Wykład 10

Wirusy stawonogów

Są czynnikiem etiologicznym wielu chorób owadów, roztoczy, roślin, czy kręgowców.

Dwie grupy:

I namnażają się tylko w tkankach stawonogów

II przenoszona przez wektory owadzie powoduje choroby roślin i zwierząt

I grupa Bakulowirusy

Rodzina: Baculoviridae

- Opisano 500 gatunków tych wirusów. Namnażają się w larwach owadów głównie motyli i muchówek. Podział opiera się na zdolności (Eubaculovirinae) i braku zdolności wytwarzania charakterystycznych ciał wtrętowych w zakażonych komórkach (Nudibaculovirinae).

- Materiał genetyczny tych wirusów stanowi dwuniciowy, kolisty DNA.

- Genom koduje 12-30 polipeptydów strukturalnych.

- Wiriony przedstawicieli Eubaculovirinae składają się z jednego lub wielu pałeczkowatych nukleokapsydów zamkniętych w pojedynczej otoczce.

Nudibaculovirinae

Wiriony występują w 2 postaciach:

1. Pierwsza postać wirionu zawiera w swej budowie długi i wąski ogonopodobny występ przyczepiony do jednego końca nukleokapsydu.

2. Drugi typ wirionu nieokluzyjnego jest podobny do formy okluzyjnej lecz prawie dwukrotnie większy.

Eubaculovirinae

NPV (nuclear polyhedrosis virus) GV (granulosis virus)

Wirus poliedrozy jądrowej Wirus granulozy

MNPV (multiple nucleocapsid viruses) SNPV (single nucleocapsid viruses)

Wirusy zawierające wiele Wirusy zawierające pojedynczy

nukleokapsydów w otoczce nukleokapsyd w otoczce

Wirusy poliedrozy jądrowej i wirusy nieokluzyjne replikują się wyłącznie w jądrze zakażonych komórek, zaś wirusy granulozy mogą również (oprócz jądra) replikować się w cytoplazmie.

W toku infekcji wirusem wytwarzającym ciałka wtrętowe powstają dwie funkcjonalne i morfologiczne formy wirionów. We wczesnym stadium pojedyncze nukleokapsydy pączkują przez błonę cytoplazmatyczną (BV-buddet virus, forma pączkująca) później (20-70 godzin) pojawiają się formy okluzyjne (OV-occluded virus) zamknięte w otoczce polihedrynowej.

Infekcja komórek zarówno in vivo jak i in vitro, odbywa się za pośrednictwem formy BV, która wnika na zasadzie endocytozy bądź fuzji z błona komórkową przenoszą się one drogą poziomą (z komórki do komórki) - rozprzestrzenianie zakażenia wewnątrz organizmu.

<rys. fota nr2337>

Otoczka polihedrynowa chroni wirusy przed niekorzystnym oddziaływaniem środowiska poza organizmem owada , a także przed działaniem enzymów proteolitycznych w pierwszym etapie zakażenia.

Formy inkluzyjne zakażają organizm owada per os lub poza jelitowo do jamy ciała w warunkach laboratoryjnych.

Bakulowirusy można namnażać przez infekcję wrażliwych owadów oraz hodowli komórkowych uzyskanych z tkanek owadzich.

Procedura namnażania w owadach.

Jaja złożone przez samicę dezynfekuje się np. 70% etanolem, umieszcza się je na sterylnej pożywce i inkubuje do czasu wylęgnięcia gąsienic. (Pożywka zawiera kiełki pszeniczne, kazeinę, glukozę, witaminy i sole mineralne - zestalone agarem). Gąsienice zakaża się (w sterylnych warunkach) drogą zależną od rodzaju wirusa:

• do ustnie - replikujące się w jelicie

• injekcja w odcinku odwłokowym

Po wystąpieniu objawów (czytaj: śmierci owada) izoluje się wirusy lub ciałka wtrętowe.

