Definicja biotechnologii wg Aleksandra Chmiela

To interdyscyplinarna dziedzina nauki, obejmująca różne kierunki technicznego wykorzystania materiałów i procesów biologicznych. W szczególności obejmuje ona procesy biosyntezy i biotransformacji przebiegające przy udziale drobnoustrojów, kultur komórkowych, enzymów a także tak otrzymywanych biopreparatów.

Podział Biotechnologii:

1) Biotechnologie tradycyjne: przebiegają z użyciem naturalnych enzymów lub drobnoustrojów lub komórek organizmów wyższych nie zawierających obcego materiału genetycznego.

2) Biotechnologie nowoczesne: stosuje się w nich szczepy drobnoustrojów lub linie komórkowe skonstruowane metodami inżynierii genetycznej.

Obejmują rekombinacje genetyczne, in vitro, klonowanie genów, fuzję komórek protoplastów, inżynierie białka, technikę hodowli mikrokomórek org. wyższych, technologię enzymów unieruchomionych, biokatalizę w układach z rozpuszczalnikami organicznymi, technikę ciągłych procesów biotechnologicznych oraz nowoczesne techniki wydzielania i oczyszczania bioproduktów.

Technologia mikrobiologiczna

Są to procesy uwarunkowane działalnością drobnoustrojów. Wykorzystują one zdolności mikroorganizmów do wywoływania różnorodnych przemian chemicznych oraz nadprodukcji metabolitów. Wiąże się to z możliwością modyfikacji genotypu drobnoustroju oraz terowania ich metabolizmem przez dobór warunków środowiskowych.

Fermentacja

Wiąże się z metabolizmem beztlenowym, w którym energotwórcze procesy utleniania substratu węglowego przebiegają z wydzielaniem CO2 nie wymagają O2 cząsteczkowego jako końcowego akceptora elektronów, jego rolę pełnią niektóre związki pośrednie powstające podczas degradacji przyswajalnych zw. Organicznych np. w fermentacji etanolowej akceptorem elektronów jest aldehyd octowy.

W mikrobiologii przemysłowej termin fermentacja używany jest w szerszym sensie i służy do określania różnych procesów mikrobiologicznych zarówno beztlenowych jak i tlenowych.

Technologia enzymów

Enzymy znalazły zastosowanie zarówno w tradycyjnych procesach przemysłu spożywczego jaki i w przemyśle chemicznym, farmaceutycznym, włókienniczym, analityce. Wzrastająca rola technologicznych enzymów wiąże się z opracowaniem technik unieruchomienia tych biokatalizatorów przy użyciu nośników, co daje większą stabilność pozwala na wielokrotne użycie oraz opracowywanie enzymatycznych procesów ciągłych.

Inżynieria bioprocesowa

Jest tym elementem biotechnologii, który warunkuje wykorzystania osiągnięć biologów i chemików przez przeniesienie technologii laboratoryjnej do warunków fabrycznych sprawiając ze technologia przemysłowa zyskuje oparcie na bardziej racjonalnych podstawach i podlega dokładniejszej kontroli.

Inżynieria genetyczna

Umożliwiają manipulacje genetyczne poza komórką, czyli rekombinowanie DNA in vitro stało się możliwe konstruowanie nowych genotypów, które nie występują w naturze.

Inżynieria cytogenetyczna

Na poziomie komórkowym. Jej praktyczne wykorzystanie do fuzji protoplastów jako metoda doskonalenia właściwości biosyntetycznych szczepów i linii komórkowych w tym hybrydowych do produkcji przeciwciał monoklonalnych.

Okresy rozwoju biotechnologii

1) Przedpasterowy; do połowy XIX wieku. Era spontanicznych procesów fermentacyjnych wykorzystywanych do otrzymywania produktów żywnościowych.

2) Przejściowy; druga połowa XIX wieku i pierwsze 40-lecie XX. Można to uznać za ere mikrobiologicznych procesów, początek współczesnej biotechnologii i opracowanie produkcji np. kw. Cytrynowego. W tym okresie zapoczątkowano stosowanie czystych kultur drobnoustrojów oraz prowadzenie bioprocesów a w sposób aseptycznych.

3) Era nowoczesnej biotechnologii- pod koniec II wojny światowej od opracowania przemysłowej produkcji penicyliny metodą tlenowej hodowli wgłębnej.

Zakres zastosowań współczesnej biotechnologii

1) Produkcja żywności:

Tradycyjne procesy fermentacyjne; Produkcja: pieczywa, fermentowanych produktów mlecznych, drożdży, napojów alkoholowych; Nowe technologie mikrobiologicznego wytwarzania białka jednokomórkowców, aminokwasów, witamin, nukleotydów, kw.organicznych i polisacharydów; Stosowanie enzymów do wytwarzania wyrobów mleczarskich, owocowo-warzywnych, napojów fermentowanych, przetworów skrobiowych; Utrwalanie żywności - oksydaza glukozowa jako antyutleniacz, lizyna

2) Rolnictwo:

Produkcja: pasz, preparatów (białkowych, witaminowych, aminokwasowych, antybiotycznych), stymulatorów wzrostu, kiszonek roślinnych; Nowoczesne techniki hodowli tkanek i komórek „in vitro” oraz metody inżynierii genetycznej; Ochrona roślin (antybiotyki, bioinsektycydy, biopestycydy); Lecznictwo zwierząt (antybiotyki,. szczepionki)

3) Ochrona zdrowia

Namnażanie drobnoustrojów; Hodowla komórek zwierzęcych „in vitro” w celu wytworzenia szczepionek i przeciwciał; Mikrobiologiczna synteza naturalnych metabolitów drobnoustrojowych (aminokwasy, kw.organiczne, witaminy, enzymy, inhibitory enzymów, dekstran, alkaloidy); Mikrobiologiczna synteza hormonów peptydowych, antygenów oraz innych produktów przy uzyciu szczepów konstruowanych metodami inżynierii genetycznej zawierających obcą informację genetyczną; Zastosowanie procesu biotransformacji (mikrobiologicznej i enzymatycznej) w produkcji leków steroidowych, aminokwasów, antybiotyków, wit.C, glukonianu wapnia, efedryny; Wytwarzanie przeciwciał monoklinalnych m.in. do celów diagnostycznych (testy immunologiczne)

4) Przemysł chemiczny i inne przemysly

Wytwarzanie surowców tj.: alkohole (etanol, butanol, izopropanol, glikol etylenowy, glikol propylenowy, glicerol), kwasy (octowy, cytrynowy, adypinowy, itakonowy, akrylowy), polimery (dekstran, ksantyn, pullulan, kw. β-hydroksymasłowy); Nośniki energii: etanol, metan, wodór (potencjalnie); Biotechnologiczna obróbka surowców naturalnych: roszenie roślin włókienniczych, hydroliza skroii w trakcie wytwarzania tkanin, odwłaszanie i wytrawianie skór, fermentacja tytoniu; Biohydrometalurgia: ługowanie rud, biozatężanie, odzyskiwanie metali

5) Ochrona środowiska

Oczyszczanie ścieków; Złoża zraszane; Filtry biologiczne; Osad czynny; Bioutylizacja odpadów: (namnażanie biomasy, procesy biosyntezy mikrobiologicznej, produkcja biogazu)

6) Analiza

Zastosowanie enzymów rozpuszczalnych np.oksydazy glukozowej łącznie z katalazą lub peroksydazą, lub dehydrogenazy glukozo 6-fosforanowej w połączeniu z heksokinazą; Czynniki enzymowe i komórkowe (oksydaza glukozowa + elektroda tlenowa, ureaza + elektroda pH); Analiza genomów: analiza restrykcyjna, sekwencjonowanie, sondy molekularne

Fizjologia drobnoustrojów przemysłowych

Drobnoustroje dzięki swoim szczególnym właściwościom pełnią ważną rolę w przemianach zachodzących w przyrodzie oraz w procesach technologicznych. Decyduje o tym:

1) Duża szybkość przemiany materii

2) Różnorodność prowadzonych przez nie reakcji chem.oraz syntetyzowanych produktów

3) Zminność fizjologiczna która pozwala na sterowanie przebiegiem procesów mikrobiologicznych przez dobór warunków środowiskowych.

4) Łatwość dokonywania zmian genetycznych drobnoustrojów w celu pozyskania wyróżniających się szczepów o zwiększonej wydajności syntezy pożądanego produktu.

Produkty wytwarzane przez drobnoustroje

1) Rodzaj produktu: całe komórki i ich składniki (np.drożdze piekarskie, preparaty paszowe, szczepionki)

2) Produkty końcowe przemian katabolicznych (Np. etanol, kwas mlekowy, kwas masłowy, aceton)

3) fermentowane produkty spożywcze (jogurt, kefir, sery, piwo, wino)

4) produkty syntez podstawowych (produkty małocząsteczkowe—aminokwasy, kwas cytrynowy, witaminy; produkty wielkocząsteczkowe—enzymy, lipidy, polisacharydy)

5) produkty syntez peryferyjnych (antybiotyki, alkaloidy, dekstran, ksantan)

6) produkty syntez i biotransformacji specjalnych z udziałem egzogennych prekursorów (1-hydroksy-1-fenylopropanon, kwas akrylowy, testosteron, L-sorboza)

7) Produkty obce dla drobnoustrojów syntetyzowane przez zrekombinowane szczepy (insulina, interferony, hormon wzrostu, różne białka i polisacharydy).

W biotechnologii i mikrobiologii przem.drobnoustroje są wykorzystywane do wytwarzania licznych produktów oraz do utylizacji ścieków. Stosowane szczepy mają różne zaburzenia metabolizmu polegające głównie na zakłóceniu mechanizmów regulacyjnych. U tych szczepów w określonych warunkach może zachodzić bezcelowa dla drobnoustrojów nadprodukcja metabolitów w minimalnym stopniu wykorzystywane przez drobnoustroje.

Dzięki technikom inżynierii genetycznej stało się możliwe wprowadzenie do komórki dodatkowej informacji genetycznej kodującej związki całkowicie obce dla drobnoustrojów.

Przydatność drobnoustrojów ocenia się wg następujących cech użytkowych:

1) wydajność i szybkość tworzenia produktów

2) czystość produktów fermentacji czyli brak substancji toksycznych

3) szybkość wzrostu

4) niepatogenność i brak produktów toksycznych

5) stabilność genetyczna, fenotypowa oraz fegooporność

6) wymagania pokarmowe, jakościowe, ilościowe oraz tolerancja na zmienne stężenie składników podłoża

7) wielkość zapotrzebowania na tlen oraz tolerancja na zmiany warunków natleniania

8) wymagania w zakresie temperatury, pH i innych parametrów procesu i stopień wrażliwości na ich zmiany

9) łatwość wydzielania produktów

10) inne cechy technologiczne mogą być niepożądane np. lepkość i pienistość hodowli; lub pożądane: zdolność do flokulacji (opadanie drożdży po fermentacji)

Drobnoustroje w procesie swojego rozwoju przejawiają zdolność do rozkładu wielkocząsteczkowych połączeń organicznych (węglowodany, białka, lipidy, węglowodory).

Transportują zw. Drobnocząsteczkowe (cukry, aminokwasy, kwasy organiczne, alkohol do komórek gdzie następuje ich degradacja połączona z uwolnieniem energii metabolicznej- synteza ATP. Równocześnie produkty fermentacji mogą być metabolitami pośrednimi w syntezie monomeru, prekursorów do podobnych monomerów i innych składników struktur komórkowych.

Wyróżnia się dwa nurty metabolizmu

1) katabolizm - procesy degradujące źródła węgla i energii

2) anabolizm - procesy syntez komórkowych

Wymagania pokarmowe drobnoustrojów

Sposoby odżywiania się drobnoustrojów. Podział ze względu na sposoby odżywiania uwzględniając 3 kryteria

1) rodzaj źródła węgla do syntezy komórkowej

2) źródła energii metabolicznej

3) rodzaj donorów elektronów i protonów

Wg tych kryteriów organizmy żywe dzielimy na 3 grupy

1) Fotoautotrofy - org. samożywne; źródło energii - słoneczna; ź. węgla - CO2, ź. elektronów - zw. nieorg., np. rośliny wyższe, glony, sinice, nieliczne bakterie.

