ENZYMOLOGIA

WYKŁAD 4

11.03.2009

Aktywność wszystkich enzymów może być regulowana w komórce przez zmiany:

• pH,

• potencjału oksydoredukcyjnego,

• temperatury,

• zmiany stężenia substratów, produktów, inhibitorów i kofaktorów,

• przez czynniki strukturalne.

Sposoby regulacji aktywności enzymatycznej tzw. enzymów regulatorowych:

1. poprzez odwracalną modyfikację kowalencyjną

2. przez aktywację proteolityczną

3. na drodze oddziaływań allosterycznych

• sprzężenie zwrotne

• działanie hormonów

• kompleksy wieloenzymowe

4. wiązanie białek regulatorowych

• np. kalmoduliny (białko o masie cząsteczkowej 17 kDa aktywuje liczne enzymy w odpowiedzi na wysokie stężenie Ca²⁺

Odwracalna modyfikacja kowalencyjna

• polega na przyłączeniu do cząsteczki enzymu małej grupy niebiałkowej

• przyłączenie to zachodzi za pomocą wiązań kowalencyjnych i przy udziale innej cząsteczki enzymu -> zmiany białka korzystne lub nie

Fosforylacja i defosforylacja (przyłączenie i odłączenie grupy fosforanowej)

Fosforylacja lub defosforylacja zmienia konformację białka wpływając na jego aktywność katalityczną. Zachodzi tylko wewnątrz komórki, bo wymagany jest ATP.

Istnieją 3 klasy kinaz białkowych:

1. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt -OH seryny i treoniny enzymu

2. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt -OH tyrozyny enzymu

3. Katalizuje reakcje fosforylacji reszt -OH Ser, Thr lub Tyr

Przykłady:

• Synteza glikogenowa - forma aktywna - forma zdefosforylowana

• Fosforylaza glikogenowa - forma aktywna - forma ufosforylowana

• Reduktaza azotanowa

- forma aktywna - 1 reszta seryny ufosforylowana

- forma nieaktywna 0 3 reszty seryny ufosforylowane

• Lipazy - forma aktywna - forma ufosforylowana

Inne typy odwracalnej modyfikacji kowalencyjnej:

• Adenylacja (przyłaczanie AMP),

• ADP-rybozylacja,

• Acylacja, acetylacja,

• Sulfurylacja (siarczanowanie),

• Ubikwitynacja,

• Farnezylacja.

Aktywacja proteolityczna (np. zymogenów)

• polega na specyficznej hydrolizie jednego lub kilku wiązań peptydowych i odłączeniu fragmentu łańcucha polipeptydowego (odcinka prekursorowego),

• powoduje zmianę konformacyjną białka umożliwiającą wytworzenie lub odsłonięcie centrum aktywnego,

• jest procesem nieodwracalnym (zachodzi tylko 1 raz dla każdego enzymu),

• może zachodzić pozakomórkowo, bo nie wymaga ATP.

1. Aktywacja zymogenów proteolitycznych enzymów trawiennych (pepsyna, chymotrypsyna, trypsyna, karboksypeptydaza, elastaza)

2. Krzepnięcie krwi - kaskadowy proces aktywacji proteolitycznej

3. 
   hormony np. proinsulina insulina

4. 
   prokolagen kolagen

Przykłady aktywacji zymogenów enzymów proteolitycznych

chymozyna-Gly syntetyzowana w środowisku żołądka (pH~7) - w tym pH centrum aktywne enzymu jest zasłonięte/blokowane przez odcinek prekursorowi

- lizyna odcinek prekursorowi oddziaływuje elektrostatycznie z dwoma resztami kw. asparaginowego CA

- 6 łańcuchów bocznych lizyny i argininy z odcinki prekursorowym tworzy wiązania jonowe (elektrostatyczne) z grupami karboksylowymi kwasu glutaminowego i asparaginowego z części zymogenu należącego do aktywnej części enzymu

W środowisku kwaśnym pH<5

• Uprotonowanie grup karboksylowych (-COOH) - bez ujemnych ładunków -> zerwanie wiązań jonowych między odcinkiem prekursorowym i częścią tworzącą po aktywacji część aktywną

• Odcinek prekursorowi nie jest stabilizowany w pozycji zasłaniającej CA -> ma miejsce:

• Odsłonięcie CA

• Katalityczna hydroliza wiązania peptydowego między odcinkiem prekursorowym a pozostałą częścią zymogenu, która staje się enzymem aktywnym.

Niezbędne jest środowisko kwaśne do odsłonięcia centrum aktywnego.

Tempo aktywności rośnie wraz ze spadkiem pH (do pH = 2).

