Konspekt z ćwiczeń nr 2 – Odporność nieswoista. Immunologia nowotworów.

1. Różnice pomiędzy odpornością swoista a nieswoistą

Nieswoista

• bardzo szyba (nie wymaga wstępnej aktywacji)

• receptory rozpoznające drobnoustroje są nie zmienne w ciągu życia

• jest selektywna – celem ataku nie są własne struktury

• nie pozostawia trwałej pamięci immunologicznej

• rozwija się niezależnie od odpowiedzi swoistej

Swoista

• rozwija się wolno

• receptory rozpoznające antygeny wykształcają się na nowo przy każdej pierwotnej reakcji immunologicznej

(nie są dziedziczone)

• wieloletnia pamięć immunologiczna

• do rozwinięcia jest potrzebna prawie zawsze odpowiedź nieswoista

2. Wrodzone mechanizmy obronne:

Narząd	Aktywny komponent	Mechanizm działania
Skóra	Rogowaciejący nabłonek, pot, łój	Bariera mechaniczna, złuszczanie komórek i niskie pH uniemożliwia kolonizację
Drogi oddechowe	Rzęski, kaszel, kichanie, wydzieliny śluzowo-surowicze	Wydalanie drobnoustrojów, przemywanie powierzchni
Przewód pokarmowy	Kwas solny, perystaltyka jelit, złuszczanie nabłonka, fizjologiczna flora bakteryjna	Niskie pH uniemożliwia namnażanie, utrudniona kolonizacja, wydzielanie bakteriocyn i substancji przeciwgrzybiczych, konkurencja o habitat z patogenami
Krew, wydzieliny	Laktoferyna, transferyna Interferony, TNF lizozym	Wiązanie żelaza Indukcja odpowiedzi immunologicznej, interferowanie z cyklem życiowym wirusa
Inne (działające we wszystkich wymienionych)	Układ dopełniacza Białka ostrej fazy Komórki żerne, NK Lizozym (ślina, łzy, wydzielina nosa)	Działanie chemotaktyczne, opsonizacja, fagocytoza, efekt cytotoksyczny Aktywacja dopełniacza, opsonizacja Fagocytoza, cytotoksyczność komórkowa Rozkładanie ścian bakterii

3. Komórki tuczne – rola w odporności nieswoistej.

4. Rozpoznawanie drobnoustrojów przez wrodzone mechanizmy odpornościowe

1. Wzorce molekularne związane z patogenami - PAMP (pathogen associated molecular patterns); cząsteczki PAMP

• Najbardziej charakterystyczne struktury określonych grup drobnoustrojów rozpoznawane przez komórki odpowiedzi nieswoistej (np.LPS, kwas tejchojowy, mannany)

1. Receptory rozpoznające wzorce – PRR (pattern recognition receptors) ; wzorce molekularne występujące w mikroorganizmach, natomiast nieobecne u człowieka

5. Receptory PRR

• Trzy grupy:

1. Receptory wydzielane

2. Receptory powierzchniowe

3. Receptory wewnątrzkomórkowe

• Wydzielane PRR

• Opsoniny

• Kolektyny: Białko wiążące mannozę (lektyna wiążąca mannozę)

• Białka A i D surfaktantu

• Pentraksyny: białko C-reaktywne, surowicze białko amyloidu, pentraktyna 3

• Wewnątrzkomórkowe PRR

• W cytoplazmie lub w połączeniu z błonami, np. siateczki śródplazmatycznej, fagolizosomów, mitochondriów

• Wykrywanie zakażeń drobnoustrojami wewnątrzkomórkowymi (głównie wirusowych i niektórych bakteryjnych)

• Receptory NOD-podobne (NLR - NOD-like receptors)

• Receptory NOD-podobne (NLR-NOD-like receptors)

• NOD-podobne (nucleotide binding oligomerization domain)

• Rozpoznają produkty tych drobnoustrojów, które zostały sfagocytowane

Do cząsteczek NLR należą m.in.:

• Białka NOD1 i 2, które poprzez domenę LRR rozpoznają składniki bakteryjnego peptydoglikanu i aktywują czynnik transkrypcyjny NF-κB

• Trzy podrodziny białek (7 białek NAIP, jedno IPAF oraz 14 NALP), których zadaniem jest utworzenie kompleksu aktywującego kaspazę 1, zwanego inflamasomem

• Powierzchniowe PRR

1. Receptory uczestniczące głównie w fagocytozie

• Receptory zmiatacze (scavenger receptors) – np. fosfatydyloseryna i fosfatydylocholina

• Uczestniczą w usuwaniu mikroorganizmów, ich toksycznych produktów (endotoksyn) oraz komórek apoptotycznych. Biorą również udział w odkładaniu się cholesterolu w ogniskach miażdżycowych.

