Chromatografia cieczowa
Instrukcja do ćwiczenia: Oznaczanie nitrofenoli metodą:
Cel ćwiczenia:
Analiza ilościowa nitrofenoli w preparacie “Atonik” metodą HPLC na odwróconej fazie.
Odczynniki:
o-nitrofenol (ONP) – związek wzorcowy
p- nitrofenol (PNP) - związek wzorcowy
5-nitroguajakolan (5NG) - związek wzorcowy
Kwas orto fosforowy – cz.d.a.
Alkohol metylowy – do HPLC
Eter diizopropylowy – cz.d.a.
Woda demineralizowana
Aparatura:
Aparat do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) firmy Knauer (Niemcy).
Kolumna chromatograficzna firmy Phenomenex (USA): Gemini 150-4 (4.0 mm I.D x 150 mm L.)
Warunki chromatograficzne:
Faza ruchoma: alkohol metylowy/eter diizopropylowy/10%(v/v) H3PO4 /H2O =1000mL/40ml/5ml/800mL
Wielkość przepływu: 0.5mL/min
Długość fali (detektor): 360 nm
Temperatura: 30 °C
Przygotowanie roztworu wzorcowego:
Do ćwiczenia odważono 560mg ONP, 840mg PNP i 290mg 5NG związków wzorcowych, przeniesiono do kolby miarowej o objętości 100 ml i rozcieńczono CH3OH do kreski. Rozcieńczono tę mieszaninę 50 razy w fazie ruchomej. Ten roztwór otrzymują studenci.
Przygotowanie krzywej kalibracyjnej:
Wstrzyknąć
20μL roztworu wzorcowego na kolumnę chromatografu cieczowego, mierzyć powierzchnię każdego piku chromatograficznego dla ONP, PNP i 5NG w integratorze komputerowym. Przygotować oddzielnie krzywą kalibracyjną dla ONP, PNP i 5NG na którą nanosić należy zmierzony każdy pik na rzędnej i stężenia dla ONP, PNG i 5NG na odciętej.Dokonać pomiaru dla każdego piku ONP, PNP i 5NG na chromatogramie. Wyznaczone ilości OP, PNP i 5NG odnieść do krzywej kalibracyjnej. Aby zmodyfikować wyznaczone ilości do soli sodowych odpowiednich związków (ONP-Na, PNP-Na, 5NG-Na) należy pomnożyć wynik przez 1,16 (dla OP i PNP), oraz 1,13 dla 5NG.
Orientacyjny czas retencji:
5NG: 6,3 min
PNP: 7,3 min
ONP: 9,5 min
Przygotowanie próbki preparatu “Atonik”:
3,0 g próbki preparatu ATONIK umieszczono w kolbie miarowej na 50 ml i rozpuszczono w fazie ruchomej. Próbkę roztworu przefiltrowano przez filtr 0,45μm. Ten roztwór otrzymują studenci. Wstrzyknąć 20μL roztworu nieznanej badanej próbki na kolumnę chromatograficzną (HPLC).
Analiza próbki:
Wstrzyknąć 20μL roztworu próbki na kolumnę chromatograficzną (HPLC). Dokonać pomiaru dla każdego piku ONP, PNP i 5NG na chromatogramie. Wyznaczone ilości OP, PNP i 5NG odnieść do krzywej kalibracyjnej. Aby zmodyfikować wyznaczone ilości do soli sodowych odpowiednich związków (ONP-Na, PNP-Na, 5NG-Na) należy pomnożyć wynik przez 1,16 (dla OP i PNP), oraz 1,13 dla 5NG.
Sprawozdanie powinno zawierać:
Cel ćwiczenia
Warunki analizy
Wyniki
Wnioski
Zagrożenia BHP
Praca z toksycznymi i łatwopalnymi rozpuszczalnikami. Wszelkie operacje z roztworami należy wykonywać pod wyciągiem. Zakaz używania ognia i elementów grzewczych.