Temat 1: Morfologia komórki i kolonii. Barwienie pozytywne proste

i barwienie negatywne

.

Morfologia zajmuje się zewnętrznym wyglądem komórek i ich zgrupowań.(z gr. morphe - kształt). Ma to znaczenie w identyfikacji drobnoustrojów, czyli określeniu, z jakim gatunkiem mamy do czynienia. Oczywiście na podstawie jedynie cech morfologicznych nie da się precyzyjnie zidentyfikować gatunku (konieczne są tu również m. in. testy biochemiczne). Badania te dostarczają jednak niezbędnych wstępnych informacji pozwalających zawęzić krąg poszukiwań. Na przykład stwierdzenie, że badane komórki mają kształt kulisty, pozwala wykluczyć dużą grupę bakterii cylindrycznych.

Komórki bakteryjne mają rozmiar rzędu 1 μm (10^-6m). Ich kształt da się sprowadzić do trzech podstawowych typów morfologicznych:

• kulisty,

• cylindryczny,

• skręcony.

Formy kuliste nazywane są ziarniakami (łac. coccus). Ziarniaki mogą występować jako

pojedyncze komórki lub układy dwukomórkowe (dwoinki), wielokomórkowe ułożone w pakiety sześcienne (pakietowce), łańcuszki (paciorkowce) lub grona (gronkowce).

Formy cylindryczne nazywa się pałeczkami (łac. bacterium). Należy tu najważniejsza z sanitarnego punktu widzenia grupa bakterii - bakterie jelitowe. Niektóre pałeczki są na jednym końcu grubsze i przypominają maczugę (corynebacterium - maczugowiec). Część form pałeczkowatych bardziej wydłużona i prostopadle ucięta na końcach określana jest mianem laseczek (łac. bacillus). Laseczki mają zdolność do wytwarzania wewnątrz komórek tzw. przetrwalników (endospor), które sprawiają, że są one niezwykle odporne na niekorzystne warunki środowiska (wytrzymują gotowanie i długotrwałe wysuszenie).

Formy skręcone mają zwykle albo postać przecinkowato zgiętych pałeczek (przecinkowce) albo komórek skręconych śrubowato (śrubowce i krętki).

Niektóre bakterie tworzą formy nitkowate, w tym rozgałęzione (np. promieniowce). Jeszcze inne wykazują tzw. pleomorfizm (wielopostaciowość) przybierając różne formy morfologiczne. Np. pospolite bakterie glebowe z rodzaju Arthrobacter w zależności od ilości składników pokarmowych w podłożu, mają albo postać pałeczek (gdy jest dużo pokarmu) albo ziarniaków (w warunkach głodowych). Dlatego formy te określa się mianem ziarniakopałeczek. Pleomorfizm można też wywołać sztucznie, np. działając penicyliną, która zaburza syntezę ściany komórkowej. Powstają wówczas komórki o zniekształconym, wydłużonym i często rozgałęzionym kształcie, tzw. formy L. Po zaprzestaniu działania czynnika szkodliwego, komórki wracają do swojej naturalnej postaci.

W stanie naturalnym bakterie są słabo widoczne pod mikroskopem i trudno jest określić ich morfologię. Dlatego w celu ich lepszego uwidocznienia stosuje się różnorodne techniki barwienia. Ogólnie barwienie dzieli się na

• proste, gdy używa się jednego barwnika,

• złożone, gdy używa się przynajmniej dwóch barwników.

Stosując inne kryterium podziału można wyróżnić:

• barwienie pozytywne, gdy barwi się obiekt badań,

• barwienie negatywne, gdy barwi się jedynie tło.

Aby zabarwić bakterie, należy najpierw wykonać preparat. Preparat wykonuje się na szkiełku mikroskopowym przedmiotowym (podstawowym) przez naniesienie drobnoustrojów na jego powierzchnię. Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje preparatów:

• preparaty przyżyciowe,

• preparaty utrwalone.

