BIOCHEMIA

SPRAWOZDANIE

ĆWICZENIE 3

ODCZYN BARWY WIĄZAŃ PEPTYDOWYCH

Sabina Spyrka

Natalia Wiśniewska

Biotechnologia II

Gr. 5

OPOLE

WPROWADZENIE

CEL ĆWICZENIA

Przeprowadzenie reakcji biuretowej Piotrowskiego, charakterystycznej dla związków z co najmniej dwoma wiązaniami peptydowymi - peptydy i białka.

PRZEBIEG ĆWICZENIA

CZĘŚĆ I - Izolowanie albuminy z jaja kurzego

1. Oddzieliłyśmy białka z dwóch jajek kurzych

2. Ubiłyśmy białka na sztywno

3. Dodałyśmy 10-krotnej objętości wody do ubitej piany z białek, wymieszałyśmy

4. Przesączyłyśmy roztwór przez gazę na lejku

5. Odstawiliśmy roztwór w zlewce do kolejnej reakcji (II)

WYNIKI I WNIOSKI:

W wyniku powyższych kroków rozdzieliłyśmy białka znajdujące się w jajku kurzym ze względu na ich właściwości - w zlewce rozpuszczalna w wodzie albumina, na gazie nierozpuszczalna globulina)

CZĘŚĆ II - Reakcja biuretowa Piotrowskiego

1. Odmierzyłyśmy do probówki po 2 cm³ roztworu albuminy (uzyskanego w I części)

2. Dodałyśmy 2 cm³ 10% roztworu NaOH

3. Dodałyśmy 8 kropli 0,5% roztworu CuSO₄

4. Wymieszałyśmy zawartość probówki

5. Obserwowałyśmy zmiany

WYNIKI I WNIOSKI:

W wyniku doświadczenia otrzymałyśmy niebieskofioletowe zabarwienie roztworu. Kolor ten nadał kompleks -CO-NH z jonami Cu²⁺ - reakcja ta potwierdziła obecność albuminy w roztworze. Powstaje on w reakcji CuSO₄ ze związkami składającymi się z co najmniej 3 aminokwasów (zawierającymi co najmniej 2 wiązania peptydowe) w środowisku zasadowym. Otrzymany kompleks, dla wszystkich spełniające powyższe kryteria polipeptydów, powstaje według poniższego schematu:

Tautomeryzacja grupy przy wiązaniu peptydowym - otrzymanie formy

enolowej zdolnej do dysocjacji:

Stworzenie dwóch wiązań jonowych między jonem miedziowym a grupami enolowymi

oraz czterech wiązań koordynacyjnych (z atomami azotu):

CZĘŚĆ III - Wytrącenie białka etanolem

1. Nalałyśmy do zlewki 25 cm³ mleka

2. Dodałyśmy 25 cm³ nasyconego roztworu (NH₄)₂SO₄

3. Przesączyłyśmy roztwór przez sączek na lejku

4. Przesączony roztwór zostawiłyśmy do kolejnej części ćwiczenia

WYNIKI I WNIOSKI:

Podobnie jak w I części wykorzystaliśmy różnice w właściwościach białek do ich rozdzielenia - w roztworze otrzymaliśmy rozpuszczalną w wodzie albuminę, natomiast na sączku osad zawierający globulinę i kazeinę. Siarczan amonu dodaje się w celu wytrącenia z roztworu niektórych białek - w tym przypadku globuliny i kazeiny (zmniejsza się ich rozpuszczalność aż do wytrącenia).

CZĘŚĆ III - Reakcja Piotrowskiego

1. Odmierzyłyśmy do probówki 2 cm³ roztworu albuminy otrzymanego w części III

2. Dodałyśmy 2 cm³ 10% roztworu NaOH

3. Dodałyśmy 8 kropli 0,5% roztworu CuSO₄

4. Wymieszałyśmy zawartość probówki

WYNIKI I WNIOSKI

Analogicznie do II części - otrzymałyśmy fioletowy roztwór zawierający charakterystyczny kompleks dla reakcji Piotrowskiego (-CO-NH z Cu²⁺) - reakcja potwierdziła obecność albuminy w mleku krowim.

CZĘŚĆ V - Izolowanie albuminy z mięsa

1. Odważyłyśmy 50g mięsa mielonego na wadze laboratoryjnej

2. Umieściłyśmy mięso w zlewce o objętości 250 cm³

3. Dodałyśmy 80 cm³ 0,9% roztworu NaCl

4. Mieszałyśmy roztwór przez 15 minut

5. Przesączyłyśmy roztwór przez gazę

WYNIKI I WNIOSKI

Podobnie jak w poprzednich częściach uzyskaliśmy roztwór zawierający białka - albuminę i w tym przypadku globulinę. Dodanie soli zwiększyło rozpuszczalność białka w wodzie.

CZĘŚĆ VI - Reakcja biuretowa Piotrowskiego

1. Odmierzyłyśmy 2 cm³ roztworu albuminy otrzymanego w części V

2. Dodałyśmy 2 cm³ 10% roztworu NaOH

3. Dodałyśmy 8 kropli 0,5% roztworu CuSO₄

4. Wymieszałyśmy zawartość probówki

WYNIKI I WNIOSKI

Otrzymałyśmy wynik typowy dla reakcji Piotrowskiego - fioletowy roztwór - w mięsie znajdują się białka - albumina i globulina. Reakcja przebiega według schematu opisanego w części I.

---