2) Hemolitotrofy - korzystają z energii zawartej w zredukowanych zw. nieorg. (np. zw. N, S, Fe, H2); źródło węgla - CO2, ź. elektronów - zw. nieorg., np. bakterie metanowe, wodorowe, żelazowe, nitryfikujące, siarkowe.

3) Heterotrofy - cudzożywne; źródło energii - zw. chemiczne, węgla i estronów - zw.org., np. zwierzęta, grzyby, większość bakterii w tym drobnoust. stosowane w mikrobiologii przemysłowej.

Drobnoustroje stosowane w mikrobiologii przemysłowej i biotechnologii mają zazwyczaj niewielkie potrzeby pokarmowe. Większość z nich to org. prototroficzne - same syntetyzują wszystkie składniki materiału komórkowego z pojedynczego źródła węgla np. z glukozy.

Niektóre szczepy to naturalnie lub sztucznie otrzymane auksotrofy - wymagają dodatku witamin, aminokwasów lub innych zw. org. specyficznych dla drobnoust. I procesu.

W procesach biotechnologicznych stosuje się podłoża: minimalne - namnożenie komórek i wzbogacone w różne składniki np. melasa, serwatka.

Pierwiastki podstawowe i żakiet

Głównymi elementarnymi składnikami masy komórkowej drobnoustrojów wprowadzanymi do podłoża w większych ilościach są: C-stanowiący do 50% suchej masy komórek; O₂ - do 30%; N - 40%; H ₂ - do 8%; P - 3%; S - 1%

C, O₂, H₂drobnoustroje przemysłowe otrzymują w postaci związków będących źródłem energii. Wyjątkiem są metylotrofy i organizmy rosnące na węglowodorach. Drobnoustroje te korzystają z tlenu atmosferycznego oraz tlenu zawartego w nadtlenku wodoru.

N, S, P Drobnoustroje mogą uzyskiwać zarówno w postaci połączeń organicznych jak i składników mineralnych, do surowców zawierających wymienione a także inne należą: namok kukurydziany, wywar gorzelniczy, hydrolizacie białkowe, myka sojowa, mąka kukurydziana, mączka rybna.

K, Mg, Ca, Cl, Febędące kofaktorami enzymów oraz pełniące wiele funkcji metabolicznych, uzupełniane są w podłożu w razie potrzeby przez dodatek odpowiednich soli mineralnych.

Zn, Mn, Cu, Co prowadzone są do podłoży najczęściej jako zanieczyszczenia głównych składników

Czynniki wzrostowe i prekursorowe

W wielu procesach stosowane są naturalnie lub sztucznie indukowane szczepy aukstroficzne, wymagające określonych czynników wzrostowych tj.: witaminy, aminokwasy. Zasady purynowe lub pirymidynowe. W składzie podłoża stosowanych w procesach biosyntezy i biotransformacji bardzo ważna rolę odgrywają prekursory produktów finalnych lub substraty ulegające pośredniej przemianie bez złożonych przekształceń metabolicznych w kom. drobnoust. Przykładem może być biosynteza L - izoleucyny w obecności kwasu alfa-masłowego.

Prekursory stosowane w procesach do syntez mikrobiologicznych

1) Kw. 2-oksomasłowy + tryptofan alkaloidy sporyszu (Clawiceps purpura)

2) Prekursor: propanol; produkt: erytromycyna; drobnoustrój: Streptomyces erytrus

3) Prekursor: kwas alfa-aminomasłowy; produkt: L-izoleucyna; drobnoust. Bacillus subtilis

4) Jon fenyloctanowy penicylina benzylowa; Penicyllium chryzogenum

5) Jon fenyloctanowy penicylina fenometylowa; P. chyzogenum

6) Glicyna L-seryna; Corynobacterium lianofilum

7) Prekursor: jon kobaltowy kobalamina; Propionibacterium species

Degradacja związków wielkocząsteczkowych

Mikrobiologiczna degradacja związków wielkocząsteczkowych odgrywa zasadniczą rolę w obiegu materii organicznej w przyrodzie.Umożliwia to wykorzystanie niektórych naturalnych biopolimerów. Szersze zastosowanie w biotechnologii surowców odnawialnych pochodzenia roślinnego należy do jej najważniejszych atutów przyszłościowych.

Obecnie te zasoby wykorzystywane są zaledwie w 1%głównie w postaci sacharozy skrobi. Można liczyć, na co najmniej 20-krotnezwiększenie bazy surowcowej dla biotechnologii pod warunkiem opracowania efektywnych metod hydrolizy celulozy (ligniny, hemicelulozy, których udział w masie roślinnej jest dominujący).

Polisacharydy

1) Skrobia mająca obecnie największe znaczenie praktyczne wśród wielocukrów jest podstawowym materiałem zapasowym w komórkach roślinnych, składa się z dwóch glukanów: amylopektyny ( ponad 75%) i amylozy ( do 25%)

Amyloza jest polimerem zbudowanym z reszt D - glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-. Amylopektyna zawiera dodatkowo pewną ilość wiązań α-1,6-, dzięki czemu jest ona polimerem rozgałęzionym.

Stopień polimeryzacji łańcuchów amylozy i amylopektyny może wahać się w granicach od 200 do 5 tys. reszt glikozowych.

Drobnoustroje tj. bakterie, promieniowce, grzyby strzępkowe wytwarzają 3 rodzaje enzymów hydrolitycznych rozkładających skrobię tj.:

- α-amylaza - atakuje wiązania α-1,4- w różnych miejscach amylozy i amylopektyny, odcina reszty maltozy, maltotriozy i dekstryn o różnej długości łańcucha

- amylo-1,6-α-glukanaza (dekstrynaza) - hydrolizuje miejsca rozgałęzień w amylopektynie

- glukoamylaza (enzym scukrzający) - odcina kolejne reszty glukozowe

Nieliczne drobnoustroje np. z rodzaju Bacillus mogą wytwarzać również β-amylazę odcinającą reszty maltozy od strony nie redukującego końca łańcucha polimeru.

2) Celuloza występuje w postaci włókien złożonych z kilku tysięcy grup glukozowych połączonych wiązaniami β-1,4-.

Do jej całkowitego rozłożenia niezbędny jest kompleks enzymów celulolitycznych, których głownymi składnikami są takie enzymy jak:

- endoglukanaza - wiąz. β-1,4 wewnątrz łańcucha celulozy

- celobiohydrolaza - odcina cząsteczki celobiozy od nie redukującego końca łańcucha

- celobiaza (β-glukozydaza) rozkłada celobiozę do 2-ch cząsteczek glukozy

Enzymy celulolityczne wytwarzane są przez różne grupy drobnoustrojów eukariotycznych i prokariotycznych, tlenowyc i beztlenowych, mezofilnych i termofilnych.

Np. grzyby: Agaricus, Aspergillus, Chaetomium, Fusarium, Trichoderma. Bakterie: Bacteroides, Cellulomonas

Białka

Drobnoustroje przejawiają dużą aktywność w stosunku do obcych białek znajdujących się w środowisku ich rozwoju. Szczególnie dużą aktywność proteolityczna przejawiają bakterie z rodzaju Bacillus oraz grzyby z rodzaju Mucor, Aspergillus, Penicillium a także bakterie kwasu mlekowego i promieniowce. Wyróżnia się szereg proteaz (peptydaz) zależnie od mechanizmu i miejsca ich działania. Rozszczepianie białek na mniejsze fragmenty polipeptydowe prowadzą :

• endopeptydazy (proteinazy)

• egzopeptydazy (odszczepiają reszty aminokwasów na końcach łańcucha

- aminopeptydazy <od końca N>

- karboksypeptydazy <od końca C>

Tłuszcze

Są składnikami strukturalnymi błon biologicznych głównie jako fosfolipidy oraz glikolipidy, są także ważnym zapasem materiału energetycznego dla organizmów żywych.

Tłuszcze zwierzęce i oleje roślinne maja znaczenie biotechnologiczne jako środki przeciwpianowe (używane w hodowli).

Ponieważ ulagają one degradacji mikrobiologicznej są również ważnym dodatkowym źródłem węgla i energii w niektórych procesach biotechnologicznych.

Są to trójglicerydy, hydrolizowane przez lipazy należązedo grupy esteraz

Enzymy lipolityczne wytwarzają grzyby: Aspergillus, Mucom, Rhizopus, Candida

Oraz niektóre bakterie np. z rodzaju Pseudomonas

Węglowodory

Rozwój przemysłu biotechnologicznego po II w.ś. skierował uwagę badaczy na niekonwencjonalne źródło C i E. Stosunkowo najwcześniej przedmiotem zainteresowania stały się węglowodory ropy naftowej. Istnieje szereg drobnoustrojów wykazujących zdolność przyswajania n-alkanów szczególnie o długości łańcucha od 12 do 16 at.C.

Należą tu szczególnie:

-drożdże z rodzaju Candida m.in. Candida lipolithica,

-niektóre grzyby strzępkowe z rodzaju Deuteromycetes,

-bakterie z rodzaju: Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebaterium

-promieniowce tj. Actinomyces inacardia

Wybrane grupy drobnoustrojów przemysłowych

Podział drobnoustrojów <kryteria biologiczne i technologiczne>

Termin drobnoustroje, czyli mikroorganizmy nie jest jednoznaczny, do grupy tej zalicza się bakterie i liczne grzyby a także niektóre glony i pierwotniaki. Odrębną grupę stanowią wirusy, który należy traktować jako organizmy niekompletne lub zorganizowane twory z pogranicza życia i materii nieożywionej.

Wirusy

Swoiste odtwarzalne cząstki zakaźne z pogranicza organizmów żywych zbudowanych z jednego tylko rodzaju kw. nukleinowych (DNA lub rzadziej RNA) otoczonego płaszczem białkowym zwanym kapsydem. Zewnętrzne osłonki niektórych wirusów zawierają również lipidy i polisacharydy.

W kw. nuklein. zawarta jest informacja o strukturze wirusa i jego białka zakodowana w kilku do kilkudziesięciu genach (wyjątek ponad 100).

Białka wirusowe poza rolą strukturalnych składników kapsydu pełnią również określone funkcje enzymatyczne i regulacyjne. Tylko niektóre z nich wchodzą w skład winionu, czyli kompletnego wirusa składającego się z genomu i kapsydu, inne syntetyzowane są dopiero po wniknięciu wirusa do komórki gospodarza.

Wirusy są bezwzględnymi pasożytami bytującymi w zwierzętach, roślinach i drobnoustrojach (fagi) np. wirusy bakteryjne (bakteriofagi), bytujące w promieniowcach - aktynofagi, żyjące w glonach - algofagi.

Składniki zewnętrzne osłony wirusów mają charakter antygenów indukujących wytwarzanie przeciwciał w organizmach zwierzęcych, ponadto biorą one udział w procesach adsorpcji na powierzchni komórek.

Niektóre wirusy zawierające RNA mają również polimerazę DNA w zainfekowanych komórkach.

Wirusowy Dna z genomu wirusa lub nowosyntetyzowany może być wlączony gdo genomu gospodarza i pozostawać tam w stanie utajonym lub powodować nowotworową transformację zakażonych komórek, oddziaływując na ekspresję informacji genetycznej gospodarza i zmieniając metabolizm komórki.

Odmiennie przebiega zakażenie wirusowe komórek gospodarza w tzw. cyklu litycznym.

Wirusy bakteryjne pozbawione własnego metabolizmu dysponują tylko nielicznymi enzymami o bardzo swoistych funkcjach, namnażając się wykorzystują szlaki metaboliczne bakterii do pozyskania E oraz replikacji swojego genomu i syntezy pozostałych składników winionu.

Po namnożeniu dużej liczby cząstek bakteriofaga następuje liza komórki bakteryjnej i uwalniają się fagi, które zakażają następne komórki, co w krótkim czasie prowadzi do lizy dużej części lub całej populacji bakteryjnej.

W biotechnologii znaczenie wirusów jest trojakie:

1) powodują one szereg trudnych do zwalczenia infekcji w procesach biotechnologicznych

2) mogą być namnażane w procesach biotechnologicznych w celu wytworzenia szczepionek uodparniających ludzi i zwierzęta przeciw chorobom wirusowym

3) stały się one przedmiotem szczególnego zainteresowania ze strony inżynierii genetycznej gdzie są wykorzystywane do konstruowania wektorów służących do wprowadzania obcej informacji genetycznej do komórki biorcy.