I Homogenizuje się całe owady lub wybrane narządy

II Filtruje się przez gazę

III Wirowanie różnicowe, dalej w gradiencie sacharozy.

Po oczyszczeniu poliedrów można je ropzpuścić w zasadach, a wirusy uwolnić przez sedymentację.

Hodowanie w hodowlach komórek owadzich.

Hodowle komórek owadzich otrzymuje się z narządów gąsienic, poczwarek i form dojrzałych: jajników, jelit, ciał tłuszczowych hemolimfy.

Są opracowane specjalne podłoża do uzyskiwania linii komórkowych. Są to podłoża syntetyczne wzbogacone w hemolimfę owadów, lizat laktoalbuminy, płodową surowicę bydlęcą.

Optymalna temperatura hodowli waha się w granicach 25-30^OC, pH 6,25-7,25.

Opisano ponad 200 linii komórkowych otrzymanych z 75 gatunków stawonogów.

Hodowle komórek owadzich stosuje się obecnie do ekspresji obcych białek przy zastosowaniu bakulowirusów jako wektorów (szczepionki przeciwwirusowe, cytokiny). Bakulowirusy są też stosowane do zwalczania owadów-szkodników roślin.

Choroby owadów.

Wirusy poliedrozy jądrowej atakują larwy i poczwarki motyli, owadów dwuskrzydłych i błonkoskrzydłych.

Wirusy poliedrozy cytoplazmatycznej są patogenami wielu gatunków motyli i owadów dwuskrzydłych.

Wirusy granulozy-choroby motyli.

Wirusy nie wytwarzające wtrętów komórkowych- motyle, owady i chrząszcze.

Np.: choroby gąsienic jedwabnika morwowego: poliedroza jądrowa robaczek ma biegunkę.

W pierwszym etapie przygotowania wektora z genomu wirusa usuwa się gen kodujący białko polihedryny- co nie wpływa na właściwości zakaźne wirusa. Obce geny wprowadza się do genomu wirusowego stosując wektory plazmidowe, które wykorzystują promotor genu polihedryny do ranskrypcji obcego genu.

Komórki owadzie hodowane in vitro poddaje się w dalszym etapie transfekcji mieszaniną DNA wirusowego i DNA plazmidowego. W rezultacie takiej kombinacji uzyskuje się wirusy, które nie wytwarzają ciał wtrętowych, a namnażając się w komórkach owadzich dają produkty, które są pod względem immunologicznym i funkcjonalnym podobne do ich naturalnych odpowiedników.

Od ponad 20 lat bakulowirusy wykorzystuje się jako insektycydy do zwalczania owadów- szkodników roślin. Do tego celu nadają się ciała wtrętowe, które chronią wrażliwe wiriony przed niekorzystnum działaniem środowiska. Zamknięte w poliedrach wiriony zachowują aktywność przez lata. Ważnym elementem tej metody jest wysoka specyficzność bakulowirusa w stosunku do gospodarza-szkodnika oraz nieszkodliwość dla człowieka, zwierząt domowych i leśnych. Dzieki temu nie narusza się naturalnej równowagi w biocenozie jak to ma miejsce w przypadku stosowania środków chemicznych.

Biologiczne zwalczanie szkodników polega na rozsiewaniu z powietrza nad zagrożonymi uprawami roślin preparatów zawierających okludowane wirusy.

Problemem jest otrzymanie takiej dużej liczby ciał wtrętowych- konieczna jest masowa hodowla gąsienic bądź też hodowla komórek owadzich metodą biotechnologiczną z zastosowaniem bioreaktorów o dużej pojemności.

PRIONY

PrP^SC=białkowa zakaźna cząstka

Składają się z normalnych białek PrP występujących w komórce nerwowej, ale maja zmienioną konfigurację przestrzenną.

