O8.01.2008r.	Anna Lis
Gr.2014a Godz.7:50- 10:20	Temat: Oksydazy i peroksydazy

I.Część teoretyczna:

Enzymy- związki złożone o charakterze białek prostych i złożonych:

• białka proste- zbudowane są wyłącznie z aminokwasów,

• związki białkowe zawierające w swojej strukturze oprócz podstawowego łańcucha białkowego (białko proste) także inne grupy, tzw. grupy prostetyczne.

Kasy enzymów w oparciu o typ reakcji:

• OKSYDOREDUKTAZY (np. dehydrogenazy, oksydazy) - przenoszą elektrony i protony do odpowiedniego akceptora, enzymy katalizujące reakcje, w których dochodzi do zmiany stopnia utlenienia, na przykład: dehydrogenaza mleczanowa uczestnicząca w wątrobie w pozbywaniu się szkodliwego kwasu mlekowego i oksydaza L-aminokwasowa bezpośrednio utleniająca aminokwasy w mikrociałkach.

• TRANSFERAZY (np. aminotransferazy, acetylotransferazy, kinazy) - przenoszące określoną grupę chemiczną (np. aminową, acetylową) z jednego związku do drugiego, czyli katalizujące reakcje przenoszenia grup funkcyjnych z jednej cząsteczki na drugą, na przykład: transaminaza glutaminianowa przenosząca grupę aminową na ketoglutaran przez co powstaje m. in. kwas glutaminowy i syntaza laktozowa przenosząca w gruczołach mlecznych ssaków galaktozę na glukozę przez co powstaje laktoza.

• HYDROLAZY (np. proteazy, celulaza, inwertaza) - rozkładające substrat hydrolitycznie, z jednoczesnym przyłączeniem cząsteczki wody. Zazwyczaj są to białka proste przeprowadzające reakcje rozpadu z udziałem wody. Enzymy te rozkładają wiązania w cząsteczkach używając wody - (hydroliza wiązań peptydowych, glikozydowych, estrowych), np.: wszystkie enzymy trawienne układu pokarmowego.

• LIAZY (np. dekarboksylazy aminokwasów) odszczepiające pewne grupy od substratu bez udziału wody, czyli katalizują reakcje rozpadu bez udziału wody, przy czym tworzą się zazwyczaj wiązania podwójne, np.: dekarboksylaza pirogronianowa odpowiedzialna za pgronianu dwutlenku węgla, w wyniku czego powstaje aldehyd octowy (fermentacja alkoholowa).

• IZOMERAZY - przeprowadzają reakcje przegrupowań wewnątrzcząsteczkowych, czyli przebudowują strukturę cząsteczki bez zmiany jej składu atomowego, np.: izomeraza cytrynianowa katalizująca reakcję przekształcania cytrynianu w izocytrynian (cykl Krebsa).

• LIGAZY (syntetazy) - katalizujące tworzenie nowych wiązań, czyli łączenie się dwóch cząsteczek (reakcje syntezy).

II.Reakcje charakterystyczne:

1. Aktywność peroksydaz:

Do 7 probówek dodaje po 1cm³wyciągu z ziemniaka. Następnie do 6 z nich dodaje po 1 cm³ 1% roztworu fenolu (pirokatechiny, pirogalolu), zaś do 1 ( ślepa próba)dodaje 1 cm³ wody destylowanej. Probówki ogrzewa ok.10min w termostacie o temperaturze 40⁰C oraz w temperaturze pokojowej 20⁰C.

Powstaje:

Próba	Wyciąg(cm^3)	H2O (cm^3)	Roztwory(cm^3)	Temperatura ⁰C	Obserwacje
0.	1	1	0	20	Lekkie zmętnienie
1.	1	0	1 (fenol)	20	Biały osad
2.	1	0	1 (pirokatechina)	20	Barwa jasno-brunatna
3.	1	0	1 (pirogalol)	20	Barwa jasnożółta
4.	1	0	1 (fenol)	40	Białe zmętnienie
5.	1	0	1 (pirokatechina)	40	Barwa jasnobrunatna
6.	1	0	1 (pirogalol)	40	Barwa jasnożółta

Wnioski: Najaktywniejszym enzymem pirokatechina, przy której reakcja zachodzi najbardziej intensywnie. W temperaturze 40⁰C enzymy nie tracą swoich właściwości.

2)

Z próbówek z poprzedniego doświadczenie odlewam połowę ich zawartości, a następnie dodaje do każdej z nich po 1 cm³ 3% H₂O₂.