Bakterie i grzyby - różnice biologiczne i strukturalne

Drobnoustroje przemysłowe należą zarówno do organizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych. Do pierwszych zaliczamy bakterie, które charakteryzują się najprostszą strukturą komórki, brak jądra i innych organelli występujących u Eukaryota.

W cytoplazmie bakterii występują małe rybosomy typu 70S i nukleoid w postaci pojedynczego cyklicznego chromosomu (genoforu) o długości rzędu 1nm, upakowany jest w centralnej części komórki.

W całym cyklu rozwojowym bakterie są organizmami haploidalnymi mającymi zdolność przekazywania inf.genet.w prymitywnym procesie płciowym (koniugacja, transdukcja).

Do wyżej stojących w rozwoju filogenetycznym organizmów eukariotycznych należą grzyby. Ich komórki zawierają otoczone błoną jądro oraz szereg organelli tj.mitochondria, chloroplasty, ER. Rybosomy są większe niż u bakterii - 80S, występują w postaci związanej ze strukturami błoniastymi. U grzybów (z wyj.Deuteromycetes) występuje pełny lub zredukowany proces rozmnażania płciowego.

Dalsze różnice pomiędzy bakteriami a grzybami dotyczą składu chemicznego ściany komórkowej.

U grzybów jest ona zbudowana głównie z chityny, glukanów i manganów, nie występuje u nich natomiast peptydoglikan (mukopeptyd) charakterystyczny dla ściany komórkowej większości bakterii.

Wśród bakterii szczególne miejsce zajmują promieniowce, których komórki maja budowę prokariotyczną ale morfologią, cyklem rozwojowym i sposobem rozmnażania przypominają grzyby strzępkowe.

Grzyby oraz promieniowce i niektóre bakterie w określonych warunkach środowiskowych po okresie intensywnego rozwoju wytwarzają na drodze wegetatywnej lub płciowej całą grupę komórek spoczynkowych charakteryzujących się:

1) ograniczonym/zahamowanym metabolizmem

2) mniej lub bardziej zmienionym w porównaniu z komórkami wegetatywnymi składem chemicznym

3) zróżnicowaną morfologią i ultrastrukturą

Komórki te określane są najczęściej jako spory i zapewniają tym drobnoustrojom przetrwanie niekorzystnych warunków środowiska.

Bakterie Gram(+) i Gram(-)

Różnice w strukturze ściany komórkowej bakterii stanowią podstawę ważnej metody diagnostycznej, która dzieli je na 2 grupy w zależności od wybarwiania się komórek fioletem krystalicznym lub goryczkowym metodą Gramma.

Złożona okrywa zewnętrzna bakterii gram(-) charakteryzuje się dużą zawartością fosfolipidów, lipoproteid, liposacharydów i białek oraz znacznie mniejszą zawartością peptydoglikanu w porównaniu z jednowarstwową ścianą komórkową bakterii gram(+). Na zewnątrz błony cytoplazmatycznej bakterie gram(-) mają przestrzeń peryplazmatyczną, cienką warstwę peptydoglikanu i grubą błonę zewnętrzną podczas gdy u bakterii gram(+)

strukturą zewnętrzną ściany komórkowej jest warstwa peptydoglikanu.

Różnice w budowie ściany komórkowej G(+) i G(-) decydują w zasadniczy sposób o mechanizmach transportu oraz wrażliwości lub oporności na działanie czynników zewnętrznych.

Bakterie G(+) wytwarzają znacznie mniej białek <enzymów> pozakomórkowych oraz są bardziej oporne na działanie lizozymu, antybiotyków czy detergentów.

Zdecydowana większość bakterii o znaczeniu przemysłowym należy do bakterii G(-).

Klasycznym przykładem bakterii G(-) jest pałeczka okrężnicy E.coli należąca do bakterii symbiotycznych zasiedlających jelita ludzi i zwierząt i wytwarzająca szereg witamin wykorzystywanych przez organizm.

Spośród innych bakterii G(-) znaczenie przemysłowe mają rodzaje:

- Acetobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Xantomonas, Zymomonas

Glony

Pewne znaczenie gospodarcze maja również glony (algi), rośliny zarodnikowe rozwijające się autotroficznie w środowisku wodnym lub miejscach wilgotnych. Część z nich to jednokomórkowe okrzemki, sinice, eugleny.

Znaczenie gospodarcze glonów związane jest z wykorzystywaniem ich jako surowca do otrzymywania specyficznych produktów tj.: agar-agar, karagenian, algininian,

a także nawozu, paszy dla zwierząt oraz pokarmu dla człowieka.

Znaczenie biotechnologiczne ma słodkowodny glon chlorella, która może być hodowany i wykorzystany jako pożywienie bogate w białko i witaminy.

Bakterie kwasu mlekowego

Fzjologia gr bakterii kw mlekowego określona również nazwą bakterii mlekowych obejmuje rodzaje ziarniaków: Streptococus, Pegicoccus, Leuconostac, oraz pałeczki Lactobacilus. Są to bakerie G+ pozbawione zdolności ruchu, są beztlenowcami. Biotechnologiczne znaczenie oznaczanych bakterii wynika z ich zdolności do beztlenowego metabolizmu cukrów z wytworzeniem kw. mlekowego.

Praktyczne zastosowanie kw. mlekowego

• Produkty: Fermentowane napoje mleczne i sery Bakterie: Streptococcus (S. lactis, cremoris, thermophilus), Lactobacilus (acidofilus, wulgaricus)

• Fermentowane produkty roślinne różne gat paciorkowców i pałeczek w tym Leuconostac meresentoides, Lactobacilus; brewis, fermentum i Pegicocus cerevisiae

• Fermentowane produkty mięsn Lactobacilus, Micrococus, Pegicocus, Streptococus

• Kwas mlekowy Lactobacilus vulgaris

• Dekstryny Leuconostac mesenteroides

• Lizyna Streptococus lactis

• Preparaty lecznicze Lactobacilus acidofilus (bifidus)

Bakterie przetrwalnikujące

Większość bakterii przetrwalnikujących bytuje w środowisku naturalnym jako org saprotroficzne, wśród bakterii przetrwalnikujących występują laseczki tlenowe z rodzaju bacillus oraz beztlenowe z rodzaju Clostridium. Są tu gatunki mezofilne jak i termofilne, są to bakterie gram +. Ustaloną pozycję biotechnologiczną mają laseczki z rodz Bacillus.

Ważniejsze produkty metabolizmu wytworzone przez bakterie z rodzaju Bacillus

*Produkt: antybiotyki Bakterie Zastosowanie produktów

• bacytracyna Bacillus subtilis, liheniformis przeciwko G(+) i G(-)

• butyrozyna Bacillus circulans przeciwko G(+) i G(-)

• granitydyna Bacillus brevis przeciwko G(+)

• polimyksyna Bacillus polymyksa przeciwko G(-)

*Produkt: enzymy Bakterie Zastosowanie produktów

• Acylaza penicylinowa Bacillus megaterium, liheniformis Produkcja kw. 6 aminopelicynawego

• alfaamylaza Bacilus subtilis, liheniformis, megatherium, polimyksa Hydroliza skrobi

• betaamylaza Bacilus species Hydroliza skrobi

• izoamylaza Bacilus cereus Hydroliza skrobi

• betagalaktozydaza Bacilus species Hydroliza laktozy

• Alfa glukanaza Bacilus liheniformis Hydroliza polisacharydów

• Beta glukanaza Bacilus circulas i subtilis Hydroliza polisacharydów gł. beta glukanów

• izoamylazaglukozowa Bacilus coagulas Konwersja glukozy do fruktozy

• penicylinaza Bacilus cereus i liheniformis Inaktrywacja penicyliny

• Proteazy alkaliczne i neutralne Bacilus liheniformis i subtilis Detergenty i fermentacja

• pullulanazy Bacilus cereus i acidopuliliticus Hydroliza amylopektyny

• termolizyna Bacilus protolitycus Produkcja aspartanu

*Produkt: bioinsektycydy Bakterie Zastosowanie produktów

• endotoksyna Bacilus turingensis Ochrona roślin

Grzyby strzępkowe

Gromada grzybów obejmuje bardzo zróżnicowaną grupę organizmów jedno i wielokomórkowych, które łączą ze sobą 2 cechy:

- wszystkie należą do Eucaryota

- są organizmami cudzożywnymi - heterotrofami

Wspólnie z bakteriami uczestniczą w degradacji materii organicznej i obiegu pierwiastków w przyrodzie.

Występują powszechnie w różnych środowiskach (glebie, wodzie, szczątkach roślin, zwierząt a nawet na materiałach syntetycznych, mogą rozwijać się w szerokim zakresie temp.od poniżej O° C do ok. 60°C zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych, w przedziale pH od 2 do 8,5 przy czym większość korzystne warunki rozwoju znajduje w środowisku kwaśnym.

Wiele grzybów współżyje z roślinami ale również spotyka się gatunki patogenne.

Jeden z najprostszych podziałów grzybów uwzględnia ich rozmiary, mogą być grzyby makro i mikroskopowe.

Główne znaczenie biotechnologiczne poza grzybami kapeluszowymi mają przed wszystkim wybrane gatunki grzybów mikroskopowych. Tradycyjnie dzieli się je na drożdże i grzyby strzępkowe (nitkowate, mycelialne, pleśniowe). Podział ten nie jest precyzyjny, gdyż ten sam gatunek zależnie od warunków może rosnąc w postaci pojedynczych komórek lub rozgałęzionej grzybni.

U grzybów strzępkowych podczas rozmnażania wegetatywnego powstaje duża masa mikroskopijnej wielkości konidiów.

Niektóre grzyby mycelialne mogą też rozmnażać się wegetatywnie na drodze fragmentacji strzępek, natomiast drożdże przez pączkowanie lub podział poprzeczny komórek.

Pozyskiwanie i ulepszanie szczepów przemysłowych

Spośród drobnoustrojów dzikich wyst. W środowisku naturalnym można wyselekcjonować szczepy wyróżniające się przydatnością do określonych celów biotechnologicznych. Jednak prowadzenie wydajnego i ekonomicznego produkcyjnego wymaga najczęściej doskonalenia ich cech użytkowych. Klasycznym tego spodsobem jest wywoływanie trwałych mian genetycznych na drodze mutagenizacji, powodujących modyfikację metabolizmu, a w szczególności naruszenie określonych mechanizmów regulacyjnych

Pozyskiwanie drobnoustrojów

We wszystkich niszach ekologicznych środowiska naturalnego jak również przekształconego przez ludzi bytuje mikroflora., która może być izolowana do celów biotechnologicznych. Pozyskiwanie drobnoustrojów o pożądanych cechach obejmuje 4 zasadnicze etapy:

1) Wybór miejsca i pobranie próbek;

2) Wstępną ich obróbkę;

3) Namnażanie drobnoustrojów i selekcję czystych kultur wyprowadzonych z pojedynczych komórek;

4) Testowanie przydatności wyizolowanych szczepów do wytwarzania określonych produktów lub wywoływania pożądanych przemian;

Innym źródłem szczepów przydatnych w procesach biotechnologicznych są drobnoustroje przechowywane w kolekcjach placówek naukowych i niektórych zakładów przemysłowych lub dużych kolekcjach centralnych. Jest w nich przechowywana znikoma tylko część gatunków, szczepów i odmian wyst. w przyrodzie. Szacuje się ją zaledwie na ok.1% mikroflory bytującej w naturze. Poza tym długotrwałe utrzymywanie drobnoustrojów w warunkach prowadzi często do utraty wielu ich cech pierwotnie charakteryzujących. Najcenniejsze szczepy przemysłowe z kolekcji firmy biotechnologicznej są trudno dostępne dla innych potencjalnych użytkowników, można je jednak zakupić w ramach licencji technologicznych.

Zasady racjonalnego screeningu

Pojęcie screeningu drobnoustrojów lub produktów ich metabolizmu definiowane jest jako komplexowe postępowanie obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu:

1) wykrycie i izolację spośród dużej liczby możkliwych tylko tych drobnoustrojów, które są celem badań;

2) wstępną ocenę ich pzrydatności do danego procesu.

W celu dokonania oceny przydatności biotechnologicznej drobnoustrojów należy je po wyizolowaniu namnażać i testować w postaci czystych kultur. Osiąga się to przez takie rozproszenie ich komórek, by wyrosłe kolonie miały charakter monokultur.

