Elektroforeza

Ruch substancji rozpuszczonej zachodzący
pod wpływem przyłożonej zewnętrznie różnicy
potencjałów.

Prędkość ruchu danej cząsteczki jest stała,
jeżeli podczas procesu stałe pozostają:

-różnica potencjałów
-natężenie prądu
-pH środowiska
-temperatura
-przewodnictwo i lepkość roztworu

Ruch zależny jest od:

-ładunku cząsteczki
-rozmiaru i geometrii

cząsteczki

Rodzaje

elektroforezy

1. Ze względu na rodzaj nośnika np.
bibułowa

2. Ze względu na rodzaj stosowanego
prądu np. elektroforeza pulsacyjna

3. Ze względu na rozdzielany
materiał białka, aminokwasy, DNA,
RNA

Elektroforeza polega na rozdziale

mieszaniny makrocząsteczek pod

wpływem przyłożonego pola

elektrycznego. Cząsteczki wędrują

w żelu w zależności od ich

ładunku, rozmiaru, kształtu oraz

oporów ruchu środowiska

(gęstości żelu). Elektroforezę

najczęściej prowadzi się na żelach

poliakrylamidowych.

Elektroforetyczny

rozdział białek

Żele działają dodatkowo
jako sita molekularne:

- żele skrobiowe
- żele celulozowe
- PAGE
(żele
poliakryloamidowe)

Żele poliakrylamidowe

Żele poliakrylamidowe używane w metodzie western-blot do rozdziału białek są polimerami akrylamidu i bis-akrylamidu.

Od proporcji tych dwóch składników zależy gęstość i wymiary porów żelu. Wybór gęstości żelu uzależniony jest od

wielkości i masy cząsteczkowej analizowanych cząsteczek. Wysoko-cząsteczkowe białka rozdziela się na żelach o niższej

gęstości natomiast nisko-cząsteczkowe na żelach bardziej gęstych.

Bardzo często żele poliakrylamidowe

wzbogacane są w siarczan dodecylu –SDS

(SDS-PAGE). Dzięki któremu rozdział

elektroforetyczny zachodzi ze względu na

ciężar cząsteczkowy rozdzielanych białek

a nie ich ładunek (SDS opłaszcza białka

nadając im wypadkową ujemną wartość

-przez co maskuje ich pierwotny

ładunek). W polu elektrycznym ujemnie

naładowane białka migrują w kierunku

dodatniej elektrody.

Istotnym czynnikiem wpływającym na dobry
rozdział białek w żelu poliakrylamidowym jest:
-odpowiednia szybkość reakcji. (Zbyt szybka
migracja białek w żelu może powodować ich
niecałkowity rozdział).
-temperatura buforów. (zbyt wysokie napięcie
może skutkować podwyższeniem temperatury i
denaturacją badanych białek).

Elektroforeza białek w żelu

poliakrylamidowym w

obecności SDS

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest techniką

powszechnie stosowaną w analizie białek. W zależności

od zastosowanego układu można uzyskać rozdział

polipeptydów stosownie do różnych właściwości

fizykochemicznych. Przyjmuje się, że elektroforeza w

obecności SDS frakcjonuje białka zależnie od ich masy.

Ten typ elektroforezy jest obecnie najczęściej

stosowany i może być użyty jako jedna metoda

analityczna lub stanowić element szeregu dalszych,

bardziej skomplikowanych badań (np. elektroforeza

dwuwymiarowa, preparatywna, Western blotting

).

Złożem, w którym następuje rozdział białek jest

żel poliakrylamidowy, w czasie polimeryzacji oraz

w trakcie elektroforezy ustawiony w pozycji

pionowej. Standardowo SDS PAGE jest używana w

wersji tzw. disc electrophoresis, umożliwiającej

maksymalne wykorzystanie zdolności

rozdzielczych tej metody. W praktyce ta

nieciągłość dotyczy zarówno żelu, który składa się

jakby z dwóch warstw, jak również buforu do

elektroforezy: innego w górnym, innego w dolnym

zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki

nakładane na żel w tym układzie mogą mieć

stosunkowo dużą objętość, ponieważ w czasie

przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają

zagęszczone do wąskiego pasma, które w dolnym

żelu rozdziela się na pojedyncze, ostre prążki.

W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS

PAGE na zasadzie filtracji, analogicznie do

metody chromatograficznej sączenia

molekularnego.

Ponieważ frakcjonowanie zachodzi w

zależności od długości łańcucha

polipeptydowego, można ustalić masę danego

białka przez porównanie z odpowiednimi

standardami. Jest to metoda pozwalająca na

oznaczenie masy białka z dokładnością do 5-

10%, ale niestety nie każdy polipeptyd można

w ten sposób scharakteryzować (jednym z

wyjątków są białka histonowe).

Przyjmuje się, że
statystycznie jeden anion
dodecylosiarczanowy
przypada na dwie reszty
aminokwasowe. Ponadto do
rozdzielanych próbek
dodaje się silne środki
redukujące, które redukują
mostki disiarczkowe
obecne w białkach. Można
przyjąć, że tempo migracji
białek jest zależne tylko od
ich masy i jest wprost
proporcjonalne do jej
logarytmu, dlatego też
możliwe jest stosowanie
tzw. standardów wielkości
białek.

Należy pamiętać o tym, że
jakość rozdziału w SDS PAGE
zależy od poprawnego i
solidnego wykonania szeregu
prostych czynności. Dlatego
też mimo, iż technika nie jest
skomplikowana, może
zajmować sporo czasu,
kilkakrotnie więcej niż
elektroforeza agarozowa
służąca do rozdziału
preparatów DNA.

Wady elektroforezy

SDS-PAGE

Technika elektroforetyczna SDS-PAGE, mimo iż
jest bardzo powszechnie stosowana, nie jest
wolna od wad. Pierwsza z nich wynika z faktu,
iż pH żelu rozdzielającego jest zasadowe
(pH=8,8). Zasadowy odczyn powoduke
powolną hydrolizę żelu, prowadzącą do
słabszego usieciowania żelu i w konsekwencji
spadku zdolności rozdzielczej, co sprawia, że
żele SDS-PAGE nie mogą być przechowane
dłużej niż 1-2 miesiące. Zasadowe środowisko
elektroforezy powoduje również tworzenie się
mostków disiarczkowych, zaś odczynniki
redukujące nie migrują wraz z białkami, co
również może mieć negatywny wpływ na
rozdział białek.

Ponadto, wraz z przebiegiem elektroforezy,

pH żelu rozdzielającego rośnie do wartości

powyżej 9,5, co sprzyja zachodzeniu reakcji

ubocznych, takich jak deaminacja białek

oraz addycja niespolimeryzowanego

akrylamidu do grup aminowych i tiolowych

w łańcuchach bocznych aminokwasów.

Zachodzące modyfikacje białek mogą

utrudniać dalszą ich analizę technikami

spektrometrii mas. Kolejną wadą jest

wysoka temperatura podczas denaturacji

próbek białek, mogąca prowadzić do

hydrolizy wiązania peptydowego.

Obecność SDS przynosi szereg korzyści:
-niska cena stosowanych odczynników.
- zdecydowana większość
białek jest rozpuszczalna w elektrolitach
zawierających SDS
- separacja białek odbywa się zgodnie z ich
masami cząsteczkowymi

-barwienia kompleksów białko-SDS jest
znacznie wydajniejsze niż samego białka

-Obecność SDS skutecznie eliminuje
enzymatyczną degradację białek w trakcie
separacji.

Zalety elektroforezy

SDS-PAGE