25.02.2009, wykład nr 1., - Rys historyczny rozwoju wiedzy o komórce.
Podstawowe techniki stosowane w cytologii i histologii.

TEMAT: Rys historyczny rozwoju wiedzy o komórce. Podstawowe techniki

stosowane w cytologii i histologii.

1655 – Hooke – skonstruował mikroskop i opisał komórki korka

1674 – Leewenhoek – odkrył pierwotniaki i bakterie (1683)

1833 – Brown – opisał jądro komórkowe

1838 – Schleiden i Schwan – teoria komórkowa (komórka jako składnik tkanek)

1879 – Flemming – opisał chromosomy podczas mitozy

1881 –Cajel – opracował metody technik barwienia komórek nerwowych

1898 – Golgi – opisał aparat Golgiego

1934 – Rousek – pierwszy mikroskop elektronowy

1952 – Palade, Porter, Sjostrand – rozwinęli metody mikroskopii elektronowej

1951 – Robertson – opisał dwuwarstwową strukturę błony komórkowej

MIKROSKOPY

ŚWIETLNE

ELEKTRONOWE

Mikroskopy świetlne: (różnią się między sobą kondensorem)

•

mikroskopia w polu ciemnym

•

mikroskopia w polu jasnym

•

mikroskop fluoroscencyjny

•

mikroskop polaryzacyjny

•

mikroskop kontrastujący fazy

•

mikroskop interferencyjny

•

mikroskop konfokalny

•

mikroskop odwrócony – inwertoskop

1

Mikroskopy elektronowe:

•

mikroskop transmisyjny TEM

•

mikroskop wysokowoltażowy

•

mikroskop skeninkowy SEM

•

mikroskop tunelowy skenujący

•

mikroskop rentgenowski

mikroskop fluoroscencyjny

⇒

modyfikacja mikroskopu świetlnego

⇒

za jego pomocą oglądamy preparaty sporządzone przy użyciu odczynników dających efekt

fluorescencji

⇒

struktury komórkowe znakuje się np. przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami

mikroskopia w polu ciemnym

⇒

kondensator w szczególny sposób oświetla badany obiekt

⇒

do obiektywu wpadają wyłącznie promienie ugięte na strukturach obiektu, promienie

przechodzące przez obiekt a nie ugięte są eliminowane

⇒

struktury rozpraszające światło są widoczne jako jasne twory na ciemnym tle

mikroskop polaryzacyjny

⇒

wykorzystuję się w nim zjawisko istnienia struktur anizotropowych (mają różne współczynniki

załamania w zależności od osi, w której przebiega światło)

⇒

mierzy się dwa współczynniki załamania jako opóźnienie przebiegu promieni wolniej

biegnących wobec szybszych

⇒

im większa grubość badanego obiektu tym większa różnica

⇒

znajdują się w nim dwie płytki: polaryzator i analizator zbudowane z polaryzującego światło

materiału

⇒

polaryzator jest pod kondensorem, a analizator nad obiektywem

mikroskop kontrastujący fazy

⇒

stosowany do badań przeżyciowych komórek np. hodowanych in vitro

⇒

wyposażony w płytkę fazową, która przesuwa fazę światła przechodzącego tak aby w wyniku

interferencji z promieniem świetlnym utworzyć obraz kontrastowy przedmiotu fazowego

⇒

w wyniku interferencji powstaje efekt interferencyjny dodatni bądź ujemny

⇒

kontrast fazowy + to są ciemne struktury na jasnym tle

2

mikroskop interferencyjny

⇒

do mierzenia przesunięcia fazowego światła przechodzącego przez badane struktury

⇒

nakłada się dwie lub więcej wiązek światła

⇒

za pomocą pomiaru współczynnika załamania światła można określić stężenie substancji w

danych obszarach komórki, czyli podać suchą masę materii żywej

mikroskop konfokalny

⇒

źródłem światła jest laser, którego cienki promień skenuje, pole po polu, linia po linii,

obserwowane pole widzenia

⇒

średnica plamki promienia laserowego to zdolność rozdzielcza mikroskopu, sięga wartości