Stosuje się w tym celu odpowiednie rozcieńczonych próbek, środki fizyczne i chemiczne (m.in. detergenty, sedymentację, filtrację, wirowanie, technikę aerozolową). Czasami przy izolowaniu drobnoustrojów ze środowisk niesprzyjających ich rozwojowi należy stosować zagęszczanie komórek. Jest to konieczne zwłaszcza podczas wydzielania mikroflory z wody lub powietrza.

W początkowym etapie screeningu mamy najczęściej do czynienia z nieznanym szczepem wytwarzającym nieznane substancje w małych stężeniach w nieznanych kombinacjach. Podstawowym zadanie w takim wypadku jest wykrycie metabolitów o potencjalnym znaczeniu praktycznym.

W nowoczesnym screeningu już na samym początku stosowane są preparatywne w analityczne metody chemiczne, które pozwalają na rozdział mieszanin związków i ich szybką, wstępną charakterystykę bez koniczności izolacji całkowicie czystych produktów.

Duże usługi w tym zakresie oddają metody ekstrakcji oraz chromatografii cienkowarstwowej (TLC) połączonej z różnymi testami barwnymi. Aby stworzyć sprzyjające biosyntezie warunki metaboliczne odmienne dla różnych gatunków, a nawet dla szczepów produkujących ten sam produkt, należy dokonywać stosownych zmian środowiska ich rozwoju. Dotyczy to zwłaszcza składu chemicznego podłoża.

Do podstawowych czynników należ w tym zakresie dobór rodzaju i stężenia źródła węgla i energii, źródła azotu, stężenie jonu fosforanowego, ciśnienie osmotyczne, pierwiastki śladowe, pH, temperatura, a także sposób hodowli (powierzchniowa czy wgłębna) i czas jej trwania.

Ulepszanie szczepów na drodze mutagenizacji

Drobnoustroje uzyskane za środowiska naturalnego prowadzą procesy biosyntezy, biotransformacji z wydajnością niewystarczającą zazwyczaj do opracowania ekonomicznego procesu technologicznego.

Dobierając warunki hodowli można częściowo zmieniać aktywność metaboliczną szczepów dzikich i uzyskiwać podwyższenie wydajności pożądanego produktu w granicach określonych genotypem.

Zasadnicze miny fizjologiczno-metaboliczne można uzyskać w wyniku modyfikacji genotypu drobnoustrojów. Jednym z podstawowych sposobów jakie są stosowane w tym zakresie jest mutagenizacja i selekcja mutantów o cech korzystnych dla danego procesu.

Wyselekcjonowane mutanty są poddawane dokładniejszej charakterystyce przy zastosowaniu zróżnicowanych warunków hodowli.

Dla najlepszego szczepu opracowane są następnie optymalne warunki procesowe. Pomimo kilkudziesięciu lat owocnego stosowania mutagenizacji do ulepszania szczepów przemysłowych nadal opiera się ona na pracochłonnej metodzie prób i błędów wymagającej testowania bardzo dużej liczby pojedynczych kultur.

Nie jest możliwe w pełni racjonalne postępowanie mutagenizacyjno-selekcyjne, bo nie da się ustalić jednorazowej korelacji pomiędzy miejscem i rodzajem wywołanej mutacji DNA, a typem otrzymanego mutanta i ostatecznych efektem fizjologicznym tej mutacji.

Chociaż nasza uwaga koncentruje się głownie na mutagenezie indukowanej czynnikami zewnętrznymi należy wspomnieć o mutacjach spontanicznych, które zachodzą z częstością mniejszą niż 10^-5. Oznacza to, że w czasie namnażania komórek błąd w strukturze DNA pojawia się rzadziej niż raz na 10⁵ podziałów materiału genetycznego.

Czynniki mutagenne:

kw. azotawy, iperyt gazowy, analogi zasad azotowych, zw. alkalizujące, barwniki akrydynowe, promieniowanie, prędkie neutrony

Czynniki te zwiększają częstość mutacji od kilku do kilkudziesięciu tysięcy razy.

Prominiowanie UV

Najbardziej bójcze i równocześnie mutagenne jest promieniowanie elektromagnetyczne o d fali 254 - 265 nm.(tzw. daleki zakres UV). Do ich emisji stosowane są lampy rtęciowe wytwarzające ponad 95% tego promieniowania.

Spośród innych czynników mutagennych wyróżnia się ono szeregiem korzystnych właściwości do których należą:

1) ogólna dostępność i łatwość użycia źródła promieniowania

2) łatwość dozowania jego dawek przez dobór mocy lampy, odległości od zawiesiny komórek i czasu działania

3) łatwość odtwarzania warunków mutagenizacji

4) b. wysoka częstotliwość powstawania mutacji w stosunku do efektu letalnego

5) możliwość uzyskania wszystkich typów mutantów

6) możliwość wywołania mutacji w rosnących kom. Wegetatywnych jak również kom. spoczynkowych, np. w sporze.

Te walory promieniowania UV sprawiają, że jest ono stosowane b. powszechnie i z dobrym skutkiem. W celu wykonania mutagenizacji przygotowuje się zawiesinę komórek w roztworze fizjol. Soli o gęstości 10⁵-10⁶ komórek w 1 ml. Ponieważ promienie UV nie wnikają głęboko do środowiska wodnego zatem wysokość warstwy komórek nie może przekraczać kilku mm. Zawiesina mieszana jest przy pomocy mieszadła magnetycznego. Źródło promieni UV, np. bakteriobójczą lampę o mocy 15W umieszcza się w odległości kilkudziesięciu cm nad zawiesiną. Mutagenizację prowadzi sie zazwyczaj przez kilka minut po czym wykonuje się posiewu na płytki w podłożem wzrostowym.

MNNG (N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna)

Szczególną cechą MNNG jest wywoływanie tzw. mutacji punktowych dotyczących pojedynczych genów oraz to, że środek ten działa max. efektywnie podczas procesu replikacji DNA. Wynikiem mutagenezy są często mutacje równoczesne skupione w 1 regionie DNA. MNNG może być zatem używana do kontrolowanego procesu mutagenezy w określonym regionie genomu.

Metody selekcji szczepów

Selekcję szczepów, zarówno wariantów naturalnych jak i mutantów przydatnych do celów technologicznych, można prowadzić w dwojaki sposób:

1) jednoetapowo - stosują testy screeningowe już podczas izolacji kolonii

2) dwuetapowo - testując wcześniej wyizolowane, czyste kultury

Jeżeli brak jest kryteriów bezpośredniej wstępnej oceny przydatności szczepów do procesu biotechnologicznego, wówczas losowo wybrane kolonie wyrosłe na płytkach Petriego poddaje się badaniom w próbach fermentacyjnych. Sposób ten jest jednak b. pracochłonny i mało wydajny. Dlatego też najczęściej dąży się do opracowania szybkich testów względnej oceny, umożliwiających uporządkowaną selekcję kultur, wyrastających na odpowiednim podłożu agarowym, charakteryzujących się korzystnymi właściwościami produkcyjnymi. W większości wypadków testy te opierają się na wykorzystaniu zjawiska dyfuzji pozakomórkowych produktów metabolizmu w podłożu agarowym i określeniu wielkości stref ich przenikania ujawnianych najczęściej przy użyciu odp. wskaźników, specyficznych wywoływaczy lub drobnoustrojów testowych.

Metoda płytkowa z użyciem wskaźników

Istnieje szereg testów umożliwiających przy użyciu odpowiednich modyfikatorów szybkie półilościowe różnicowanie koloni drobnoustrojów-wytwarzających lub przetwarzających wiele zw. chemicznych.

Wytwarzanie kw. organicznych lub amin można wykazać, stosując np. błękit bromofenolowy lub czerwień obojętną, które zmieniają barwę w określonych przedziałach pH. Wskażniki te stosowane są zarówno w testach z użyciem pożywek agarowych na płytkach Petriego jak i w testach probówkowych w podłożu ciekłym.

Szczepy syntetyzujące enzymy amylolityczne można różnicować na podłożu zawierającym skrobię. Po zalaniu płytki roztworem jodu wokół kolonii wytwarzających amylazę powstają strefy niewybarwione na kolor granatowy świadczące o rozłożeniu w tym miejscu skrobi przez wydzielone do podłoża pozakomórkowe enzymy amylolityczne.

Enzymy proteolityczne można wykrywać i oceniać w przybliżeniu ich syntezę na podstawie wielkości stref wywołanego przez nie rozpuszczenia kazeiny.

W podobny sposób można też oceniać aktywność celulolityczną drobnoustrojów obserwując powstające wokół ich koloni strefy rozpuszczenia celulozy barwionej czerwienią kongo.

Aktywność pektynolityczną na podstawie upłynnienia żelu pektynowego.

Wykrycie syntezy nukleaz DNA-zy i RNA-zy możliwe jest przez zastosowanie testów z kwasem solnym powodującym zmętnienie w miejscach zawierających niezhydrolizowany kwas nukleinowy oraz z oranżem akrydyny i obserwację w nadfiolecie fluorescencji w miejscach z nierozłożonym polimerem.

Stwierdzenie wytwarzania inhibitorów enzymów jest możliwe na podstawie powstania stref zahamowania przez nie reakcji w podłożu agarowym zawierającym określony enzym lub substrat na który on działa.

Metoda podwójnej hodowli na płytkach Petriego

Do selekcji szczepów produkujących antybiotyki, witaminy, czy aminokwasy stosuje się metodę w której testowane hodowle wyrosłe na jednym podłożu zalewa się warstwą innego zaszczepionego odpowiednio dobranym organizmem testowym. Wokół koloni wytwarzającej antybiotyki powstają strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego których wielkość zależy od ilości antybiotyku wydzielanego poza komórkę, jego dyfuzji w żelu agarozowym i od wrażliwości szczepu testowego na produkty biosyntezy.

Poszukując szczepów nadprodukujących aminokwasy lub witaminy stosuje się metodę auksanografii w której drobnoustrojami testowymi wysianymi do podłoża minimalnego są mutanty auksotroficzne(pokarmowe) wymagające do swojego rozwoju, wzrostu określonego czynnika. Strefy ich wzrostu wokół badanych kolonii świadczą o wytwarzaniu i pozakomórkowym wydzielaniu badanego metabolitu przez komórki drobnoustroju nadprodukujących.

Klasyczna metoda podwójnej hodowli jest nieprzydatna do selekcji szczepów wytwarzających produkty gromadzone wewnątrzkomórkowo. Ponadto nastręcza ona sporo trudności podczas izolowania czystych kultur którym z reguły towarzyszą komórki szczepu testowego. Z tego względu opracowano szereg modyfikacji tej metody. Do najprostszych należy oddzielenie podłoża z organizmem testowym od kolonii testowanych cienką folią celofanową.

Innym rozwiązaniem jest zastosowanie dwustronnych płytek z tworzywa syntetycznego przegrodzonych półprzepuszczalną membraną o śr porów. rzędu 0,2 µm. Z jednej strony na podłożu rosną testowane kolonie, z drugiej zaś szczep testowy. Membrana stanowi skuteczna przegrodę dla komórek drobnoustroju, umożliwia natomiast swobodną dyfuzję cząsteczek wytwarzanego metabolitu.

Metoda replik z testem auksanograficznym

Możliwe jest również zastosowanie techniki replik polegającej na przeniesieniu odcisku koloni z płytki wyjściowej na płytkę z jałowym podłożem przy pomocy welwetowego stempla. Kolonie wyrosłe na replice służą do testowania syntezy metabolitów, podczas gdy płytka wyjściowa pozostaje niezakażona do izolacji wyjściowych kolonii.

Metoda krążków agarowych

Z hodowli płytkowych wycina się sterylne krążki podłoża z testowanymi koloniami, inkubuje się je w warunkach dobrego nawilżenia powietrza, a następnie przenosi na płytki z podłożem zawierające drobnoustrój testowy. Po określonym czasie czasie hodowli tego organizmu mierzone są strefy zahamowania jego wzrostu. Wokół krążków z koloniami kultur wytwarzającymi antybiotyki lub wzrostu kolonii satelitarnych wokół krążków ze szczepami syntetyzującymi aminokwasy.