2. Receptory, których główną funkcją jest aktywacja komórek

• TLR (Toll-like receptors)

6. Przekaz sygnału przez receptor TLR

1. Pobudzenie TLR

2. Białko MyD88 łączy się domeną TIR z TLR

3. Aktywacja kinazy IRAK

4. Uwolnienie IRAK do cytoplazmy, gdzie łączy się z czynnikiem TRAF6

5. Aktywacja kinazy IKK

6. Aktywacja IKK powoduje fosforylację i degranulację czynnika IκB ( inhibitor NF-κB) prowadząc do uwolnienia NF-κB

7. NF-κB wnika do jądra komórkowego i kieruje ekspresją genów kodujących cytokiny prozapalne

8. Układ dopełniacza – konwertazy C3 i C5, MAC, rola w odporności nieswoistej.

Mechanizmy regulujące (ochronne)
Niekontrolowanej aktywacji układu dopełniacza zapobiega kilka typów oddziaływań białko-dopełniacz:

Inaktywacja składników dopełniacza przez białka surowicy

1. czynnik I – inaktywator C3b - jest proteazą serynową

a. czynnik I rozczepia C3b (wolny w roztworze lub na powierzchni komórek)

- produkty degradacji są niezdolne do działania w kompleksie C4b2b3b.

- jeden z produktów degradacji – C3c- jest przetwarzany w C3e

b. czynnik I degraduje C4b, ale tylko w obecności białka wiążacego C4bBP

(C4b- binding protein C4bBP)

2. Inaktywator anafilatoksyny (tzw. surowicza karboksypeptydaza N)

enzymatycznie niszczy aktywność biologiczną C3a, C4a, C5a, usuwając argininę z końca karboksylowego

1. Układ fagocytarny - układ siateczkowo-śródbłonkowy

Grupa komórek rozsianych w całym ustroju (najwięcej w wątrobie i śledzionie), warunkujących fagocytozę i biosyntezę przeciwciał (limfocyty B) odgrywających podstawową rolę w odporności przeciwzakaźnej, w usuwaniu nieprawidłowych lub obumarłych komórek oraz obcych substancji z ustroju.

Układ ten zbudowany jest przez tkankę siateczkową (należącą do tkanki łącznej) oraz komórki śródbłonka naczyń zatokowych śledziony i wątroby (zwane komórkami Browicz-Kupfera).

1. Ziarnistości wewnątrzkomórkowe neutrofilów

ziarnistości pierwotne, nazywane inaczej azurofilnymi, które powstają już na etapie promielocytu. Stanowią one 10-20% wszystkich zawartych w neutrofilach ziaren wewnątrzcytoplazmatycznych. Spośród zawartych w nich białek szczególnie istotne są: kwaśne hydrolazy lizosomowe, serprocydyny, defenzyny i mieloperoksydaza (wyznacznik ziarnistości azurofilnych).

ziarnistości wtórne, stanowiące 80-90% wszystkich ziarnistości, nazywane są także ziarnistościami swoistymi, ze względu na fakt ich występowania tylko w neutrofilach. Zawierają m.in. alkaliczną fosfatazę. Ich białkiem markerowym jest laktoferyna.

ziarnistości trzeciorzędowe, czyli żelatynowe, nazwane tak ze względu na obecność enzymu żelatynazy

ziarnistości wydzielnicze, w skład których wchodzą różne białka osocza, zaś cechą charakterystyczną jest obecność alkalicznej fosfatazy

Po pobudzeniu neutrofila dochodzi do uwolnienia ziarnistości do fagolizosomu, dzięki czemu zamknięte w nim mikroorganizmy mogą zostać zabite.

1. Receptory uczestniczące w fagocytozie

1. Receptory dla fragmentu Fc przeciwciał (FcR) - Indukowanie fagocytozy oraz aktywacja komórki np. do cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC); silnym stymulatorem ekspresji FcR jest INF-