Enzym allosteryczny - enzym, którego aktywność może być regulowana na drodze oddziaływań allosteryczncyh.

Oddziaływania allosteryczne (kooperatywne) - oddziaływania między przestrzennie oddalonymi miejscami w cząsteczce enzymu, czyli pomiędzy:

1. Miejscami wiążącymi substrat (c. aktywnymi)

2. Miejscami wiążącymi efektor (c. allosterycznymi)

3. Miejscami wiążącymi substrat i miejscami wiążącymi efektor (c. aktywne <-> c. allosteryczne)

Centrum allosteryczne - miejsce inne niż centrum aktywne, do którego przyłącza się efektor (inhibitor lub aktywator allosteryczny)

Efektor allosteryczny - drobnocząsteczkowy związek organiczny lub nieorganiczny przyłączający się w innym miejscu niż centrum aktywne (do c. allosterycznego) wpływający na zmiany konformacyjne centrum aktywnego enzymu, wpływa więc na powinowactwo enzymu do substratu, nie wpływa zaś na V_max.

Homotropowa - oddziaływanie pomiędzy dwoma CA

Heterotropowa - oddziaływanie pomiędzy CA a allosterycznym

Kooperatywność pozytywna homotropowa

- np. stymulowanie wiązania substratu przez substrat

Kooperatywność pozytywna heterotropowa

- np. stymulowanie wiązania substratu przez efektor (aktywator allosteryczny)

Kooperatywność negatywna homotropowa

- np. zakłócenie wiązania substratu przez substrat (rzadko)

Kooperatywność negatywna heterotrpowa

- np. zakłócenie wiązania substratu przez efektor (inhibitor allosteryczny)

Enzymy allosteryczne

• Zwykle zbudowane z kilku podjednostek, z których każda ma jedno lub więcej miejsc aktywnych,

• Zwykle poza centrum aktywnym posiada również centrum allosteryczne,

• Aktywność może być regulowana, modyfikowana przez efektory allosteryczne,

• Sigmoidalna zależność V do [S] (nie stosuje się kinetyka Michaelita-Menten).

Enzymy oligomeryczne

Allosteryczne efektory - Nie zawsze tworzą kompleksy, które podlegają dalszym zmianom, ale zmieniają konformację enzymu - wpływają na jego powinowactwo do substratu

Kinetykę enzymów allosterycznych opisuje model sigmodalny

Zależność sigmoidalna jest wynikiem kooperatywnego wiązania substratu. Związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmieniać powinowactwo innych miejsc aktywnych enzymu - na ogół zwiększenie powinowactwa

Sigmoidalna zależność szybkości reakcji od stężenia substratu dla enzymu allosterycznego

Skutki allosterycznej regulacji dowolnego enzymu

Porównanie modeli allosterycznych

W modelu jednoprzejściowym przyłączenie do jednej podjednostki jednej cząsteczki ligandu powoduje przejście całej cząsteczki enzymu (wszystkich podjednostek) w stan o większym (mniejszym) powinowactwie.

Jeśli ligandem jest substrat, to w większości przypadków jego przyłączenie wywołuje pozytywne oddziaływanie

Negatywne sprzężenie zwrotne

końcowy produkt (względnie produkt pośredni) wieloetapowego szlaku metabolicznego jest inhibitorem allosterycznym enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego szlaku.

Np. hamowanie aktywności dehydratazy treoninowej przez izoleucynę

Pozytywne sprzężenie zwrotne

Najczęściej substrat pierwszej reakcji wieloetapowego ciągu przemian jest aktywatorem allosterycznym enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego ciągu przemian.

Np. aktywacja syntazy cytrynianowej (acetylo-CoA + szczawiooctan = cytrynian) przez acetylo-CoA

Enz - OH

Enz - O-P

ATP

P_i

kinaza

białkowa

fosfataza

białkowa

ADP

H₂O

trypsynogen

pepsynogen

pepsyna +

H⁺

pepsyna

44 aminokwasowy odcinek prekursorowy

trypsyna

enterokinaza

trypsyna-Ile +

Lys-(Asp)₄-Val

prochymozyna

H^-

chymozyna

chymozyna-Gly +

42 aminokwasowy

Phe-odcinek prekursorowy

silnie kwaśna silnie zasadowy

Kooperatywność = allosteria

pozytywna

negatywna

homotropowa

heterotropowa

inhibitor allosteryczny opóźnia osiągniecie V_max,

efektor przyspiesza

treonina

szybkość reakcji [V]

stężenie substratu [S]

+ inhibitor

+ aktywator

szybkość reakcji [V]

stężenie substratu [S]

kwas α-ketomasłowy

izoleucyna

---