Nowe metody screeningu leków przeciw chorobom infekcyjnym

Nowa strategia poszukiwania leków przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybicznych i przeciw wirusowych obejmuje poszukiwanie antymetabolitów, inhibitorów enzymów, oraz inhibitorów syntezy białka, RNA i DNA. Po niepowodzeniach jakimi zakończyły się próby zastosowania klasycznych antybiotyków do leczenia infekcji wirusowych obecne wysiłki zmierzają w kierunku scriningu antybiotyków oraz inhibitorów enzymów wirusowych: heuramidazy i hialuronidazy. Leków przeciwbakteryjnych poszukuje się wśród inhibitorów syntezy ścian komórkowych bakterii np. hamujących aktywność D-D-karboksypeptydazy lub zakłucających wbudowywanie kwasu mezodiaminopimelinowego.

Nowoczesny scrining antybiotyków obejmuje również użycie dotychczas niestosowanych drobnoustrojów testowych a w szczególności szczepów superwrażliwych oraz o ograniczonej odporności na określone antybiotyki. Oporność drobnoustrojów na antybiotyki związana jest m.in. z syntezą enzymów które je inaktywują na drodze degradacji lub blokowania grup reaktywnych.

Trwające obecnie poszukiwania inhibitorów takich enzymów maja pierwszorzędne znaczenie medyczne. Dotychczas wykryto w ten sposób m.in. klawulonowy i inne inhibitory β-laktamaz enzymów odpowiedzialnych za destrukcję pierścienia β-laktamowego. W penicylinach i cefalosporynach.

Postępowanie związane z ich identyfikacją polega na zalewaniu prążków agarowych z wyrosłymi na nich badanymi szczepami drobnoustrojów agarem zawierającym β-latamazę. Po okresie niezbędnym do dyfuzji inhibitora i wystąpienia reakcji między enzymami i inhibitorem całość pokrywa się drugą warstwą agaru zawierającego substrat dla tego enzymu mający również charakter chromogenu (czyli induktora barwnegonp nitrocefina- półsyntetyczna cefalosporyna o barwie żółtej). Po dalszej inkubacji wokół koloni wytwarzającej inhibitory β-laktamaz pozostaje strefa niezmienionej barwy żółtej podczas gdy reszta płytki w wyniku enzymatycznej degradacji nitrocefiny zmienia barwę na czerwoną.

Przechowywanie szczepów

Jednym z podstawowych warunków prowadzenia wydajnych i powtarzalnych prac biotechnologicznych z użyciem drobnoustrojów jest zapewnienie czystości mikrobiologicznej i genetycznej szczepów produkcyjnych. Wymaga to takich sposobów ich przechowywania które przez dowolnie długi okres gwarantują zachowanie w możliwie najwyższym stopniu wszystkich ich cech biologicznych, technologicznych a zwłaszcza wydajności syntezy pożądanego produktu. Podstawową zasadą w tym zakresie jest maxymalne ograniczenie liczby posiewów, które stwarzają zagrożenie pojawienia się mutacji spontanicznych. Drugim warunkiem jest maxymalne a najlepiej całkowite zahamowanie procesów metabolicznych w przechowywanym materiale. Ważne kryterium: zachowanie możliwie jak najwyższej przeżywalności komórek. Dążąc do unifikacji metod przechowywania można wyróżnić zasady ogólne:

1) Dla drobnoustrojów zarodnikujących i przetrwalnikujących najbardziej korzystnymi do przechowywania formami są spory z 1-2 tygodniowej hodowli.

2) W odniesieniu do drobnoustrojów niewytwarzających spor lub trudnosporujących korzystnie jest przechowywać ich wegetatywne komórki pochodzące z fazy stacjonarnej.

Strzępki grzybów, promieniowców należy przedtem poddać mechanicznej fragmentacji np.w homogenizatorze nożowym.

3) Duże znaczenie- optymalizacja składu podłoża stosowanego do namnażania drobnoustrojów przed i po okresie przechowywania. Szczególnie podłoże użyte do uaktywnienia szczepu mogą w istotny sposób wpływać na ujawnienie się jego cech technologicznych.

4) Do namnażania drobnoustrojów przed ich przechowywaniem zaleca się podłoża minimalne umożliwiające niezbyt obfity wzrost wegetatywny. Celowe jest też stosowanie organicznych źródeł azotu w podwyższonym stężeniu co sprzyja sporulacji.

Spośród licznych sposobów przechowywania drobnoustrojów należy wyróżnić:

1) Pasażowanie - okresowe przeszczepianie na świeże podłoże, dotyczy to zarówno przechowywanych hodowli na skosach jak i podłożach ciekłych w temp. +4C lub pokojowej. Dopuszczalne jest też zalewanie hodowli warstwą jałowej parafiny uniemożliwiającej dostęp powietrza (zalecane dla grzybów).

2) Przechowywanie komórek w stanie wysuszenia - proces suszenia może przebiegać:

a) Pod ciśnieniem normalnym w temperaturze pokojowej

b) Pod zmniejszonym ciśnieniem i w obecności środka pochłaniającego H₂O np. P₂O₅

c) Na drodze sublimacji ze stanu zamrożenia- liofilizacja

3) Przechowywanie komórek w stanie zamrożenia w temp od -20 do -196C

4) Przechowywanie zawiesiny komórek w wodzie destylowanej w temp +4C po uprzednim ich obmyciu ze składników podłoża wzrostowego.

Produkcja szczepionek

O intensywnym rozwoju immunobiotechnologii zadecydowało zapotrzebowanie na różne preparaty immunobiologiczne stosowane w profilaktyce, diagnostyce i lecznictwie chorób zakaźnych i niezakaźnych. Podstawy rozwoju immunobiotechnologii stworzyły takie dziedziny nauki jak: immunologia, mikrobiologia, technologia i inżynieria genetyczna. Najczęściej stosowanymi preparatami immunobiologicznymi są szczepionki i substancje stosowane w diagnostyce, a rzadziej leki bakteryjne i bakteriofagi.

Szczepionki z zarazków żywych

Szczepionki żywe są preparatami immunoprofilaktycznymi będącymi dziedzicznie zmienianymi formami czynników chorobotwórczych bakterii Ricetsi i wirusów, szczepy mikroorganizmów szczepionek charakteryzują się szczątkowa zjadliwością, która jest niewystarczająca by spowodować chorobę. Mikroorganizmy te mogą rozmnażać się w zaszczepionym organizmie i powodować bezobjawową infekcję szczepionkową, w wyniku której organizm się uodparnia. Stosowane w charakterze szczepionek szczepy mikroorganizmów o zmniejszonej zjadliwości są nazywane atenuowanymi. Znalezienie atenuowanego szczepu mikroorganizmu jest I etapem produkcji szczepionek z zarazków żywych i polega ono na:

1) selekcji samoistnie powstalych szczepów o zmniejszonej zjadliwości. W ten sposób otrzymano m.in. szczepionki przeciw dżumie, brucelozie, tularemii i chorobie Heinego-Medina.

2) sztucznym otrzymywaniu atenuowanych szczepów zarazków przez różnorodne oddziaływanie na jego geny najczęściej następującymi metodami inzynierii genetycznej:

• długotrwała hodowla na sztucznych podłożach hodowlanych w niekorzystnych dla rozwoju warunkach;

• przeniesieniu zarazków na organizm innego rodzaju - wrażliwy lub niewrażliwy tj. inaczej: metoda adaptacji na nowego gospodarza.

Tą metoda otrzymuje się szczepionki przeciw ospie i wściekliźnie. Bezpośrednim działaniem fizycznym - mutagenem na bakterie lub wirusy - promieniowanie przenikliwe, nadfiolet, zw. chem.: 5-bromouracyl, kw. azotawy.

Możliwe również działanie odczynnikami działania biologicznego tj. surowice odpornościowe, antybiotyki.

3) sztucznym otrzymywaniu rekombinantów genetycznych o zmniejszonej patogenności. Metodą tą otrzymano szczepionkę przeciw grypie, w tym celu zrekombinowano niepatogenny wirus H2N2 i patogenny H3N2 i rekombinant zawierał hemoglutinine H3 i był niepatogenny.

Obecnie produkuje się szczepionki bakteryjne z ricestizowe szczepionki przeciw wąglikowi, szczepionka przeciw tularemii, szczepionka przeciw brucellozie, szczepionka BCG - przeciw gruźlicy, szczepionka kombinowana przeciw durowi plamistemu, szczepionka przeciw dżumie.

Szczepionki wirusowe z żywych mikroorganizmów:

Doustna szczepionka przeciw Heinego-Medina typu 1, 2, 3. Szczepionka przeciw odrze, śwince, donosowa szczepionka przeciw grypie, doustna przeciw grypie, przeciw wściekliźnie, skórna szczepionka przeciw ospie.

Szczepionki z całych mikroorganizmów zabitych

Zabite, zinaktywowane szczepionki z całych mikroorganizmów tzw. szczepionki korpuskularne, otrzymuje się inaktywując zarazki: bakterie, czy riketsje - do tego celu wykorzystuje się metody fizyczne tj. podwyższoną temperaturę, promieniowanie nadfioletowe; chemiczne tj. formaldehyd, fenol, aceton, alkohole, metale ciężkie lub inne metody nie zmieniające fizycznej struktury zarazków tzn. ich korpuskularnosci. W zależnosci od metody inaktywacji zarazków otrzymywane szczepionki otrzymują nazwy temperaturowe, formalinowe, acetonowe, alkoholowe, fenolowe itd. Do otrzymywania szczepionek zabitych wykorzystuje się silnie chorobotwórcze szczepy mikroorganizmów, pełnowartościowe ze względu na zjadliwość i budowę antygenową. W profilaktyce chorób zakaźnych stosuje się takie szczepionki z bakterii zabitych jak:

• Alkoholowa szczepionka VI (vi) - jest to szczepionka kompleksowa składająca się z bakterii duru brzusznego inaktywowanych alkoholem etylowym i antygenu VI Salmonella tyfi. Szczepionka przeciw krztuścowi ( czyli kokluszowi) są to bakterie krztuśca formy S zabite formalina lub metiolatem.

• Szczepionka przeciw leptospirozom.

• Szczepionka przeciw cholerze - jest mieszaniną zabitych termicznie lub formaliną przecinkowców biotyków Vibriocholere oraz przecinkowców Vibrioeltor typu serologicznych inaby i agaby.

Proces produkcji suchych szczepionek z całych mikroorganizmów składa się z:

1) wyselekcjonowaniu szczepu mikroorganizmów o odpowiednich właściwościach i orzymaniu z niego kultury matecznej

2) otrzymaniu natywnej mieszaniny mikroorganizmów czyli biomasy

3) inaktywacja zawiesiny mikroorganizmów

4) standaryzacja

5) liofilizacja

Szczepionki lecznicze

Oprócz szczepionek wykorzystywanych w profilaktyce znane są także szczepionki stosowane w praktyce klinicznej - są to tzw. szczepionki lecznicze i wykorzystuje się je w leczeniu chronicznych chorob infekcyjnych. Szczepionki te otrzymuje się oddzielnie z zabitych bakterii pobranych od danego pacjenta i stosowane są nastepujące szczepionki lecznicze:

• szczepionka gronkowcowa - jest to inaktywowana w temp. 56*C w 2h zawiesinach chorobotwórczych gronkowców pobranych od chorych z gronkowcowymi chorobami skory. W 1 ml zawiesiny fenolowej powinno być ok 2mld mikroorganizmów.

• szczepionka przeciw rzeżączce - jest to zawiesina dwoinek rzeżączkowych co najmniej 12 szczepów - są to świeżo wydzielone mikroorganizmy zabite termicznie.

• szczepionka przeciwczerwonkowa - będąca zawiesiną zabitych alkoholem etylowym bakterii czerwonki gatunku Soline i Fexnera.

• szczepionka przeciw brucellozie - jest to zawiesina zabitych termicznie pałeczek Brucella wywołujących brucelloze u owiec i krów - szczepionka wywołuje infekcyjno - alergiczną przebudowę organizmu.

• szczepionka tkankowa przeciw opryszczce - są to antyszczepionki w każdym przypadku przygotowywane z oddzielnie przygotowanych i z zabitych wirusów pobranych z chorego organizmu.