- Receptory dla fragmentu Fc przeciwciał klasy IgG

Przeciwciała klasy IgG są najefektywniejszymi opsoninami

1. Receptory dla składników dopełniacza

1. Receptory dla fragmentu Fc przeciwciał na komórkach człowieka:

	CD	Wiązanie IgG	Występowanie	Funkcje
FcγRI	CD64	monomer	monocyty, makrofagi (neutrofile, eozynofile – w wyniku aktywacji IFN- γ	Największe powinowactwo do IgG, jest jedynym który wiąże wolne przeciwciała (pozostałe wiążą IgG połączone z antygenem),
FcγRII	CD32	w kompleksach	monocyty, makrofagi, neutrofile, płytki krwi, limfocyty B, eozynofile	najpowszechniej występujący receptor dla IgG, 3 odmiany: Fc γ RIIA, Fc γ RIIB, FC γ RIIC kodowane przez trzy różne geny, A i C są do siebie podobne i występują na monocytach, makrofagach i neutrofilach, a odmiana B na pozostałych, Fc γ RIIB występujący na LimB przekazuje LimB sygnał supresyjny (zwrotne hamowanie odpowiedzi humoralnej przez przeciwciała), uczestniczy również w usuwaniu kompleksów immunologicznych (wysyła sygnał supresyjny do komórek usuwających te kompleksy i zapobiega wystąpieniu reakcji zapalnej)
FcγRIII	CD16	w kompleksach	makrofagi, neutrofile, komórki NK, eozynofile, komórki tuczne	najważniejszym receptorem uczestniczącym w ADCC
FcγRIV	CD16b	monomer	neutrofile	najsłabiej poznany

1. Receptory dla składników dopełniacza

Najważniejsze znaczenie w procesie fagocytozy przypada CR1 i CR3

Receptory te, choć wiążą cząsteczkę lub komórkę opłaszczoną odpowiednim składnikiem dopełniacza, to w przeciwieństwie do FcγR, nie indukują na ogół procesu fagocytozy

Aby fagocytoza zaszła przez CR komórka musi dostać odpowiedni sygnał (np. kontakt z czynnikiem aktywującym, albo sygnał powstający w następstwie związania fragmentu Fc przeciwciała lub fibronektyny)

Niektóre bakterie mogą jednak być fagocytowane ze pośrednictwem CR bez udziału przeciwciał

1. WRODZONE MECHANIZMY OBRONNE

Reakcja zapalna

- Gorączka

- Układ białek dopełniacza, białka ostrej fazy, interferony

• Białka ostrej fazy

• grupa białek syntetyzowanych przez hepatocyty pod wpływem cytokin: IL -6 lub IL-1, TNFα

• białko C-reaktywne (CRP-C-reactive protein)

• amyloid A surowicy

• fibrynogen - opsonina ułatwiająca fagocytozę, białko układu krzepnięcia

• białko wiążące mannozę (MBL) i inne składniki dopełniacza

• Ograniczają uszkodzenia tkanek, przyspieszają usuwanie martwych komórek, ograniczą działanie metabolitów tlenu.

Poziom CRP oraz amyloidu A pod wpływem IL-6 może wzrosnąć nawet tysiąckrotnie!

1. Destrukcja drobnoustrojów przez komórki żerne

- mechanizmy zabijania zależne od tlenu (wybuch oddechowy, rola RFT)

- mechanizmy zabijania niezależne od tlenu (czynniki, mechanizm działania BPI, katepsyny G, defensyn, lizozymu, laktoferyny).

• Czynnik bakteriobójczy zwiększający przepuszczalność (BPI) (bactericidal/permeability increasing factor)

- jest białkiem kationowym bogatym w lizynę występującym w ziarnach azurofilnych neutrofilów człowieka
- jedno z najbardziej bakteriobójczych białek ssaków
- działa na bakterie G(-) nie działa natomiast na bakterie G(+) i grzyby
- wiąże się z zewnętrzną błoną bakterii i zwiększa jej przepuszczalność dla cząsteczek hydrofobowych (antybiotyków)
- wiąże i neutralizuje LPS, zmniejsza stężenie endotoksyny bakteryjnej, zapobiega wystąpieniu wstrząsu septycznego

• Katepsyna G

- glikoproteina występująca podobnie jak BPI w ziarnach azurofilnych neutrofilów

- w mniejszych ilościach również w ludzkich monocytach i komórkach tucznych

- zabija bakterie G(+), G(-) i grzyby

- uwrażliwia również niektóre bakterie na lizozym i działa synergistycznie z elastazą na E.coli

- hamuje transport błonowy bakterii

• Defensyny

  • działają przeciwbakteryjne, przeciwgrzybioczo i przeciwpasożytniczo

  • chemoatraktanty

  • regulują aktywację dopełniacza

  • hamują wytwarzanie glikokortykosteroidów

  • wzmagają proliferację limfocytów

  • wiążą i neutralizują LPS

  • neutralizują toksyny bakteryjne

  • hamują fibrynolizę

  • pobudzają gojenie się ran

  • degranulują komórki tuczne

  • działają przeciwnowotworowo

  • mechanizm działania polega na wytwarzaniu kanałów w błonie komórkowej mikroorganizmów

