Elektroporacja polega na wykorzystaniu zjawiska transportu makromolekuł do wnętrza komórki, dzięki pojawieniu się przejściowych porów w błonie komórkowej, powstałych na skutek działania prądu elektrycznego. W ciągłej strukturze błony lipidowej pod wpływem silnego pola elektrycznego powstaje hydrofilowy elektropor.

Elektroporacja jest wykorzystywana do transformacji komórek bakterii, grzybów, roślin oraz zwierząt.

W przypadku roślin, których komórki otoczone są ścianą komórkową proces transformacji przeprowadza się na protoplastach.

Molekuły zawarte w zawiesinie wchodzą do wnętrza komórek za pomocą dwóch mechanizmów: elektroosmozy i dyfuzji.

Pod wpływem krótkiego impulsu elektrycznego w błonie komórkowej powstają pory. Ich wielkość wynosi od 1 do 10nm.

Powstawanie porów w błonie:

Przyczyny powstawania porów do dziś nie zostały ostatecznie wyjaśnione. Przemieszczające się pod wpływem pola elektrycznego jony z roztworu wywierają nacisk na błony (ciśnienie mechaniczne) wywołują tworzenie się porów. Nie wiadomo jednak jakie zmiany w lipidach są indukowane przez ciśnienie mechaniczne.

Oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy polem elektrycznym a cząsteczkami lipidów powodują zmianę położenia poszczególnych molekuł i zmianę odległości pomiędzy nimi. Powstałe w tych miejscach nieregularności ułatwiają wnikanie do wnętrza cząsteczek wody co pociąga reorientacje lipidów ułatwiającą tworzenie hydrofilowych porów.

Siła pola elektrycznego (V/cm) - najważniejszy czynnik decydujący o przeżywalności komórek.

Błona komórkowa jest spolaryzowana:

• wewnątrz - ładunek ujemny

• na zewnątrz - ładunek dodatni

Jeżeli siła pole elektrycznego przewyższy próg graniczny w komórce zajdą odwracalne zmiany prowadzące m.in. do powstania porów - tzw. napięcie przenikania.

Dalszy wzrost napięcia i przekroczenie punktu krytycznego/letalnego wywoła nieodwracalne zmiany prowadzące do nekrozy lub apoptozy komórki (utrata makro, plazmidów).

Wartości napięcia przenikania oraz punktu krytycznego zależą od:

• gatunku, rodzaju i szczepu

• średnicy komórki

• temperatury

Dodatkowo należy wziąć pod uwagę grubość szczeliny w kuwecie do elektroporacji.

Generalna zasada jest taka że im mniejsza jest średnica komórki tym większa musi być siła pola elektrycznego.

Zakres siły pola elektrycznego 12,5 - 15 kV/cm

Długość impulsu elektrycznego:

• zależy od średnicy komórki - im większa komórka tym dłuższy czas impulsu

• zależy od temperatury - w temperaturze pokojowej - 40-100 µs, w temperaturze 4 st.C 15-40 µs.

Wskazane jest by stosować jak najmniejsza liczbę impulsów - jeden impuls może spowodować wzrost temperatury w komórkach od 15-25 st.C!

Za wzrostem liczby impulsów maleje przeżywalność komórek, natomiast efektywność transformacji pozostaje stała.

Zazwyczaj stężenie DNA wynosi 10 pg/ml. Zbyt duże stężenie DNA może doprowadzić do przyjęcia przez komórkę więcej niż jednej cząsteczki DNA.

W przypadku niektórych komórek elektroporacja nie działa lub jej wydajność jest na bardzo niskim poziomie.

Odpowiednie medium np. medium dla kom. roślinnych wymaga sacharozy (stabilizacja protoplastów).

Na przeżywalność kom. wpływa skład pożywki na którą zostaną wysiane po elektroporacji.

Do elektroporacji stosujemy kom. zamrożone (z glicerolem) lub świeże (zależy od gatunku).

Wydajność transformacji może być zmniejszona przez wewnętrzne i zewnętrzne bariery komórek np. zaburzona replikacja plazmidu czy ekspresja genu. W przypadku bakterii istotną barierę stanowi ściana komórkowa - transformacja bakterii Gram-ujemnych jest wydajniejsza.

Zastosowanie:

• Elektrochemioterapia (ECT): wprowadzenie cytotoksyn do komórek nowotworowych.

• Elektrogenoterapia (EGT): wprowadzenie do komórek DNA, RNA.

• Terapia fotodynamiczna wspomagana elektroporacją

• Elektroporacja w kosmetologii: wprowadzenie substancji do głębokich warstw skóry

• Nieodwracalna elektroporacja (IRE)

---