Szczepionki chemiczne (molekularne)

Produkuje się z antygenów molekularnych wydzielonych z mikroorganizmów. Do grupy szczepionek chemicznych nalezą też szczepionki otrzymane z rozpuszczalnych produktów komórek, np. z toksyn. Szczepionki chemiczne otrzymuje się w procesach syntezy biochemicznej i chemicznej. Dotychczas szczepionki te produkowano metodą biosyntezy jednakże badania ostatnich lat wykazały możliwość i celowość produkowania wielu z nich w procesach syntezy chemicznej. Szczepionki chemiczne ustępują szczepionkom żywym pod względem immunogenności. Z wielu powodów mają nad nimi przewagę, gdyż:

1) nie stwarzają komplikacji poszczepiennych, czyli nie są rakotwórcze, nie ulegają skażeniu przez mikroorganizmy, nie ma niebezpieczeństwa nawrotu choroby

2) są mniej odczynowe

3) są łatwe do sterylizacji

4) mogą być stosowane w preparatach łączonych, tzn. można w nich łączyć szczepionki skojarzone przeciw wielu chorobom

Otrzymywanie szczepionek chemicznych w procesach biosyntezy:

I etap - dobór mikroorganizmów, producenta biomasy. Wyizolowany szczep powinien mieć możliwie dużą wydajność produkowanego antygenu. Wybór mikroorganizmów musi uwzgledniać badania genetyczne, gdyż powinien on być pełnowartościowy genetycznie. W większości przypadków są to zjadliwe szczepy tworzące odporność specyficzną.

II etap - dobór podłoża hodowlanego - należy wziąć pod uwagę. Nie tylko stworzenie warunków do optymalnego przyrostu biomasy i max. wydajności wytworzonego antygenu lecz także pozbawienie go subst. balastowych, gdyż wypływają one na alergiczność i reakcyjność preparatu. Substancje balastowe utrudniaja ponadto wydzielenie i oczyszczenie właściwego produktu. Najwłaściwszymi podłożami hodowlanymi do produkcji szczepionek są podłoża zawierające tylko składniki syntetyczne i półsyntetyczne. Szczepionki produkuje się zazwyczaj w hodowlach wgłębnych prowadzonych w bioreaktorach o dużej pojemności. Po wyprodukowaniu biomasy:

III etap - wydzielenie i oczyszczenie antygenu - stosowane do tego celu metody powinny max. chronić początkową strukturę antygenową preparatu oraz zapewniaą odpowiednio wysoki stopień czystosci preparatu i odpowiednie stężenie antygenu. Obrana metoda wydzielania i oczyszczania powinna być możliwa do realizacji nie tylko w warunkach labolatoryjnych, lecz także w warunkach przemysłowych. Antygeny z biomasy wydziela się najczęściej przez ekstrakcję. W poszczególnych przypadkach stosuje się ekstrakcję całych mikroorganizmów lub ekstrakcję z mikroorganizmów poddanych lizie. Lizę można przeprowadzać enzymatycznie, takimi enzymami jak deoksyrybonukleaza, pankreatynaza, przez powolne zamrażanie i szybkie rozmrażanie, za pomocą fal dzwiękowych lub innego rodzaju oddziaływania mechanicznego. Chemicznie z wykorzystaniem ługów lub innymi metodami.

Metody oczyszczania antygenów zalezą od ich właściwości. Może to być m.in. izoelektryczne osadzanie kwasami lub ługami, upalanie obojętnymi solami, wytrącanie alkoholem etylowym, sorpcja, eluowanie, ultrafiltracja i chromatografia.

Anatoksyny - szczepionki skojarzone:

Anatoksyny są preparatami otrzymywanymi z bakteryjnych egzotoksyn, całkowicie pozbawionych toksycznosci, ale majacych właściwości antygenowe i immunogenne. Metodę wydzielania anatoksyn opracował francuz Ramon. I etapem otrzymania anatoksyn jest hodowla bakterii chorobotwórczych, zarazków błonnicy, tężca, jadu kiełbasianego oraz gronkowców, przecinkowców cholery i innych. Mikroorganizmy hoduje się na podłożach ciekłych, a nagromadzone w procesie toksyny oddziela się od plynu hodowlanego przez filtrację i odrzuca. Preparat stosowany do uodporniania czynnego powinien zawierać toksyny o niezmienionej strukturze i budowie chemicznej będący nośnikiem informacji określającej specyficzność syntezy antytoksyn w szczepionym organizmie, dlatego bardzo ważnym problemem jest dobór właściwej metody odtoksyczniania. Ramon zastosował w charakterze czynnika odtoksyczniającego formaldehyd. Obecnie do tego celu stosuje się też utlenianie lub barwniki tiazolowe i ftaleinowe: nadtlenek wodoru, kw. askorbinowy itp.

Anatoksyny stosowane obecnie w charakterze szczepionek pojedynczych i zespołowych.

Szczepionki zespołowe

Szczepionki składające się z jednorodnych antygenów, tylko z anatoksyn lub tylko z baldecyjnych antygenów. Preparaty zawierające kilka odmiennych antygenów są nazywane szczepionkami skojarzonymi. Przykładem szczepionek skojarzonych jest VITEPEL - bakterie, kuliste, zabite metiolatem i anatoksyny błonnicze i tężcowe. Anatoksyny stosowane obecnie w charakterze szczepionek pojedynczych i zespołowych:

- zaadsorbowana anatoksyna błonnicza

- zaadsorbowana anatoksyna tężcowa

- zaadsorbowana anatoksyna błonniczo-tężcowa

- zaadsorbowana anatoksyna gronkowcowa

- zaadsorbowana anatoksyna jadu kiełbasianego

- zaadsorbowana anatoksyna z egzotoksyn zarazków beztlenowej infekcji przyrannej.

Do dezintegracji mikroorganizmów stosowane są metody wykorzystujące działanie hydrauliczne, mechaniczne i ultradźwięki. Rybosomy wydzielano i oczyszczano ultrawirowanie, wypalanie siarczanem amonu, za pomocą detergentów i poliglikolu etylenowego. Rybosomy bakteryjne nie sa toksyczne dla zwierząt i mało toksyczne dla ludzi. Szczepionki rybosomowe mają wiekszą immunogennośćniż szczepionki mikroorganizmow całych, mogą też dawać odporność krzyżową z różnymi typami i grupami serologicznymi danego gatunku co można zaliczyć do zalet szczepionek rybosomowych. Mechanizm działania szczepionek rybosomowych nie jest jeszcze dokładnie poznany. Zdaniem autorów książki o działaniu ochronnym szczepionek rybosomowych decyduje bakteryjny RNA, który jest reprodukowany w mikroorganizmach za pomocą odwortnej transkryptazy. Inną hipotezą o działaniu szczepionek rybosomowych sformuowano na podstawie badań szczepionki Salmonella tifiniurium (?). Zgodnie z tą hipotezą głównym czynnikiem immunogennym jest specjalnego rodzaju białko rybosomalne 30S; istanieje też 3 hipoteza zgodnie z którą w preparatach rybosomowych często znajdują się antygeny ściany komórkowej bakterii, wielocukry, białka i inne. Można więc przypuszczać, że immunogenne działanie pochodzi od tych właśnie składników. W praktyce klinicznej stosuje się obecnie tylko jedną opracowaną we Francji szczepionkę rybosomową, jest to szczepionka zawierająca rybosomy czterech zarazków zapalenia płuc (Sthreptococcus pneumoniae, Hemofilus influense, Uepsiella pneumoniae, Sthreptococcus pirogenes).

Podjednostkowe szczepionki wirusowe

Stosowane w profilaktyce żywe i inaktywowane szczepionki wirusowe w wiekszości przypadków zapewniają właściwą ochronę organizmów przed zachorowaniem. Nie są one jednak pozbawione wad. W wielu przypadkach są przyczyną powikłań poszczepiennych, alergii, zaburzeń pracy organizmów itp. Z tego powodu prowadzi się pracę nad udoskonaleniem szczepionek wirusowych. Bada się całkowicie nowe szczepionki z poszczególnych strukur wirionów, są to tzw. szczepionki białkowe chemiczne, cząsteczkowe, podjednostkowe lub rozszczepione. W procesie tworzenia odporności przez wirusy najważniejszymi antygenami są brzegowe białka wirionów. Najlepszym modelem na którym się można wzorować w budowie szczepionek podjednostkowych są tzw. wirusy grypy, paramikrowirusy i rhabdowirusy. Typowym przykladem choroby przeciw której szczepi się różnego rodzaju szczepionkami jest grypa, w zapobieganiu grypie stosuje się obecnie kilka typów inaktywowanych szczepionek czystych- z całkowicie rozbitych wirionów i szczepionki subwirionowe , podjednostkowe o najwyższym stopniu oczyszczenia z substancji balastowych. Proces technologiczny opisywanych szczepionek składa się z następujących etapów:

1) rozmnożenie wirusów przez zarażenie omoczni zarodka kurzego;

2) oczyszczenie wirusów w separatorze talerzowym lub w kolumnach wypełnionych żywicami syntetycznymi;

3) mikrofiltracja;

4) zatężanie przez filtrację ok. 50 razy;

5) dodatkowe oczyszczanie przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy;

6) rozszczepienie koncentratów wirionów za pomocą detergentów kationowych;

7) wydzielanie glikoprotein wirusów przez ultrawirowanie lub ultrafiltrację;

8) dializa;

9) sterylizacja filtracyjna koncentratu podjednostki;

10) standaryzacja koncentratu podjednostki;

11) kontrola jakości preparatu

Szczepionki produkowane metodami inżynierii genetycznej

Intensywny rozwój inżynierii genetycznej i inżynierii komórek umożliwił w latach 70-tych XX wieku produkowanie szczepionek przeciw wirusom za pomocą zupełnie nowych technologii. Konieczność podjęcia produkcji szczepionek metodami inżynierii genetycznej wynikała po pierwsze z niedostatku naturalnych źródeł surowców, a po drugie z niemożliwości rozmnażania wirusów w obiektach klasycznych, kulturach tkankowych, zarodkach kurzych i wrażliwych zwierzętach. Produkcja szczepionek metodami inżynierii genetycznej polegała na wydzielaniu naturalnych genów, antygenów lub ich aktywnych fragmentów; wbudowanie tych genów w proste obiekty biologiczne (bakterie, drożdże), a następnie otrzymaniu potrzebnego produktu w hodowli obiektu biologicznego - producenta antygenu. Genomy wirusów są znacznie mniejsze niż genomy komórki prokariotycznej lub eukariotycznej. Geny kodujące białka ochronne można bezpośrednio klonować w wirusach zawierających DNA, a w wirusach zawierających RNA po odwrotnej transkrypcji ich genomu. W początkowym okresie poszukiwań szczepionek metodami inżynierii genetycznej zajmowano się przede wszystkim klonowaniem genów wirusowych kodujących syntezę białek i niosących główne antygenowe determinanty. W wyniku rekombinacji szybko udało się uzyskać plazmidy bakteryjne niosące geny lub genomy wirusów zapalenia wątroby typu B, grypy i choroby Heinego-Medina. Kolejnym etapem było otrzymanie antygenu wirusowego. Było to zadanie trudne gdyż ekspresja genów wirusowych w układzie prokariotycznym nie udawała się. Z czasem udało się jednak dokonać ekspresji antygenów wirusowych. Jednym z najlepszych przykładów świadczących o celowości wykorzystania inżynierii genetycznej do produkcji szczepionek jest szczepionka przeciwko zapaleniu wątroby typu B. Nie znaleziono bowiem dotychczas kultur tkankowych i zwierząt, z których można by rozmnażać wirusy tej choroby. Nie można więc było reprodukować wirusów metodami tradycyjnymi, jednocześnie istniała ogromna potrzeba poszukiwania odpowiedniej szczepionki, gdyż zachorowania na zapalenie wątroby zajmowały jedno z pierwszych miejsc w patologii człowieka. Dzięki wykorzystaniu wektorów plazmidowych i fagowych genom wirusa zapalenia wątroby typu B klonuje się w komórkach E. coli. Wydzielony DNA jest jednoniciowy. Za pomocą DNA polimerazy lub odwrotnej transkryptazy wirusa mieloblastozy ptasiej otrzymuje się dwuniciową cząsteczkę kolistą. Następnie za pomocą endonukleazy EcoRJ przekształca się ją w cząsteczkę liniową i wbudowuje do wektora plazmidowego i fagowego. Bakterie zawierające zrekombinowane plazmidy produkują białka, które wraz z przeciwciałami specyficznie reagują z antygenami HBS. Pierwszą szczepionkę przeciwko zapaleniu wątroby typu B otrzymano metodami inżynierii genetycznej w USA w 1982 roku. Do otrzymania antygenu HBS wykorzystuje się także komórki eukariotyczne , przedewszystkim drożdże oraz komórki zwierzęce małp człekokształtnych i gryzoni. Robi się tak dlatego gdyż białka wirusów mogą być letalne dla bakterii oraz dlatego, że białka te ulegają lizie pod działaniem proteolitycznych enzymów mikroorg. Poszukuje się nowych kom. gospodarzy dla ekspresji genomu wirusowego, przedewszystkim komórki eukariotów, w których w sposób ukierunkowany można by syntetyzować specyficzne białka wirusowe. Prowadzi się intensywne prace nad otrzymywaniem metodami inżynierii genetycznej innych szczepionek. Dowiedziono, że tymi metodami można otrzymywać antygenowe białko wirusa grypy. Rozpoczęto także prace nad otrzymywaniem metodami inżynierii genetycznej antygenu wirusa opryszczki. Genom wirusa klonowano przy udziale wektorów plazmidowych w komórkach E. coli. Nowym kierunkiem w dziedzinie otrzymywania szczepionek wirusowych jest włączenie genów odpowiedzialnych za syntezę białek wirusowych do genomu wirusa szczepionki. W ten sposób otrzymuje się zrekombinowane wirusy uodporniające na kilka chorób. Wg tych zasad prowadzi się prace nad otrzymaniem szczepionki przeciwko AIDS. W Uniwersytecie Paryskim i Narodowym Instytucie Raka w USA otrzymano zrekombinowane wirusy HIV i szczepionki ospy. Gen kodujący białka wirusowego wbudowano w otoczkę genomu wirusa osłabionego. Otrzymane w ten sposób szczepionki były pierwszymi badaniami na ludziach szczepionymi przeciw AIDS.