Laktoferyna

• glikoproteina wykryta w mleku kobiet

• podobna do transferyny, wiąże żelazo z 250-krotnie większym powinowactwem

• głównie w swoistych ziarnach neutrofilów ale także w osoczu, łzach, nasieniu, wydzielinach śluzowo-surowiczych

• działa bakteriostatycznie wiążąc jony Fe3+ niezbędne do życia bakterii

Lizozym (muramidaza)

- rozbija wiązanie w ścianie komórkowej (między kwasem N-acetylomuraminowym a N-acetyloglukozaminą) - wiązanie to stabilizuje strukturę ściany komórkowej bakterii (szczególnie G(+)

1. Bakterie posiadające zdolność przetrwania w makrofagach

Bacillus anthracis

Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium leprae

Neisseria gonorrhoeae

Listeria monocytogenes

Salmonella typhi

Shigella sp.

Legionella pneumophila

1. Komórki NK

• Funkcje NK:

• cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych i zainfekowanych wirusem komórek autologicznych

• cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC)

• Dwie subpopulacje komórek NK u człowieka

• 1. Komórki o umiarkowanej i dużej ekspresji CD16 – NK1; (90%), wytwarzają duże ilości IFN-γ i mają silne zdolności zabijania komórek docelowych (obecność perforyny i granzymu B w ziarnach cytolitycznych)

Charakterystycznym markerem ludzkich komórek NK jest CD56-izoforma cząsteczki adhezji komórek nerwowych –N-CAM-, warunkującej przyleganie do komórek nerwowych i mieśniowych.

CD16 –receptor dla fragmentu Fc przeciwciał IgG (FcγRIII)

• 2. Komórki nie mające na powierzchni cząsteczek CD16 – NK2; słabe właściwości cytotoksyczne

• Efekt cytotoksyczny

• Powstałe pory umożliwiają gwałtowne wnikanie wody, soli, a nawet biopolimerów do wnętrza komórki , jak również wydzielanie na ekstraktu wewnątrzkomórkowego. Skutkiem zaistniałych zmian jest zniszczenie integralności błony, nieprawidłowo funkcjonująca gospodarka mineralna i w efekcie pęknięcie komórki.

• Bezpośrednio

• Za pośrednictwem przeciwciał w procesie ADCC

• Bezpośrednio:

• Mechanizm zabijania jest taki sam, jakim posługują się cytotoksyczne limfocyty T, i polega na uwalnianiu przez komórkę cytotoksyczną zawartości jej granul (perforyn i granzymów) na powierzchnię komórki zainfekowanej.

• Perforyna, poprzez tworzenie porów, umożliwia wniknięcie granzymów do wnętrza komórki oraz indukcję apoptozy.

• ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) – cytotoksyczność zależne od przeciwciał

a. zabijają komórki docelowe bez udziału dopełniacza, gdy komórki opłaszczone są swoistymi przeciwciałami

b. rola w odporności przciwnowotworowej i odrzucaniu przeszczepu

18. Receptory KIR i KAR

19. Komórki LAK i TIL

20. Immunologia nowotworów

Typy nowotworów złośliwych, etapy kancerogenezy, cechy komórek nowotworowych.

21.

• Powstawanie nowotworów

• Zaburzenia chromosomowe

• Onkogeny i protonkogeny

• Czynniki wirusowe

• Pasożyty

• Czynniki środowiskowe

• Zaburzenia immunologiczne

• Upośledzenie odpowiedzi immunologicznej

komórki nowotworowe są genetycznie i fenotypowo mniej stabilne niż zdrowe komórki

brak ekspresji cząsteczek MHC

↓

brak prezentacji antygenów

↓

brak rozpoznania i niszczenia przez limfocyty T

↓

tolerancja immunologiczna

• Tolerancja immunologiczna

• wytwarzanie cząsteczek maskujących antygeny nowotworowe

• złuszczanie antygenów nowotworowych i blokowanie miejsc wiążących na limfocytach T

• identyczność fenotypowa antygenów z komórkami prawidłowymi – brak właściwości immunogennych nowotworu

22. Marker nowotworowy (znacznik nowotworowy)

• substancja, której stężenie wzrasta w przypadku obecności w organizmie komórek nowotworowych

• Markery nowotworowe

CEA – antygen karcinoembrionalny

AFP – α-fetoproteina

β hCG – ludzka gonadotropina łożyskowa

NSE – enolaza swoista dla neuronów

PSAP – kwaśna fosfataza swoista dla prostaty

(PSA – antygen swoisty dla prostaty)

