PODSTAWY GENETYKI DROBNOUSTROJÓW METABOLIZM BAKTERII

dr n. med. Roman Franiczek

AKADEMIA MEDYCZNA

WE WROCŁAWIU

KATEDRA I ZAKŁAD MIKROBIOLOGII

ELEMENTYGENETYKI DROBNOUSTROJÓW

GENOM BAKTERYJNY

A) Nukleoid (genofor, chromosom)

B) Plazmidy

C) Profagi (np. Mu)

D) Genetyczne elementy translokacyjne:

- sekwencje insercyjne - IS

- transpozony - Tn,

- integrony

PLAZMIDY - pozachromosomalne czynniki genetyczne

• Autonomiczne replikony, posiadają własny układ replikacji, niezależny od chromosomu

• Niektóre nich (tzw. EPISOMY np. czynnik F) mają zdolność rekombinacji z genomem bakteryjnym stając się jego integralną częścią

  PODZIAŁ ZE WZGLĘDU NA WIELKOŚĆ:

  - plazmidy małe (poniżej 25 tys. par zasad);

- plazmidy duże (powyżej 25 tys. par zasad

PODZIAŁ PLAZMIDÓW ZE WZGLĘDU NA ZDOLNOŚĆ DO AUTOTRANSFERU:

plazmidy koniugacyjne (1 - 3 kopii w komórce) np. plazmidy: R, F, Col B, Col V

plazmidy niekoniugacyjne (10 - 100 kopii w komórce) np. plazmidy Col E 1, Col E 2. Są na ogół małe plazmidy zakażające komórki bakteryjne na drodze mobilizacji, transformacji i / lub transdukcji

WŁAŚCIWOŚCI FENOTYPOWE WARUNKOWANE PRZEZ PLAZMIDY

·  plazmidy płciowe (czynnik F)

·  plazmidy lekooporności (plazmidy R)

·  plazmidy bakteriocynogenii (plazmidy Col)

·  plazmidy warunkujące właściwości metaboliczne (plazmid Hys)

· plazmidy warunkujące wirulencję (zjadliwość) bakterii (plazmidy Ent, Hly, CFA I/II)

·    plazmidy warunkujące syntezę antybiotyków;

·   plazmidy kryptyczne

WŁAŚCIWOŚCI FENOTYPOWE WARUNKOWANE PRZEZ PLAZMIDY

Genetyczne elementy translokacyjne

• SEKWENCJE INSERCYJNE (IS) - kodują integrazę warunkującą translokację między replikonami

• TRANSPOZONY (Tn) - zawierają na obu końcach IS, pomiędzy którymi zlokalizowany jest gen (geny) strukturalne warunkujące oporność na antybiotyki, sole metali ciężkich, czynniki wirulencji, właściwości kataboliczne. Transpozony mogą integrować się z różnymi replikonami obecnymi w komórce.

• INTEGRONY - sekwencje oflankowane IS zawierające tzw. kasetę genową, do której mogą włączać się geny strukturalne np. warunkujące lekooporność.

PLAZMIDY

STRUKTURA PLAZMIDU R

CZYNNIK F - episom

EPISOM

ZMIENNOŚĆ DROBNOUSTROJÓW

Zmienność mutacyjna

Zmienność rekombinacyjna:

- Transformacja

• Transdukcja

• Koniugacja

ZMIENNOŚĆ MUTACYJNA

• MUTACJE SPONTANICZNE - np. oporność na streptomycynę zachodzą z niską częstością (10-7 w przeliczeniu na populację bakterii)

• MUTACJE INDUKOWANE czynnikami mutagennymi zwiększającymi wielokrotnie częstość występowania mutacji (promieniowanie UV, kwas azotowy (III), hydroksyloamina - HA, 5-bromouracyl - BU, 2-aminopuryna - AP, etylosiarczan etylu - EES)

KLASYFIKACJA MUTACJI

1 MUTACJE GENOWE:

• tranzycje (pur/pur; pir/pir)

• transwersje(pur/pir; pir/pur)