0,1

µ

m

⇒

promień lasera tnie materiał na warstwy o ww grubości

⇒

pozwala na uzyskiwanie obrazów w świetle przechodzącym i w świetle odbitym, obrazy te

można następnie, za pomocą komputera, dowolnie ze sobą zestawiać

transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

⇒

występują soczewki magnetyczne

⇒

źródło promieniowania to katoda

⇒

obrazy powstają w wyniku rozpraszania przez dany obiekt wiązki elektronów

⇒

działo elektronowe wytwarza elektrony, które są przyspieszane przez wysokie napięcie, które

jest formowane przez uzwojenia soczewek elektromagnetycznych, z drugiej strony jest ekran

fluoroscencyjny

⇒

preparat musi znajdować się w próżni i być bardzo cienki

⇒

kontrast uzyskuje się przez nałożenie barwników zawierających metal ciężki, który pochłania

lub rozprasza elektrony

⇒

mikroskop daje obraz dwuwymiarowy

mikroskop elektronowy skenujący (SEM)

⇒

cienka wiązka elektronów przemiata linia po linii powierzchnię obiektu badanego

⇒

wybijane z powierzchni wtórne elektrony są zbierane i wzmacniane przez fotopowielacz, a

sygnały przeważane są na monitorze

⇒

uzyskiwanie obrazów 3D

3

Metody i techniki histologiczne:

1) Metody HE (hematoksylina/eozyna)

⇒

hematoksylina – barwnik zasadowy – jądro

⇒

eozyna – barwnik kwaśny – cytoplazma

2) Metoda histochemiczna – wykrywanie hydrolaz i dehydrogenaz

3) Immunohistochemia

⇒

do określania lokalizacji białek, kwasów i cukrów, używa się przeciwciał

⇒

z badaną strukturą łączą się określone przeciwciała, które oznakowane zostały

fluorochromami

⇒

czasem należy dodać dodatkowo przeciwciało II, które jest połączone z substancją

znacznikową i przyłącza się ono do przeciwciała I i dzięki temu są znakowane

odpowiednie struktury

4) Hodowla tkanek

⇒

umożliwia ocenę zachowań komórek i tkanek pod wpływem różnych substancji

⇒

badania in vitro

⇒

w celu standaryzacji takich badań powstały czyste linie komórkowe

⇒

można uzyskać linie nieśmiertelne przez transformację nowotworową np. przez wprowadzenie

wirusa SU40 do genomu komórki

5) Autoradiografia

⇒

właściwości promieniotwórcze pierwiastków można wykorzystać do śledzenia szlaków

metabolicznych niektórych makrocząsteczek

⇒

do wykrywania tych radioizotopów służy emulsja fotograficzna

⇒

komórki nie rozróżniają pierwiastków od ich promieniotwórczych izotopów, którymi są

znakowane cząsteczki prekursorowe

⇒

do oznakowania prekursorów metabolizmu białek wykorzystuje się aminokwasy, w których

jeden z atomów C zostaje zastąpiony promieniotwórczym izotopem, można też zastąpić inne

atomy np. siarkę w cysteinie

⇒

jedną z zasad DNA np. tymidynę znakujemy trytem

⇒

znakowane prekursory dodajemy do środowiska hodowlanego komórka przejmuje te

prekursowy i wtapia w swój metabolizm

⇒

skrawki mikroskopowe pokrywamy emulsją fotograficzną i zostawiamy na kilka tygodni

⇒

po obróbce fotograficznej obecne w komórce izotopy promieniotwórcze emitują elektrony,

które jonizują bromek srebra do srebra metalicznego

⇒

ziarna srebra w naświetlonej emulsji znajdują się nad strukturami komórkowymi, do których

komórka wbudowała znakowane prekursory

4