CA – antygen rakowy

TdT- transferaza nukleotydów terminalnych

Abp53 – przeciwciała przeciwko p53

22. Antygeny związane z nowotworem

23. antygeny nowotworowe nie mają charakteru antygenów swoistych (występują również na prawidłowych komórkach)

używa się wobec nich terminu

• antygeny związane z nowotworem

( tumor associated antigens) - TAA

• Podział antygenów nowotworowych

• Antygeny powszechnie występujące – obecne na komórkach nowotworowych i różnych komórkach prawidłowych; nie są swoiste dla nowotworu, (np.fragmenty telomerazy)

• Antygeny różnicowania - obecne na komórkach nowotworowych i prawidłowych komórkach, z których wywodzi się nowotwór; np. antygeny czerniaka : gp100

• Antygeny rakowo-jądrowe – oprócz komórek nowotworowych występują również na spermatocytach i spermatogoniach; mogą występować również w łożysku

• Antygeny swoiste dla nowotworu – obecne tylko na komórkach nowotworowych; np. β-katenina – zmieniona w wyniku mutacji punktowej i występująca w niektórych czerniakach

• Antygeny nowotworowe rozpoznawane są albo przez limfocyty T, albo przez przeciwciała (rzadko zarówno przez limfocyty T jak i Ab)

• Przykładem antygenu wykrywanego zarówno przez limfocyty T jak i przeciwciała jest antygen karcyno-embrionalny (CEA).

• Do antygenów nowotworowych rozpoznawanych przez limfocyty T należą głownie antygeny prezentowane przez cząsteczki MHC klasy I limfocytom T CD8+.

• Antygeny rozpoznawane przez Ab, to m.in.:

- CD19, CD20, CD21, CD22, CD37, CD53 obecne na chłoniakach wywodzących się z limfocytów B

- CEA

- α-fetoproteina

- CA 125 obecny w raku jajnika, trzustki i płuc

- PSA

25. Mechanizmy immunologiczne ułatwiające rozwój nowotworu:

• Immunosupresja:

- zewnątrzpochodna (niektóre leki, infekcje wirusowe)

- wewnątrzpochodna (czynniki supresorowe, np.niektóre cytokiny)

• Immunoselekcja

• Immunomodulacja

• „Prześlizgiwanie się” (sneaking through)

• Uwalnianie Ag nowotworowych

• Maskowanie Ag na komórek nowotworowych

• Tworzenie kompleksów Ag nowotworowych ze swoistymi Ab i blokowanie odpowiednich komórek efektorowych

• Opsonizacja komórek reagujących z antygenem

• Zaburzenia funkcji limfocytów T

• Pojawienie się na kk.nowotworowych cząsteczek indukujących apoptozę w limfocytach T (FasL)

• Aktywność regulatorowych limfocytów T i mieloidalnych komórek supresorowych

• Aktywność Ab antyidiotypowych

• Stymulacja wzrostu niektórych komórek nowotworowych przez czynniki wzrostowe uwalniane przez limfocyty

• Stymulacja wzrostu komórek nowotworowych przez swoiste Ab obecne w małym stężeniu

26. Formy immunoterapii nowotworów:

1. Czynna – efekt leczniczy próbuje się uzyskać wzmagając reaktywność immunologiczną pacjenta

2. Bierna – podawanie przeciwciał

3. Adoptywna – za efekt przeciwnowotworowy odpowiedzialne są, podawane dożylnie lub miejscowo, komórki układu odpornościowego

Metody swoiste:

1. Terapia „szczepionkami”: podawanie zmodyfikowanych komórek nowotworowych lub ich Ag

2. Immunoterapia bierna Ab monoklonalnymi

3. Terapia adoptywna limfocytami (np.limfocytami cytotoksycznymi)

• Metody nieswoiste:

1. Podawanie preparatów immunostymulujących (bakteryjnych – np. BCG, syntetycznych – np.lewamizolu i innych)

2. Terapia cytokinami

3. Terapia adoptywna komórkami (np.LAK, monocytami)

Adoptywna terapia immunologiczna polega na pobudzaniu naturalnego potencjału przeciwnowotworowego komórek układu odporności.

• Działanie naprawcze

• antykancerogenne działanie witamin C i E

• glutation

• enzymy – katalaza, dyzmutaza ponadtlenkowa, peroxydaza glutationowa

26. Mechanizmy immunologiczne w obronie p/nowotworowej

• aktywność komórek NK

• cytotoksyczność limfocytów Tc

• aktywność cytokin

• cytotoksyczność pobudzonych makrofagów i neutrofilów

• cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał

• cytotoksyczność przeciwciał zależna od dopełniacza