• insercje - dodanie nukleotydu

• delecje - wypadnięcie nukleotydu

2 MUTACJE CHROMOSOMOWE:

• inwersje - odwrócenie kolejności nukleotydów

• duplikacje - podwojenie sekwencji nukleotydów

• delecje - wypadnięcie znacznych fragmentów chromosomu

• translokacje - przemieszczenie fragmentów DNA w obrębie chromosomu

TYPY MUTANTÓW BAKTERYJNYCH

Mutanty oporne na antybiotyki

- Staphylococcus aureus oporny na metycylinę MRSA

Mutanty fermentacyjne

- Lac+ → Lac- Gal+ → Gal-

Mutanty auksotroficzne

(wymagające do wzrostu czynnika wzrostowego)

   - aminokwasu (np. Pro-, Try-)

   - zasady organicznej (np. Ade-)

     - witaminy (np. Bio-)

Mutanty szorstkie (S →R)

- Streptococcus pneumoniae - utrata otoczki

- Enterobacteriaceae - utrata O-swoistych łańcuchów bocznych LPS-u

TRANSFORMACJA

Aktywne pobieranie fragmentów DNA przez komórki biorcy

TRANSFORMACJA

TRANSDUKCJA

Przenoszenie fragmentów DNA dawcy do komórki biorcy za pośrednictwem bakteriofagów

BAKTERIOFAGI

Fagi lityczne (zjadliwe, wirulentne) np. fagi serii T parzyste - w krótkim czasie po zakażeniu dochodzi do lizy zakażonych komórek bakteryjnych (bakteriofagoterapia, fagotypowanie)

Fagi lizogenne (łagodne, utemperowane) np. fag λ - wbudowują materiał genetyczny do genomu komórki gospodarza

konwersja lizogenna (Corynebacterium diphtheriae, Streptococcus pyogenes, EHEC np. O157:H7)

Fag T4

Replikacja faga litycznego Replikacja faga lizogennego

KONIUGACJA

PRZEKAZYWANIE MATERIAŁU GENETYCZNEGO Z KOMÓRKI DAWCY DO KOMÓRKI BIORCY - BEZPOŚREDNI KONTAKT FIZYCZNY

KONIUGACJA

KONIUGACJA Hfr

METABOLIZM

Całokształt przemian zachodzących w komórce, obejmujący setki przemian / reakcji biochemicznych. Składają się nań:

• ANABOLIZM (metabolizm biosyntetyczny) - reakcje syntezy prowadzące do wytworzenia prostych związków (cukry proste, aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe kwasy tłuszczowe) oraz ich polimerów (wielocukry, białka, kwasy nukleinowe, lipidy). Reakcje te wymagają nakładu energii (reakcje endoergiczne).

• KATABOLIZM (metabolizm energiotwórczy) - reakcje chemiczne doprowadzające do rozkładu związków organicznych, dostarczające energii (reakcje egzoergiczne) i prekursorów do biosyntezy materiału komórkowego.

ASYMILACJA PIERWIASTKÓW BIOGENNYCH

ŹRÓDŁO WĘGLA

A) Organiczne związki węgla (cukry, aminokwasy, alkohole) to związki bogate w energię, w których węgiel występuje w postaci zredukowanej.

B) Nieorganiczne (mineralne) związki węgla (CO2, H2CO3, CO32-) to związki utlenione, ubogie w energię, w których węgiel występuje na maksymalnym (+4) stopniu utlenienia.

AUTOTROFIZM

Redukcja nieorganicznych związków węgla do związków organicznych [ (CH2O)n]. Proces ten wymaga nakładu energii (proces endoergiczny). Organizmy (bakterie) autotroficzne wykorzystują do asymilacji CO2 zewnętrzne źródła energii:

- Fototrofy (fotoautotrofy) - wykorzystują do asymilacji CO2 energię świetlną w procesie fotosyntezy.

- Chemolitotrofy (chemolitoautotrofy) - do asymilacji CO2 wykorzystują energię chemiczną, zmagazynowaną w zredukowanych związkach nieorganicznych, uwalnianą w czasie ich utleniania (chemosynteza).

BAKTERIE AUTOTROFICZNE

FOTOAUTOTROFY :

bakterie zielone - Chlorobacteriaceae, Heliobacteriaceae,

bakterie purpurowe siarkowe - Chromatiaceae,

     bakterie siarkowe bezsiarkowe - Rhodospirillaceae,     

sinice (cyjanobakterie).