Białko PrP ma charakterystyczne cząsteczki 3αhelisy w strukturze trzeciorzędowej, natomiast w strukturze trzeciorzędowej białek prionowych PrP^SC dominują obszary β-fałdowe.

Budowa cząsteczki prionu

• 254 reszty AA, zawiera mostek dwusiarczkowy, 2 reszty oligocukru, resztę glukozylofosfatydyloinozytolu.

• Nie zawierają DNA, ani RNA

• Geny odpowiedzialne za syntezę białek prionowych występują u wszystkich ssaków, ptaków, niektórych owadów, a także w komórkach drożdży.

Właściwości białek prionowych (oporność wynika z konformacji)

• Oporne na działanie proteaz (powstaje 141 AA fragment oporny na dalszą proteolizę)

• Oporne na wiele czynników fizycznych i chemicznych, między innymi na temperaturę. Giną dopiero w 360^OC po godzinie lub po godzinie w temp. -131 ^OC

• Oporne na działanie światła UV i promieniowania jonizującego w dawkach i czasie 100x większym niż działających inaktywująco na kwasy nukleinowe.

• Oporne na działanie wszystkich czynników chemicznych inaktywujących kwasy nukleinowe (RNazy, DNazy, itp.)

• Oporne na niektóre czynniki uszkadzające białka (mocznik, siarczan dodecylu sodu(SDS), fenol i inne)

• Inaktywacja 4% roztworem Wodorotlenku sodu po 1h

• Brak właściwości immunogennych

• Brak reakcji zapalnej

• Brak zmian histopatologicznych innych tkankach, tylko w CUN

Skąd się biorą priony?

- mutacja w genie odpowiedzialnym za białko PrPc, w późniejszym etapie białko PrP^SC oddziaływuje na białko PrPc (heterodimery)-które ulega przekształceniu z formy normalnej na PrP^SC

- przez zakażenie prionem od chorych ludzi- przez tkanki przeszczepiane, z krwią, preparaty hormonalne, narzędzia chirurgiczne itp.

-przez zakażenie prionem BSE od chorych zwierząt po spożyciu zakażonych produktów

Uszkodzenie mózgu jest rezultatem gromadzenia się w komórkach nerwowych

patologicznego białka

Choroby prionowe ludzi

Kuru- występowała w Nowej Gwinei w latach 50 XXw. u ludzi zjadających w trakcie rytualnych kanibalistycznych uczt mózg i inne części ciała zabitych ludzi.

Po zakazie takich praktyk liczba przypadków tej choroby zmalała w istotnym stopniu.

Choroba Creutzfelda-Jakoba (CJD)- stopniowa demencja umysłowa, zaburzenia motoryczne, 1 przypadek na 10⁶ ludzi. Średnia wieku osób chorych to 57 lat, minimalny wiek 27 lat (przyczyną najczęściej jest mutacja lub po ransplantacji lub podawaniu hormonu wzrostu). Znane są również przypadki tzw. rodzinnej, dziedzicznej choroby CJD-np. wsród Żydów pochodzących z Libii-mutacje w kodonie 200 zmieniające Glu na Leu. W paru rodzinach na Słowacji i w Chille. Wszyscy, którzy takie mutacje posiadają-zachorują.

Choroba Gerstmana-Strausslera-Scheinkera- rzadszy typ choroby, który może być przekazany do małp i do naczelnych. Mutacje w kodonie 102: Pro-Leu.

Nieuleczalna rodzinna bezsenność- mutacja w kodonie 178, u dorosłych powyżej 50 rż., przeciągające się zaburzenia snuśmierć w ciągu roku od wystąpienia objawów.

Zwierzęce choroby prionowe

• Scrapie u owiec- (trzęsawka) najstarsza forma już w XVIIw.

