorzystania

Przykłady wykorzystania



Larix



Picea



Pinus



Cayophyllaceae



Liliaceae



Malvaceae



Primulaceae

Kultura zarodków u roślin z prawidłowo

Kultura zarodków u roślin z prawidłowo

rozwijającym się bielmem

rozwijającym się bielmem



Kulturę zarodków prowadzi się w celu:

1.

Przerwania okresu spoczynkowego nasion

2.

Przyspieszenia okresu rozwojowego roślin

3.

Oceny żywotności nasion

Przerwanie okresu spoczynkowego nasion

Przerwanie okresu spoczynkowego nasion



Okres

spoczynku

nasion

jest

cechą

indywidualną i charakterystyczną dla danego
gatunku.



W rodzaju Irys okres spoczynku wynosi do
kilkudziesięciu miesięcy. Przerwanie okresu
spoczynku nasion można uzyskać między
innymi poprzez izolację zarodków z nasion na
pożywki sztuczne.



Kultury in vitro zarodków u chryzantem
pozwalają na uzyskanie trzech pokoleń rocznie

W praktyce często zamiast izolować zarodki,

przenosi się całe zalążki zawierające
zarodki

we

wczesnych

stadiach

embriogenezy.

W

przypadku

roślin

ozdobnych

technika

ta

znalazła

wykorzystanie w takich gatunkach jak
Pisum, Helianthus, Glycine. Technika ta
jest szczególnie przydatna w produkcji
siewek storczyków, z uwagi na bardzo
małe nasiona tego gatunku.

Selekcja w kulturach in vitro

Selekcja w kulturach in vitro

 

 



Warunkiem

skuteczności

selekcji

w

kulturze in vitro jest występowanie
korelacji między reakcją komórki lub
tkanki w kulturze, a reakcją otrzymanej z
niej rośliny. Selekcja jest prowadzona
zazwyczaj

przy

użyciu

czynnika

selekcyjnego.

W

przypadku

hodowli

odpornościowej

mogą

być

to

np.

mykotoksyny

a

hodowli

na

suszę

określone sole.

Zalet

Zalet

y

y

selekcji w kulturze in vitro

selekcji w kulturze in vitro



-możliwość oceny dużej liczby komórek lub
osobników na małej powierzchni (przy założeniu iż
istnieje

szansa

znalezienia

korzystnego

rekombinanta z częstotliwością 1:10000, u ogórka
10 płytek Petriego o średnicy 6 cm zastępuje 30 ha
doświadczeń polowych)



-możliwość badania wielu osobników równocześnie



-uniezależnienie się od występowania interakcji
genotypowo-środowiskowej



-ochrona środowiska przed szkodliwością czynnika
selekcyjnego

.

Uwalnianie roślin od wirusów

Uwalnianie roślin od wirusów



Rośliny zainfekowane wirusem
nie przedstawiają większej
wartości użytkowej!



W obrębie rośliny zainfekowanej znajdują się komórki,

grupy komórek a nieraz tkanki, w których nie można

wykryć wirusa dostępnymi metodami.



Stwierdzono, iż znaczna część roślin zregenerowanych

z tych fragmentów jest wolna od patogenów.



Możliwość uwolnienia od wirusów roślin rozmnażanych

wegetatywnie zapoczątkowało lawinowy rozwój kultury

merystemów



Opracowano procedury izolacji odpowiednio małych

wierzchołków pędu

U

U

walnianie roślin od wirusa

walnianie roślin od wirusa



Poprzez kultury in vitro merystemów
wierzchołkowych

istnieje

możliwość

eliminowania wirusów z tkanek roślinnych.
W

przypadku

przeniesienia

komórek

zainfekowanych wirusem na pożywki, często
wirusy są eliminowane samorzutnie. Istnieją
jednak wirusy tzw. uporczywe, do których
zwalczania konieczne jest zastosowanie w
kulturach in vitro dodatkowo chemoterapii
lub/i termoterapii.

Metody eliminowania wirusów

Metody eliminowania wirusów

1.Kultura in vitro

merystemów

2. Chemoterapia
3. Termoterapia
4. Krioterapia

1.

Odkażanie materiału roślinnego

2.

Inkubacja w temp. 18-22 stopni C na
świetle

3.

Pasaże co 2-3 tygodni

4.

Przesadzanie roślin do ziemi

5.

Testowanie na zdrowotność

Etapy odwirusowywania
roślin drogą izolowanych
merystemów

Rodzaje kultury merystemów

Rodzaje kultury merystemów



1. Podział roślin na sadzonki węzłowe



Przydatna w masowej produkcji roślin
ozdobnych i sadowniczych. Polega na pocięciu
rośliny na fragmenty zawierające pęd z
węzłem oraz znajdującymi się w węźle liśćmi
oraz pąkami bocznymi. Uzyskane sadzonki
węzłowe pasażuje się na kolejne pożywki.