CHEMOLITOAUTOTROFY :

bakterie nitryfikacyjne:

      Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira (NH3 → NO2-),

Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospira (NO2- → NO3-),

bakterie siarkowe - (Thiobacillus, Thiospira, Thiothrix) utleniają zredukowane, nieorganiczne związki siarki (H2S, S2O32-, S4O62-, SO32-,
CNS-), jak również siarkę elementarną (S0),

bakterie żelazowe (żelaziste) - (Thiobacillus ferrooxidans) utleniają sole żelazawe do żelazowych (Fe2+ → Fe3+),

bakterie wodorowe - (Hydrogenomonas): H2 ↔ 2H ↔ 2H+

HETEROTROFIZM

Większość bakterii przyswaja organiczne (zredukowane) związki węgla. Wśród bakterii heterotroficznych wyróżnia się:

• PROTOTROFY - wymagają do wzrostu: soli mineralnych oraz tylko jednego związku organicznego (np. glukoza, a niekiedy jednowęglowy związek organiczny: metanol, mrówczan, metan).

• AUKSOTROFY - wymagają do wzrostu soli mineralnych, związku organicznego (źródło węgla i energii) oraz tzw. czynników wzrostowych (związków organicznych, których nie potrafią syntetyzować).

Przykłady bakterii auksotroficznych

• Salmonella typhi - tryptofan

• Proteus vulgaris - amid kwasu nikotynowego

• Haemophilus influenzae - hem

• Staphylococcus aureus - cystyna, adenina,

guanina, ksantyna, uracyl, tiamina, kwas nikotynowy

ŹRÓDŁA AZOTU

Azot atmosferyczny - N2 Układ enzymatyczny zdolny do redukcji N2 to kompleks nitrogenazy, składający się z dwóch białek: nitrogenazy, reduktazy nitrogenazowej

DROBNOUSTROJE ZDOLNE DO WIĄZANIA N2:

• tlenowe bakterie wolnożyjące: Azotobacter, Azomonas,

• beztlenowe bakterie wolnożyjące: Clostridium pasteurianum,
  C. butyricum, Desulfovibrio,

fotoautotrofy: Chlorobium, Rhodospirillum,

• chemolitotrofy: Thiobacillus ferrooxidans,

• symbionty roślin (symbioza z komórkami korzenia roślin motylkowych Fabaceae): Rhizobium, Frankia, Azospirillum,

sinice: Nostoc, Anabena, Gleocapsa.

INNE ŹRÓDŁA AZOTU

Ø   sole amonowe (NH4+)

Ø azotany (NO3-) - azot przed wbudowaniem w związki organiczne musi ulec redukcji do jonu amonowego

Ø   aminokwasy

ŹRÓDŁA SIARKI

Siarka, podobnie jak węgiel i azot występuje w biogennych związkach organicznych w postaci zredukowanej (grupa sulfhydrylowa = tiolowa −SH). Bakterie korzystają z następujących źródeł siarki:

Ø   siarczany (SO42-),

Ø    siarczyny (SO32-),

Ø     tiosiarczany (S2O32-),

Ø aminokwasy zawierające siarkę (metionina, cysteina, cystyna),

Ø     witaminy (biotyna).

Przed włączeniem do związków organicznych musi zostać zredukowana do S2- (proces endoergiczny).

ASYMILACJA INNYCH PIERWIASTKÓW

• ŹRÓDŁO FOSFORU - jon fosforanowy (PO43-); w takiej też postaci występuje w związkach organicznych (ATP, nukleotydy, kwasy nukleinowe).

• KATIONY METALI - sole mineralne, związki metaloorganiczne (hem - źródło żelaza dla Haemophilus influenzae).

• TLEN, WODÓR - woda, powietrze.

ODDYCHANIE - UTLENIANIE BIOLOGICZNE

Wieloetapowy proces egzoergiczny, w którym energia utlenianego substratu zostaje zmagazynowana w wysokoenergetycznych cząsteczkach ATP (adenozyno-5′-trifosforan). Energia wiązań ATP jest wykorzystywana przez organizm do przeprowadzania reakcji endoergicznych (synteza związków organicznych) lub przekształcana w energię cieplną, mechaniczną, świetlną, elektryczną.