• Zakaźna encefalopatia u norek

• Gąbczasta encefalopatia kotów

• Gąbczasta encefalopatia dzikich przeżuwaczy (jelenie, łosie)

• Gąbczasta encefalopatia bydła (choroba szalonych krów)

U ludzi odmiana Choroby Creutzfelda-Jakoba- czynnik vCJD różni się od pozostałych form CJD i wykazuje bardzo duże podobieństwo z białkiem prionowym BSE.

Różnice między zakażeniem vCJD a CJD:

• zapadają młodzi ludzie (30-40lat), a nawet występuje u dzieci

• dłuższy czas rwania 10-24 ms

• przewaga ataksji nad otępieniem

Możliwość zakażenia prionami BSE u ludzi

Najbardziej skuteczna metoda: bezpośrednio domózgowe wprowadzenie czynnika zakaźnego (nie wystepuje w naturze)

Naturalnie: Droga przez przewód pokarmowy- być może kumulacja i replikacja białek prionowych może odbywać się w tkance limfoidalnej migdałków, kępki Pyera, w węzłach chłonnych krezkowych i śledzionie.

Panuje pogląd, że :

- powielanie patologicznego białka prionowego dokonuje się w komórkach układu retikulo- limfatycznego i te komórki odgrywają rolę w transporcie białka infekcyjnego do CUN.

- Bądź wędrówka prionów odbywa się wzdłuż nerwów obwodowych

• Bądź po pokonaniu bariery jelitowej wędrują naczyniami limfatycznymi do śledziony, skąd przez synapsy nerwów śledzionowych przedostają się do ich osłonek i tą drogą docierają do CUN.

Wrażliwość wirusów na działanie czynników fizycznych i chemicznych.

Poszczególne wirusy a nawet szczepy tego samego wirusa wykazują znaczne różnice na działanie czynników fizycznych i chemicznych.

• Działanie temp. 56^OC niszczy zakaźność większości wirusów, chociaż są wyjątki np. wirus żołtaczki zakaźnej w temp. 100^OC dopiero po 20 min. Są też wirusy, które ulegają inaktywacji już w temp. pokojowej.

• Wirusy są bardzo wrażliwe na wysychanie

• Wykazują dużą wrażliwość na działanie światła słonecznego i promieni UV (260nm)

• Promieniowanie jonizujące uszkadza wirusy (działanie bezpośrednie i pośrednie)

• Działanie ultradźwięków powoduje destrukcję wirusa w preparatach oczyszczonych, znajdujący się w tkankach nie ulega uszkodzeniu

• Wirusy wykazują bardzo różną wrażliwość na zmiany pH, niektóre nie ulegają inaktywacji w zakresie 2-12, inne jak np. wirus grypy ulega uszkodzeniu przy nieznacznym odchyleniu

• Większość wirusów jest odporna na działanie glicerolu- płyn do przechowywania materiałów wirusowych zakaźnych

• Działanie przeciwwirusowe środków powodujących koagulację białka jest słabe jeśli wirus znajduje się w tkankach (np. alkohol)

• Silne działanie przeciwwirusowe wykazują silne zasady, nadmanganian potasu oraz preparaty chlorowe

• Rozpuszczalniki tłuszczowe (organiczne) oraz związki powierzchniowo czynne inaktywują wirusy zawierające tłuszcze (wirusy otoczkowe). Dobrym środkiem wirusobójczym jest formalina, która w niskich stężeniach powoduje inaktywację wirusa- zastosowanie do produkcji szczepionek

• Wirusy wykazują zupełną niewrażliwość na niskie temperatury, co wykorzystywane jest do przechowywania preparatów przez długie okresy. Zastosowanie pojemnika z suchym lodem (-70OC), z płynnym azotem (-170OC), zamrażarki (-80OC). Niektóre wirusy ulegają inaktywacji przy zamrażaniu i rozmrażaniu kilkakrotnym.

• Liofilizacja (wysuszenie w próżni ze stanu zamrożenia) jest dobrym sposobem przechowywania większości wirusów.

• Wirusy nie są wrażliwe na chemioterapeutyki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe

---