Powstaje:

Próba	Wyciąg(cm^3)	H2O2 (cm^3)	Roztwory(cm^3)	Temperatura ⁰C	Obserwacje
1.	1	1	1 (fenol)	20	Odbarwienie
2.	1	1	1 (pirokatechina)	20	Barwa czerwona
3.	1	1	1 (pirogalol)	20	Barwa żółta, bark zmętnienia
4.	1	1	1 (fenol)	40	odbarwienie
5.	1	1	1 (pirokatechina)	40	Barwa jasnoczerwona
6.	1	1	1 (pirogalol)	40	Barwa jasnożółta, brak zmętnienia

Wnioski: Pod wpływem H₂O₂ roztwory zmieniły zabarwienie oraz osad się rozpuścił. Wynika z tego, że reakcja z ćw. Pierwszego jest odwracalna, a dodanie nadtlenku wodoru sprawia, że przebiega reakcja redukcji.

3)Wykrywanie peroksydaz:

Do 4 probówek dodaje po 1 cm³wyciągu z ziemniaka i dodaje kolejno: 0,5 cm³ KSCN, 0,5 cm³ soli Fe³⁺, 0,5 cm³ kwasu cytrynowego.

Powstaje:

Próba	Wyciąg(cm^3)	Inaktywator/aktyw akty (cm^3)	Pirogalol(cm^3)	H2O2 (cm^3)	Obserwacje
0.	1	0	0	0	zmętnienie
1.	1	0,5 cm^3 KSCN	1	1	Barwa żółta, roztwór bardziej klarowny
2.	1	0,5 cm^3 soli Fe^3+	1	1	Barwa ciemna, herbaciana
3.	1	0,5 cm^3 kw. Cytr.	1	1	Barwa kremowa

Wnioski: Roztwory soli, KSCN oraz kwasu cytrynowego pełnią role inhibitorów gdyż hamowały reakcje.

4)Wykrywanie oksydaz- próba benzydynowa:

Próba	Wyciąg(cm^3)	H2O (cm^3)	Temperatura ⁰C	Benzydyna (cm^3)	H2O2 (cm^3)	Obserwacje
0.	1	1	20	0,5	0,5	Białe zmętnienie
1.	1	0	20	0,5	0,5	Ciemnozielony osad
2.	1	0	40	0,5	0,5	Niebieskozielony osad
3.	1	0	70	0,5	0,5	Brunatne zabarwienie
4.	1	0	100	0,5	0,5	Brunatne zabarwienie

Wnioski: w temperaturze 20⁰C i 40⁰Cenzym działa, zaś w temperatzurze70⁰C i 100⁰C nastąpiła dezaktywacja enzymu, ponieważ białko uległo denaturacji.

5)Wrażliwość oksydaz i peroksydaz na temperaturę:

Do 4 probówek dodaje po 1 cm³ wyciągu z ziemniaka. Wszystkie 4 probówki orzewam w łaźni wodnej o temperaturze 70⁰C przez ok. 10 min. Następnie dodaje:

Próba	Wyciąg(cm^3)	Pirokatechi-na (cm^3)	H2O2 (cm^3)	Benzydyna (cm^3)	Obserwacje
0.	1	0	0	0	Biały osad
1.	1	10 kropli	0	0	Zmniejszenie osadu, szara barwa
2.	1	10 kropli	1	0	Zmętnienie, jasnobrunatne zabarwienie
3.	1	0	1	5 kropli	Zmętnienie, żółte zabarwienie

Wnioski: W temperaturze 70⁰C enzymy uległy inaktywacji, przestały działać.

6)Rozkład skrobi przez amylazę:

Całkowite odbarwienie zaobserwowaliśmy przy 4 probówce, po 2 minutach. Z czego wynika, iż zaszła reakcja rozkładu skrobi przez amylazę. Z odbarwionego roztworu, pobieram próbkę i dodaje kilka kropli NaOH i 1 cm³mkieszaniny roztworów Fehlinga I i II i ogrzewano. Zaobserwowałam ceglastoczerwone zabarwienie.

7)Hydrolazy peptydowe z pepsyną na żelatynie i białku. Enzymatyczna hydroliza białka z jaja kurzego przy użyciu pepsyny.

Próba	Białko (cm^3)	Pepsyna (cm^3)	Kwas/zasada(cm^3)	Temperatura ⁰C	Obserwacje
0.	1	0	0	20	Brak reakcji
1.	1	1	0,5 HCl	20	Biały osad
2.	1	1	0,5NaCl	20	odbarwienie
3.	1	1	0,5 HCl	40	Biały osad
4.	1	1	0,5NaCl	40	wybarwienie
5.	1	1	0	100	Biały gęsty osad
6.	1	1	0	100	Biały gęsty osad

Wynioski: biały osad świadczy o tym, że zaszła reakcja hydrolizy białka w HCl, czyli środowisku kwaśnym. Im wyższa temperatura tym rozkład białka był bardziej intensywny.

---