Biotransformacja (biokonwersja egzogennych prekursorów)

- zdolność drobnoustrojów do enzymatycznych przekształceń ksenobiotyków do strukturalnie podobnych produktów, które nie wykazują zazwyczaj żadnej funkcji metabolicznej i są prowadzone pozakomórkowo.

- rocesy te nie dostarczają energii ani tez prekursorów do syntez komórkowych.

Reakcje biotransformacji przebiegają na zasadzie kometabolizmu lub koutleniania w sprzężeniu z podstawowymi przemianami komórkowymi. Jest to możliwe dzięki funkcjonowaniu enzymów o mało selektywnej specyficzności substratowej. Wymagają obecności typowego źródła węgla i energii.

Szeroka selekcja szczepów - Mutagenizacja

- zniesienie barier na drodze przenoszenia substratu i produktu reakcji przez błonę cytoplazm.

- umożliwienie wydzielania enzymu i innych składników reagujących układu do podłoża w celu przeprowadzenia procesu biotransformacji pozakom.

Biotransformacja związków steroidowych

Występujące w przyrodzie zw. są pochodnymi steranu, najpospolitszym występ. w organizmach zwierzęcych jest cholesterol .W lecznictwie naturalne hormony steroidowe zostały zastąpione przez półsyntetyczne analogii

- podstawowymi surowcami do produkcji leków steroidowych są:

Diosgenina - wyst w bulwach Discorea mexicana i Discorea composita oraz sterole roślinne wyst.w nasionach soi, bawełny w trzcinie cukrowej: stygmasterol.

Podstawowe reakcje biotransformacji zw. steroidowych obejmują przemiany:

- w obrębie układu pierścieniowego

- w łańcuchu bocznym

Reakcje mające znaczenie przemysłowe:

- produkcja leków steroidowych z fitosteroli wiąże się z oksydacyjną degradacją lub odszczepieniem łańcuchów bocznych

- drobnoustroje z rodzaju Nocardia, Streptomyces, Arthrobacter, Mycobacterium mogą prowadzić wielokierunkowe utlenianie steroli.

Procesy biotransformacji są:

- specyficzne w zakresie typu reakcji

- regiospecyficzne (wybiórczość miejsca reakcji w cząsteczce substratu)

- stereospecyficzne(z pośród 2 aktywnych form reakcji ulega tylko 1-enancjomer)

- wydajność konwersji substratu do produktu wynosi ok.70-90%

Przykłady reakcji wyst. w biotransformacji mikrobiologicznej:

• utleninie - epoksydacja, hydroksylacja odwodornienie ,utlenienie alkoholi do aldehydów i ketonów, oksydacyjna degradacja łańcuchów alkilowych, oksydacyjne rozszczepienie układów pierścieniowych, oksydacyjna deaminacja

• redukcja - redukcja kw. organicznych, aldehydów, ketonów, alkoholi, uwodornienie wiązania C=C

• hydroliza - hydroliza amidów, amin ,estrów, eterów, laktamów i laktonów

• izomeryzacja - przemieszczenie wiązania podwójnego, przemieszczenie grupy hydroksylowej lub innych ugrupowań,racemizacja transglikozylacja

• kondensacja - formowanie połączeń C-C lub wiązań z heteroatomami np. halogenacja, aminacja O- i N-acylacja estryfikacja, fosforylacja, glikozylacja, laktonizacja

• rozszczepienie wiązania C-C

- dekarboksylacja, dealkilacja,

- grzyb Curvularia lunata wytwarza stereospecyficzną 11-Bmonoksygenazę steroidową, co umożliwia proces bardziej selektywnej produkcji kortyzolu

- mechanizm reakcji hydroksylowania polega na wprowadzeniu jednego atomu tlenu cząsteczkowego do substratu przy udziale specyficznych oksygenaz i redukcji drugiego do H2O

16-α-hydroksylacja

9α-fluorokortyzol 9α-fluoro-16α-hydroksykortyzol (Streptomyces roseochromogens)

Redukcja grupy ketonowej w pozycji 17

Androsteno-3,17-dion testosteron (Sacharomyces uvarum, Sacharomyces cerevisiae, S.chevalieri)

Odwodornienie w pozycji Δ1 pierścienia A

Kortyzol prednizoton (Arthrobacter simpler, Bacillus lentus B. sphearicus, Myzobacterium, Nocardia, Pseudomonas)

- znaczenie przemysłowe mają te reakcje których powstają produkty zawierające gr. Ketonową w pozycji C-17 oraz gr. Karboksylową w pozycji C-20, a produkty z ugrupowaniem laktozowym w pierścieniu D

Degradacja łańcucha bocznego połączona z utlenieniem w układzie pierścieniowym

Surowiec steroidowy 9-α-hydroksyandrosteno-3,17-dion

androsteno-3,17-dion

(Arthrobacter simpler, Brevibacterium lipoliticum Corynebacterium spp, Mycobacterium spp, Nocardia spp)

11-α-hydroksylacja

Progesteron 11α-hydroksyprogesteron

Rhizopus nigricans Aspergillus ochraceus Cylindrocladium simplex. Była pierwszą wykorzystaną w skali przemysłowej reakcją

11-β-hydroksylacja

Korteksolon kortyzol (Curvularia lunata, Absidia orchidis Cunninghamella elegant)

To czy zajdzie w miejscu α czy β zależy od użytego substratu i szczepu

- Reakcja hydroksylowania progesteronu w pozycji 11α była pierwszą wykorzystaną w skali przemysłowej biotransformacją steroidową.

- można ją przeprowadzić przy udziale Ryzopus archizus, Aspergillus olivaceus,Culvularia lunata Streptomyces fradiae

Charakterystyka technologiczna biotransformacji steroidów:

- zjawisko pseudokrystalofermentacji(enzymatycznej transkuptalizacji)

- wyjściowy substrat steroidowy po rozdrobnieniu (mikronizacji) wprowadza się wprost do hodowli w postaci substancji krystalicznej lub w formie roztworu(rozpuszczalniki; aceton, etanol, metanol, glikol etylowy, propylenowy, N,N-dimetyloformamid, dimetylorulfotlenek )

Proces mikrobiologicznego otrzymywania pochodnych steroidowych przebiega w 2 stadiach:

1) namnożenie kom w obecności induktora enzymów

2) enzymatyczne przekształcenie cząsteczki substratu steroidowego

- w procesie jednoetapowym(dodanie substratu bezpośrednio do hodowli po zakończeniu fazy wzrosty)

- w procesie dwuetapowym(wydzielenie namnożonej biomasy z podłoża hodowlanego i przeniesieniu jej do podłoża zamiennego z odpowiednim substratem steroidowym)

Biotransformacja steroidów z użyciem unieruchomionych kom (wegetatywnych lub konidiów):

- możliwość wielokrotnego użycia złoża z kom

- opracowanie procesu ciągłego(złoże może być zasilane roztworem substratu steroidowego z odpowiednią szybkością jego przepływu)

Biotransformacja z użyciem kultur kom roślin:

- hodowla zawiesinowa(bioreaktory lub kolby wytrząsacze)

- użycie wyizolowanych enzymów

- wykorzystanie technik immobilizacji enzymów oraz kom

Reakcje uboczne towarzyszące tej przemianie:

1)odszczepienie łańcucha bocznego w pozycji 17

2)otwarcie pierścienia D

3)redukcja grupy ketonowej w pozycji C-20 do gr. hydroksylowej

4)niemal całkowita degradacja substratu

Utlenienie gr. 3B-hydroksylowej połączone z izomeryzacją układu Δ5 do Δ4

Prognenolon progesteron

Aspergillus spp, Streptomyces sp.

Regulacja procesu biotransformacji

Mechanizmy kontrolujące aktywnośc i syntezę odpowiednich enzymów

Indukcja aktywności enzymów:

- wzrost aktywności dehydrogenazy delta1 poprzez inkubację kom bakterii w obecności niektórych związków steroidowych(np.progesteronu)

- efekt indukcyjny zależy od rodzaju, stężenia rozdrobnienia, sposobu czasu wprowadzenia induktora do hodowli, a także od warunków natlenienia i rodzaju użytego rozpuszczalnika

Regulacja kataboliczna: represja, inhibicja i inaktywacja enzymów:

- represja enzymów uczestniczących reakcjach 11B- i 19-hydroksylowania u Pellicularia filamentosa w podłożu z glukozą

Inne czynniki kontrolujące reakcje biotransformacji zw. steroidowych:

- dostępnośc kofaktorów (NADH, NADPH w reakcjach hydroksylowania)

- transport związków steroidowych przez błonę cytoplazmatyczną (wymaga energii metabolicznej)

Przykładowe zastosowania reakcji biotransformacji:

- otrzymanie alkaloidów (winblastyny i winkrystynyz Catharanthus roseus)stosowanych w terapii nowotworowej. Koszt ich pozyskania z materiału roślinnego to 5tyś. $ za g, cena rynkowa 20tyś. $ za gram.

- wykorzystanie monoterpenów (olejków eterycznych) w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i spożywczym jako środki lecznicze lub aromatyzujące

- przekształcenie steroidów (progesteron lub cholesterol)jest bardzo ważne z punktu widzenia nowoczesnej medycyny i farmacji, pozwala zwiększyć zastosowanie i zapewnić bezpieczeństwo w powszechnie terapiach hormonalnych.

Biotransformacje związków mineralnych

Biogeochemia

Nauka zajmująca się rolą organizmów żywych w procesach obiegu pierwiastków w przyrodzie, ich przemieszczaniem, akumulacja, tworzeniem i rozkładem minerałów i skał.

Metody biotechnologicznego pozyskiwania pierwiastków:

1) techniki oparte na tzw. Wymywaniu pierwiastków i związków chemicznych.

2) Izolacja danego pierwiastka lub związku chemicznego z akumulowanego mikroorganizmu.

Metody wymywania pierwiastków:

I. Techniki laboratoryjne

• perkolaton - urządzenie służące do wymywania uwolnionych z minerałów związków chemicznych rozwijający się w płynie perkolacyjknym drobnoustrój produkuje metabolity, które przepływając przez surowiec powodują wymywanie związków chemicznych

• Technika tzw. hodowli wstrząsanych - polega na hodowli szczepów drobnoustrojów (autotrofy wytwarzające silne kwasy mineralne np. kwas siarkowy, azotowy) w płynnej pożywce z dodatkiem surowca np. rudy metalu. Hodowle prowadzi się na wytrząsarkach zwiększających napowietrzanie układu.

• Metoda zamkniętej kolby ekologicznej- w kolbie próżniowej prowadzi się hodowlę drobnoustrojów badanych pod względem zdolności wymywania pierwiastków z rud. Wymywanie pod ciśnieniem.

II. Techniki in situ

• Western nuklear corp. (Gas Hills w stanie Wyoming) - koncentracja uranu...........

