22.05.2012r.

Laboratorium z Biochemii

Oksydoreduktazy

Prowadzący: dr inż. M. Krzepkowska

Proszę dopisać w każdym doświadczeniu podstawy oznaczeń oraz wzory reakcji chemicznych[Author ID1: at Wed May 30 22:12:00 2012 ]

Marta Wujek

Przemysław Woiński

1. Wstęp teoretyczny:

Enzymy są substancjami wytwarzanymi przez organizmy i odgrywającymi podstawową rolę jako katalizatory przemian chemicznych zachodzących zarówno wewnątrz organizmów, jak i po za nimi.

Enzymy można podzielić na 6 klas:

1. oksydoreduktazy - odpowiedzialne za przeniesienie wodoru lub elektronu z jednego substratu na inny,

2. transferazy - odpowiedzialne za przenoszenie grup funkcyjnych

3. hydrolazy - powodują hydrolityczne rozczepienie wiązań

4. liazy - rozczepiają wiązania w sposób niehydrolityczny

5. izomerazy - katalizują przemiany wewnątrzcząsteczkowe

6. ligazy - powodują powstawanie różnorodnych wiązań chemicznych

Komitet nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej w 1984 roku opracował system zasad klasyfikacji enzymów według, którego każdemu z tych związków przypisany jest odpowiedni numer EC (ang. Enzyme Catalogue). I tak oksydoreduktazy, jako pierwsza klasa enzymów dostały oznaczenie EC 1, a poszczególne enzymy wchodzące w skład tej grupy posiadają osobne numery, na przykład:

• Katalaza EC 1.11.1.6

• Peroksydaza EC 1.11.1.7

• Oksydaza o-difenolowa EC 1.10.3.1

W utlenianiu biologicznym zachodzą różne typy reakcji redoks: przenoszenie elektronów i protonów, lub wyłącznie elektronów oraz przenoszenie tlenu. Istotą utleniania biologicznego jest przenoszenie elektronów i protonów z substancji pokarmowych, w tym przede wszystkim z sacharydów, białek i lipidów na tlen, za pośrednictwem enzymów, zintegrowanych w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jako tzw. łańcuch oddechowy. O kierunku przenoszenia elektronów decyduje większość potencjału oksydoredukcyjnego poszczególnych przenośników. Procesowi biologicznego odłączenia elektronów zazwyczaj towarzyszy odłączenie protonów, stąd większość reakcji biologicznego utlenienia rozumiemy jako przenoszenie atomów wodoru. Odwodorowanie jest zatem równoznaczne z ich utlenianiem.

Źródła:

• „Nowoczesne kompendium chemii” K.H. Lautenschlager, W. Schroter, A. Wanninger

• katalog ExPASy http://enzyme.expasy.org

2. Część doświadczalna:

	Analiza jakościowa
Cel	Oznaczenie oksydoreduktaz (oksydazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy) w badanym ekstrakcie z kapusty pekińskiej czy tylko ten substrat był użyty w ćwiczeniu?[Author ID1: at Wed May 30 06:42:00 2012 ] Czy tylko to było celem??[Author ID1: at Wed May 30 06:44:00 2012 ]
Użyte odczynniki	10 kropel 1% roztworu wodnego katecholu 10 kropel 1% roztworu wodnego pirogalolu 10 kropel 1% roztworu wodnego H2O2 5 cm^3 ekstraktu[Author ID1: at Wed May 30 06:43:00 2012 ] enzymatyczny[Author ID1: at Wed May 30 06:43:00 2012 ]e[Author ID1: at Wed May 30 06:43:00 2012 ]go[Author ID1: at Wed May 30 06:43:00 2012 ] otrzymany[Author ID1: at Wed May 30 06:43:00 2012 ]ego[Author ID1: at Wed May 30 06:43:00 2012 ] z kapusty pekińskiej

Powyższe elementy nie powinny być w tabeli, ale jeśli tak pan zrobił to powinna być nazwana tabela [Author ID0: at Thu Nov 30 00:00:00 1899 ]

[Author ID1: at Wed May 30 06:48:00 2012 ]

Opis przeprowadzonego doświadzczenia[Author ID1: at Wed May 30 06:47:00 2012 ][Author ID1: at Wed May 30 06:47:00 2012 ]

Tabela [Author ID1: at Wed May 30 06:48:00 2012 ]. [Author ID1: at Wed May 30 06:49:00 2012 ]Wyniki analizy jakościowej aktywności oksydazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy w kapuście pekińskiej

Nr probówki	Próba	Oznaczany enzym	Wynik analizy	Opis próby
1	Ekstrakt	Próba odniesienia	-	-
2	Ekstrakt + katechol	Oksydaza o-difenolowa	+/-	lekkie zmętnienie; delikatnie żółta barwa
3	Ekstrakt + pirogalol			+	żółta barwa
4	Ekstrakt + katechol + H2O2		Peroksydaza	+++	barwa - brudny róż
5	Ekstrakt + pirogalol + H2O2			+++	herbaciany kolor
6	Ekstrakt + H2O2	Katalaza	+++	pęcherzyki gazu, lekkie zmętnienie
7	Woda + katechol	Próby odczynnikowe	-	-
8	Woda + pirogalol			-	lekko żółta barwa