Mechanizmy tworzenia ATP

FOSFORYLACJA SUBSTRATOWA :

- glikoliza

- cykl pentozowy

- fermentacje

FOSFORYLACJA OKSYDATYWNA :

- transport elektronów w łańcuchu oddechowym

MECHANIZMY UTLENIANIA BIOLOGICZNEGO

• ODDYCHANIE TLENOWE

• ODDYCHANIE BEZTLENOWE

• FERMENTACJA

ODDYCHANIE TLENOWE

¨ Ostatecznym akceptorem oderwanych od substratu elektronów jest tlen cząsteczkowy; elektrony oderwane od substratu oddechowego są przekazywane na przenośniki o wzrastającym potencjale oksydoredukcyjnym (łańcuch oddechowy). ATP powstaje w wyniku fosforylacji oksydatywnej.

NADH ↔ Fp ↔ Q ↔ cyt. b ↔ cyt. c ↔ cyt. f ↔ cyt. a1-a3 ↔ O2

ODDYCHANIE BEZTLENOWE

• Ostatecznym biorcą elektronów jest zewnątrzpochodny związek organiczny (fumaran) lub utleniony związek nieorganiczny (azotan, siarczan, węglan). ATP powstaje w wyniku fosforylacji oksydatywnej. Łańcuch oddechowy krótszy niż przy oddychaniu tlenowym. Proces ten jest bardziej wydajny niż fermentacja, mniej wydajny w porównaniu z oddychaniem tlenowym.

• Redukcja azotanów do azotynów, NO, N2O, N2 lub NH3. Gazowe produkty opuszczają środowisko (denitryfikacja) - zubożenia gleby w azot.

• Redukcja siarczanów do H2S.

• Redukcja węglanów lub CO2 do metanu (bakterie metanogenne)

FERMENTACJA

FERMENTACJA - część cząsteczki substratu jest utleniana, a część odbierająca elektrony - redukowana. Brak zewnętrznego akceptora elektronów; ATP powstaje w wyniku fosforylacji substratowej.

Fermentacje via glikoliza

• homofermentacja mlekowa - Lactobacillus lactis,
  L. delbrueckii

• fermentacja Enterobacteriaceae - pałeczki jelitowe

• fermentacja alkoholowa - Saccharomyces cerevisiae

• fermentacja masłowa - Clostridium butyricum

• fermentacja acetonowo-butanolowa - C. acetobutylicum

• fermentacja propionowa - Propionibacterium

Fermentacje bez glikolizy

• heterofermentacja mlekowa (via cykl pentozowy)

Lactobacillus brevis, Leuconostoc

• alkoholowa (via cykl pentozowy)

Zymomonas mobilis

• fermentacja Bifidobacterium (via szlak Entnera-Doudoroffa)

Bifidobacterium bifidum

Szlak Entnera-Doudoroffa
katabolizm glukozy

6-P-glukoza

¯

6-P-glukonian

¯

2-keto-3-deoksy-6-P glukonian (KDPG)

¯ ¯

Pirogronian - Aldehyd 3-P-glicerynowy

NIEWĘGLOWODANOWE SUBSTRATY ODDECHOWE

Związki jednowęglowe (C-1):

CH4 jest utleniany poprzez metanol, aldehyd mrówkowy i kwas mrówkowy do CO2

Związki dwuwęglowe (C-2):

  - octan → fosforylacja do acetylofosforanu → przekształcenie do acetylo-Co-A → cykl Krebsa

- etanol, aldehyd octowy → utlenienie do octanu - dalsze przemiany jak wyżej

- glioksalan (CHO-COOH) → utlenienie w cyklu glioksalowym lub cyklu kwasów dikarboksylowych.

Tłuszcze (triacyloglicerole):

Gliceryna - przekształcana w fosfodihydroksyaceton, który zostaje włączony do glikolizy.

Kwasy tłuszczowe - β-oksydacja → odrywanie od łańcucha alifatycznego reszt dwuwęglowych (octanowych) → przekształcenie ich w acetylo-Co-A → degradacja w cyklu Krebsa

Aminokwasy:

1) Sprzężona oksydoredukcja dwóch aminokwasów - reakcja Sticklanda:

np. alanina + 2 glicyna → 3 kwas octowy + 3 NH3 + CO2;

kwas octowy po przekształceniu w acetylo-Co-A jest metabolizowany w cyklu Krebsa.

2) Dezaminacja aminokwasów → intermediaty cyklu Krebsa.

Związki purynowe:

(kwas moczowy, ksantyna, guanina)

Wytwarzanie octanu, mrówczanu, amoniaku i CO2

---