Czynniki warunkujące efektywność wymywania pierwiastków:

- dostępność tanich źródeł wody (np. woda pochodząca z odwodnienia kopalni) , stosowanie obiegu zamkniętego wody.

- Odpowiedni skład rudy (obecność pierwiastków, które mogą być utleniane przez drobnoustroje np. Fe³⁺ Mn²⁺

- Obecność odpowiednich szczepów drobnoustrojów

- Dodawanie do płynów ekstrakcyjnych substancji chemicznych intensyfikujących proces wymywania

- Dostępność tanich odczynników chemicznych w celu izolacji pierwiastków z płynów ekstrakcyjnych

Mikrobiologiczne ługowanie:

- jest to metoda umożliwiająca wykorzystanie minerałów o niskiej zawartości pożądanego składnika (złoża ubogie z wyrobiska pokładów eksploatowanych metodami klasycznymi, hałdy materiałów odpadowych)

- 10-20% światowej produkcji miedzi otrzymywane jest w wyniku mikrobiologicznego ługowania ubogich rud i hałd.

- Drobnoustroje używane są do pozyskiwania uranu a także odzysku innych pierwiastków np. złota, srebra, cyny.

Zaleta metody:

- niewielka ingerencja w środowisko przyrodnicze

- niskie nakłady inwestycyjne i eksploatacyjne

- mała energochłonność

- wydajne wykorzystanie pokładów, możliwość wykorzystania rud ubogich i odpadowych

- wysoka sprawność wydzielania metali

- możliwość wykorzystania z przerobie różnych rud.

Wady:

- trudna wstępna ocena efektywności procesu

- trudności wynikające z występowania wód gruntowych

- brak kontroli warunków fizycznych, chemicznych, biologicznych w ługowanych pokładach, trudności w sterowaniu procesem

- trudności w utrzymywaniu właściwych warunków tlenowych

- w przypadku ługowania rud pokładów alkalicznych konieczne jest dodatkowe zakwaszenie

- wrażliwość czynnika biologicznego

- trudności uzyskiwania metali z rozcieńczonych roztworów

- względnie wolny przebieg procesu

Technologia ługowania minerałów charakteryzuje się:

- dużą masą przerabianego surowca (do 1 000 ton jednorazowo)

- zawartość związków zawierających pozyskiwany pierwiastek ejst niższa niż 1%

- minerały mają zmienny skład chemiczny, dużą zawartość związków balastowych i toksycznych dla drobnoustrojów

- ługowane pierwiastki występują w minerałach w postaci połączeń trudno rozpuszczalnych w H₂O

Bakterie siarkowe z rodzaju Thiobacillus:

- chemolitoautotrofy

- tlenowce, utleniaja siarczki i siarkę pierwiastkową do jonu siarczanowego lub utleniają jon żelazawy do jonu żelazowego

- CO₂ jest źródłem węgla w procesach syntez komórkowych

- Niektóre z bakterii siarkowych są miksotrofami (np. T. Intermedius) i jako źródło węgla i energii mogą też wykorzystywać związki organiczne prowadząc ich beztlenową degradację

Ekologiczna sukcesja środowiska

- charakterystyczne zjawisko dla procesów ługowania

- w mairę modyfikacji chemicznych i fizycznych warunków środowiska następuje rozwój kolejnych grup fizjologicznych, łączenie z organizmami heterotroficznymi

Rozwój typowych autotorfów

T. Delicatus, T. Rubellus zdobywają energię utleniając jon siarkowy:

S^2- + 2O₂ -> SO₄^2-

Zakwaszają środowisko, wykazują małą tolerancję w stosunku do jonu wodorowego oraz do jonów metali przechodzących w czasie utlenienia siarczków do roztworu.

Pojawiają się gatunki kwasolubne T. Thiooxidans, T. Ferrooxidans

Czerpią energię z utlenienia zredukowanych połączeń siarki lub siarki pierwiastkowej

2FeS₂ + 7O₂ + 2 H₂O -> Fe²⁺ + 4SO₄^2- + 4H⁺

2S^o + 3O₂ + H₂O -> 2SO₄^2- + 4H⁺

Przy silnym zakwaszeniu środowiska do żelazawy może być utleniany przez T. Ferrooxidans do jonu żelazowego, także przez inne bakterie z rodzaju Mettallogenium

4Fe²⁺ + O₂ + 4H⁺ -> 4Fe³⁺ + 2H₂O

Jon żelazowy jest towarzyszącym czynnikiem ługującym gdyż może utleniać jon siarczkowy do siarki pierwiastkowej.

S^- + Fe³⁺ -> Fe²⁺ + S^o

Ogólne równanie opisujące mikrobiologiczno-chemiczne ługowanie pirytu:

FeS₂ + 2Fe³⁺ +3O₂ + 2H₂O -> 3Fe²⁺ + 2SO₄^2- + 4H⁺

Zapis sumy reakcji zachodzących w procesie ługowania pirytu, uwzględniający regenerację jonu żelazowego:

4FeS₂ + 15O₂ + 2H₂O -> 2Fe₂(SO₄)₃ + 2H₂SO₄

Bakteryjne wymywanie związków miedzi

miedź zawarta w minerałach nie jest bezpośrednio wykorzystywana przez drobnoustroje chemoautotroficzne

wymywanie miedzi i rud związana jest z reakcjami utlenienia towarzyszących związkom miedzi związków siarki i żelaza ( pirytu FeS₂ i chalkopirytu CuFeS₂)

T. Thiooxidans, T. Ferrooxidans katalizują reakcje utleniania:

2FeS₂ + 7O₂ + H₂O -> 2FeSO₄ + 2H₂SO₄

2FeS₂ + 7,5O₂ + H₂O -> Fe₂(SO₄)₃ + H₂SO₄

Powstające w tych reakcjach kwas siarkowy oraz siarczan żelazawy i żelazowy warunkują procesy wymywania miedzi.

Reakcje utleniania chalkozymu

Cu₂S + 2Fe₂(SO₄)₃ -> 2CuSO₄ + FeSO₄ + S

T. concretivorus katalizuje reakcje utleniania siarki elementarnej do kwasu siarkowego.

Wytrącanie miedzi polega na:

CuSO₄ + Fe²⁺ -> FeSO₄ + Cu²⁺

Siarczan miedziowy występuje w minerale zwanym chalkozytynem lub tworzy się z siarczków przy udziale bakterii Thiobacillus.

- Najczęściej stosowane jest technologia wymywania miedzi z hałd niskoprocentowych
- procesom wymywania miedzi towarzyszy proces jej wytracania.
W reakcji wytrącania miedzi z roztworu pierwiastek ten wymywany jest z żelazem i tworzy tzw. Cement miedziowy o zawartości miedz ponad16%.

Biogeochemia cynku
Minerały zawierające cynk:
sfaleryd ZnS
cynkit ZnO
snitsonit ZnCO₃
wilenit Zn₂(SiO₄)
heminorfit Zn₄(OH)₂(SiO₇)*H₂O
T. ferrooxidans uczestniczy w procesach wymywania cynku z minerałów:
- katalizuje reakcje utleniania siarczku żelaza do siarczanu żelazowego ,który reaguje z siearczkiem cynku: ZnS+2Fe₂(SO₄)₃+O₂ ->ZnSO₄+4FeSO₄+2H₂SO₄
Jony żelaza powstające w tej reakcji są ponownie utleniane, kwas siarkowy ułatwia wymywanie cynku oraz zakwasza środowisko stwarzając odpowiedni odczyn podłoża do wzrostu T. ferrooxidans
Biogeochemia uranu
- W litosferze występuje 0,004% uranu
- największe jego złoża występują w republice Konga oraz Great Bear i Elliott Lake w Kanadzie
- naturalny uran stanowi mieszaninę długożyciowych izotopów : ²³²U oraz ²³⁵U i ²³⁴U
- izotopy ²³⁵U i sztucznie otrzymany ²³³U stanowią materiał rozszczepiany w reaktorach jądrowych oraz bombach jądrowych
Najważniejsze minerały zawierające Uran
Uraninit UO₂
Gummit UO₃*nH₂O
Bekerelit 2UO₃*3H₂O
Kofinit U(SiO₄)_1-x(OH)_4x - niepodatny na wymywanie
Torbenit CuO*2UO_3*P₂O₅*8H₂O
Karnotyt K₂O*2UO₃*V₂O₅*3H₂O
- Uran występuję najczęściej w postaci kationu IV-wartościowego w silnie zredukowanym środowisku
- w postaci utlenionej uran jest łatwo wymywany przez kwasy
- stosowane oksydanty w procesach rozpuszczania uranu: jon żelazowy, chloran sodu, kwas nadchlorowy, nadmanganian potasu, dwutlenek manganu.
Mikrobiologiczne ługowanie uranu
czynnikiem ługującym jest siarczan żelazowy powstający z pirytów(T.ferrooxidas) lub dodawany do cieczy ługującej. Redukcji jonu żelazowego do jonu żelazawego towarzyszy przekształcenie IV-wartościowego Uranu w nierozpuszczalnych tlenkach uranu do VI-wartościowego w rozpuszczalnym siarczanie uranylu: UO₂+Fe(SO₄)₂->UO₂SO₄+FeSO₄
Jon Fe²⁺ jest ponownie utleniany do Fe³⁺ przy udziale T. Ferrooxidas.

Warunki normalne ługowania Uralu:
- pH=1,5-3,5
- temp=37^oC
- stężenie CO₂ w powietrzu zredukowane do 0,2%
- dobre natlenienie środowiska
Inne drobnoustroje uczestniczące w procesie ługowania minerałów:
- gatunki termofilne podobne do bakterii z rodzaju Thiobacillus
- bakterie Miksotroficzne: heterotroficzne rodzajów: Gallionelia, Leptospiryllium, Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter.
Ługowanie konkretnego złoża wymaga mikroflory charakteryzującej się określonymi przystosowaniami środowiskowymi łącznie z opornością na składniki toksyczne.
Zjawiska biologiczne i fizykochemiczne zachodzące podczas procesu ługowania:

1) w wyniku rozwoju bakterii w cieczy ługującej następuje silne zakwaszenie środowiska, wzrost temp oraz potencjału oksydo-redukcyjnego.
2) wytwarzane prze drobnoustroje substancje powierzchniowo-czynne umożliwiają lepsze zwilżanie powierzchni materiałów i ułatwiają przenikanie reaktantów, natomiast kwasy organiczne i związki chelatujące tworząc sole i kompleksy z metalami przeprowadzają je z formy nierozpuszczalnej w rozpuszczalną.
3) w wyniku reakcji chemicznych i elektrochemicznych usuwane są pasywnie warstwy powierzchniowe minerałów.
4) enzymy i kofaktory, wydzielane przez drobnoustroje, mogą adsorbować się na powierzchni minerałów powodując tam przekształcenia biochemiczne
5) drobnoustroje sprzyjają dysocjacji siarczków na powierzchni minerałów MeS<->Me²⁺+S^2-
Mechanizmy ługowania minerałów
1) pośredni udział bakterii z rodzaju thiobacillus-utlenianie nierozpuszczalnych siarczków jest procesem fizykochemicznym i przebiega przy udziale jonu żelazowego, który jest regenerowany w układzie zamkniętym przy udziale T ferrooxidas
2) bezpośredni udział bakterii z rodzaju Thiobacillus-bakterie uczestniczą bezpośrednio w utlenianiu siarczków do SO₄^2-
Procesy techniczne
1) ługowanie hałd
- najstarsza technika
- płyn ługujący jest pompowany na hałdę i spłyca grawitacyjnie
- płyn z ługowania jest gromadzony i poddawany ekstrakcji w celu uzyskania pożądanych metali
- rafinat jest zawracany do usypiska, przechodzi przez tzw. zbiornik natleniający w który następuje regeneracja płynu

2) ługowanie stert-przebiega w specjalnych basenach betonowych(poj. Do 12 ton)
- system odprowadzania płynu ługującego
- odzyskiwanie metali, natlenianie płynu ługującego podobnie jak w technice ługowania hałd
3) ługowanie in situ
- prowadzone jest w starych, zamkniętych kopalniach
- system chodników i tuneli jest zraszany płynem ługującym
- płyn gromadzony jest na najniższej kondygnacji, skąd jest wypompowywany na powierzchnie i poddawany dalszemu przerobowi.

1

---