Co oznaczają u pana [Author ID1: at Wed May 30 06:50:00 2012 ]zaznaczone[Author ID1: at Wed May 30 22:12:00 2012 ] symbole??[Author ID1: at Wed May 30 06:50:00 2012 ][Author ID1: at Wed May 30 06:50:00 2012 ]

Tabela . [Author ID1: at Wed May 30 06:50:00 2012 ]Wyniki analizy jakościowej aktywności oksydazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy w różnych próbkach??[Author ID1: at Wed May 30 06:50:00 2012 ]:

Produkt	Oksydaza o-difenolowa	Peroksydaza	Katalaza
Kapusta pekińska	+ delikatna żółta barwa	+++ kolor herbaciany	+++ pęcherzyki gazu CO2
Banan	+ pęcherzyki gazu CO2	++ jasno-brunatny kolor	++ jasno-brunatny kolor
Jabłko	-	++ barwa żółta	+ kolor jasno-żółty
Rzodkiewka	+ kolor żółty	+/- barwa brunatno-żółta	+++ kolor brązowy, pęcherzyki gazu CO2

Proszę podać co oznaczają + i -[Author ID1: at Wed May 30 06:51:00 2012 ]

Wnioski:

W badanych przez nas surowcach wykryliśmy obecność wszystkich oznaczanych enzymów, za wyjątkiem oksydazy o-difenolowej w jabłku. Największą aktywnością wykazały się katalaza (najbardziej w kapuście pekińskiej i rzodkiewce) oraz peroksydaza (kapusta). Najmniej aktywna we wszystkich badanych przez nas surowcach była oksydaza o-difenolowa. Na jakiej podstawie można było to stwierdzić??[Author ID1: at Wed May 30 06:52:00 2012 ]

	Analiza ilościowa
Cel	Doświadczalne wyznaczenie aktywności oksydoreduktaz (oksydazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy) w badanym ekstrakcie z kapusty pekińskiej
Użyte odczynniki	w oznaczeniu aktywności katalazy: 10 cm^3 ekstraktu enzymatycznego z kapusty pekińskiej 3 cm^31% H2O2 5 cm^310% H2SO4
		w oznaczeniu aktywności peroksydazy: 1 cm^3 ekstraktu enzymatycznego z kapusty pekińskiej 2 krople1% H2O2 5 cm^30,1M buforu fosforanowego o pH 7 1 cm^32mM gwajakolu
		w oznaczeniu aktywności oksydazy o-difenolowej: 0,5 cm^3 ekstraktu enzymatycznego z kapusty pekińskiej 2 cm^3(1,5 w próbie właściwej)0,1M buforu fosforanowego o pH 7 4 cm^310mM roztworu katecholu

Opis doświadczenia[Author ID1: at Wed May 30 07:04:00 2012 ][Author ID1: at Wed May 30 07:04:00 2012 ]

[Author ID0: at Thu Nov 30 00:00:00 1899 ]

Zasada oznaczenia[Author ID1: at Wed May 30 07:09:00 2012 ] wzory reakcji [Author ID1: at Wed May 30 22:12:00 2012 ][Author ID1: at Wed May 30 07:09:00 2012 ]

Wyniki analizy ilościowej aktywności oksydazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy w kapuście pekińskiej

Nr próby	Próba	Oznaczany enzym	Długość fali	ΔA	Aktywność
1 próba kontrolna	katechol + bufor fosforanowy	Oksydaza o-difenolowa	420 nm	0,116
2 próba właściwa	Ekstrakt + katechol + bufor fosforanowy
3 próba kontrolna	Ekstrakt + gwajakol + bufor fosforanowy					Peroksydaza	436 nm	0,036
4 próba właściwa	Ekstrakt + gwajakol + bufor fosforanowy + H2O2
Nr próby	Próba	Oznaczany enzym	Ilość zużytego KMnO4		Aktywność
5 próba kontrolna	Ekstrakt + H2SO4 + H2O2	Katalaza	0,6 cm^3
6 próba właściwa*	Ekstrakt + H2O2 + H2SO4			0,3 cm^3

* przed dodaniem kwasu siarkowego do roztworu należało, przez 30 minut, w temperaturze pokojowej, prowadzić reakcje rozkładu nadtlenku wodoru pod wpływem katalazy.

Wyniki analizy ilościowej aktywności oksydazy o-difenolowej, peroksydazy i katalazy w różnych próbkach:

Produkt	Aktywność enzymatyczna
		Katalaza [u/g]		Oksydaza o-difenolowa [u/g]		Peroksydaza [U/g]
Kapusta pekińska	2,5	2,5	284	232	3,2	3,6
Banan	4,58	4,58	794	764	2,0	1,5
Jabłko	0	0	86	130	1,5	0
Rzodkiewka	4,2	5	182	272	14,9	16,4

Wnioski:

W peroksydazę najbardziej (z badanych produktów) obfituje rzodkiewka, natomiast najmniej jest jej w jabłku. Oksydaza o-difenolowa obecna jest w największych ilościach w bananie, trochę mniej jest jej w kapuście pekińskiej i rzodkiewce, najmniej w jabłku. W badanych przez nas produktach spożywczych najmniej jest katalazy, szczególnie w jabłku gdzie ilości te są tak małe, że nie zdołaliśmy ich wykryć.

---