Szeroko wykorzystywane w mikrorozmnażaniu
Astromeria, Cymbidium, Gloriosa



Schemat
mikrorozmnażania z
wierzchołka pędu
górny rząd:
A- budowa pąka
wierzchołkowego i
bocznego pędu
B – eksplantat służący
do uwolnienia rośliny
od patogenów,
C i D – eksplantaty
wykorzystywane do
mikrorozmnażania,
wierzchołek pędu i pąk
boczny;
dolny rząd:
E – mikrorozmnażanie
roślin o wzroście
wydłużonym,
F – o wzroście
rozetowym



2.

Kultura poliferujących zarodków



Poprzez dodanie do pożywki cytokinin w
dużym stężeniu uzyskuje się tzw. wieloroślinki.
Ponowne podziały i pasaże pozwalają na
uzyskanie tysięcy roślin potomnych

.



Szeroko stosowana do rozmnażania Dianthus,
Chrysanthemum, Rosa multiflora i wielu
innych.



3. Za pośrednictwem kalusa

U

U

walnianie roślin od wirusa

walnianie roślin od wirusa



Istnieją

jednak

wirusy

tzw.

uporczywe, do których zwalczania
konieczne jest zastosowanie w
kulturach in vitro dodatkowo
innych procedur .

Terapia in vitro

Terapia in vitro



Pod

wpływem

długotrwałego

działania

podwyższoną temperaturą ( w granicach 26-

45 stopni C. w czasie od 1-3 miesięcy)

następuje inaktywacja wirusów w tkankach

rośliny. Terapii cieplnej poddaje się całe

rośliny lub ich organy wegetatywne. Po

zakończeniu procesu termoterapii, z roślin

tych pobiera się tkanki merystematyczne i

dalej prowadzi kulturę in vitro w celu

uzyskania

roślin.

Metoda

ta

znalazła

zastosowanie

między

innymi

do

odwirusowywania chryzantem i goździków.

Krioterapia

Krioterapia



Krioterapia – działanie niskimi
temperaturami (0d +1-4 stopni)

Chemoterapia -

Chemoterapia -



Chemoterapia polega na dodaniu do
pożywki tzw. antymetabolitów, czyli
substancji o wysokiej aktywności
przeciwwirusowej. Są to substancje
włączające się w metabolizm wirusów
i wywołujące zmiany w kodzie
genetycznym

RNA

wirusowego,

hamując ich rozmnażanie się.

Sztuczne nasiona

Sztuczne nasiona



-produkt składający się z zarodka
somatycznego lub zaczątku rośliny
umieszczony w osłonce ochraniająco -
odżywczej, zdolny do regeneracji roślin
na skale komercyjną.



Najczęściej występują jako toczkowane
odwodnione zarodki somatyczne lub
uwodnione

zarodki

w

otoczce

hydrożelowej

Kultury protoplastów 

Kultury protoplastów 

Protoplastem nazywamy komórkę roślinną

pozbawioną ściany komórkowej, najczęściej
wskutek trawienia enzymami. Za pomocą
łączenia protoplastów różnych gatunków
można otrzymać mieszańce somatyczne
między odległymi systematycznie roślinami.



Mieszańce somatyczne są to komórki i
zregenerowane z nich rośliny otrzymane w
wyniku

fuzji

protoplastów

komórek

somatycznych

Kultury protoplastów 

Kultury protoplastów 



Kultury

protoplastów

pozwalają

na

otrzymywanie mieszańców somatycznych
nie

tylko

przez

połączenie

jąder

komórkowych, ale również przez zlanie się
cytoplazmy

partnerów,

wnoszące

dodatkowo

cechy

dziedziczone

plazmatycznie (poprzez informację zawartą
w mitochondriach i chloroplastach).



Mieszańce somatyczne

Mieszańce somatyczne



W procesie otrzymywania mieszańców

somatycznych

wyróżniamy

następujące

etapy:



-izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów

form przeznaczonych do fuzji



-fuzja

protoplastów

spowodowana

czynnikami

powodującymi

bezpośredni

kontakt błon protoplastów (czynnikami

chemicznymi

lub

elektrofuzją),

ich

odwracalne niszczenie i odbudowanie



-identyfikacja

i

selekcja

komórek

mieszańcowych



-kultura in vitro komórek mieszańcowych i

regeneracja roślin.

Kultury protoplastów 

Kultury protoplastów 



Bezpośrednio po fuzji cytoplazma
komórek

mieszańcowych

zawiera

wszystkie organelle obu komponentów
fuzji. Z upływem czasu skład takiej
komórki znacznie się zmienia, tak że w
końcu powstają na ogół komórki o
składzie

genetycznym

znacznie

różniącym się od wyjściowego.

ZAPRASZAM NA KOLEJNY WYKŁAD

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