W pierwszym przypadku naniesione na szkiełko mikroorganizmy zachowuje się przy życiu, a w drugim komórki poddaje się tzw. utrwaleniu. Celem utrwalania jest zwiększenie podatności komórek na barwienie i zapobieżenie zmyciu komórek ze szkiełka w trakcie procesu barwienia. Utrwalanie może polegać np. na ogrzewaniu preparatu w płomieniu palnika lub na polaniu go alkoholem. W efekcie komórki giną i ich osłony stają się przepuszczalne dla barwników. Poza tym wewnętrzne struktury komórkowe ulegają denaturacji odsłaniając grupy funkcyjne makromolekuł reagujące z barwnikami.

Do barwienia pozytywnego stosuje się zwykle barwniki zasadowe, czyli takie, które w roztworach wodnych mają ładunek dodatni. Dodatnio naładowane jony barwnika łatwo łączą się bowiem ze zwykle ujemnie naładowanymi komórkami bakterii. Często stosowanymi barwnikami zasadowymi są m. in.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fuksyna karbolowa i safranina. Inną techniką barwienia bakterii jest barwienie negatywne, w którym barwi się nie obiekt, lecz tło. Używa się do tego celu barwników kwaśnych o ładunku ujemnym, których jony są odpychane od bakteryjnych ścian komórkowych. Są to barwniki o charakterze tuszu np. tusz chiński lub nigrozyna. Barwienie negatywne stosuje się wówczas, kiedy chcemy lepiej uwidocznić bakterie nie przyjmujące barwników (np. krętki wywołujące kiłę) lub w celu uwidocznienia otoczek bakteryjnych.

Komórka bakteryjna po dostaniu się na powierzchnię zestalonej pożywki, zaczyna się dzielić (z różną szybkością, zależną od czynników zewnętrznych i od gatunku) i po określonym czasie (zwykle paru dób) wytwarza bardzo liczne zgrupowanie komórek zwane kolonią (kolonią powierzchniową), które jest widoczne gołym okiem. W jednej kolonii znajduje się ok. 10⁹ komórek. Wygląd zewnętrzny kolonii powierzchniowej, czyli jej morfologia, jest charakterystyczny dla danego rodzaju mikroorganizmu, dlatego jest pomocny w jego identyfikacji.

Niektóre gatunki bakterii tworzą dwa typy kolonii: S i R. Kolonie typu S mają gładką powierzchnię (ang. smooth - gładki ), a kolonie R szorstką (ang. rough - szorstki). Jest to związane z różnicami w budowie błony zewnętrznej pokrywającej ścianę komórkową tych bakterii; komórki tworzące kolonie R wykazują braki w kompleksie lipopolisacharydowym (LPS) tworzącym tę błonę. Jako że błona zewnętrzna odpowiada za właściwości chorobotwórcze wielu bakterii (np. pałeczek Salmonella), szczepy tworzące kolonie typu R nie wywołują zakażeń.

Mniej charakterystyczne kolonie powstają, gdy komórka znajdzie się nie na powierzchni, lecz w głębi zestalonej pożywki. Powstają wówczas tzw. kolonie wgłębne, mające zwykle kształt soczewkowaty, z powodu ciśnienia działającego wewnątrz pożywki na dzielące się komórki.

Temat 2: Morfologia komórki bakteryjnej. Barwienie złożone

Najczęściej stosowaną w mikrobiologii techniką barwienia jest metoda Grama (od nazwiska duńskiego badacza). Jest to barwienie złożone pozytywne, w którym stosuje się kolejno dwa kontrastowe barwniki zasadowe: fioletowy (fiolet krystaliczny) i czerwony (fuksyna). Właściwy proces barwienia poprzedzony jest termicznym utrwaleniem preparatu. Barwienie to składa się z następujących etapów:

• zabarwienia preparatu fioletem krystalicznym,

• utrwalenia zabarwienia przez dodanie jodu w postaci płynu Lugola (roztwór J₂ w KJ),

• wymycia barwnika alkoholem,

• dobarwienia preparatu barwnikiem kontrastowym - fuksyną.

Po dodaniu pierwszego barwnika wszystkie komórki barwią się na fioletowo. Dodanie płynu Lugola powoduje powstanie nierozpuszczalnego kompleksu fioletu krystalicznego z jodem. Kompleks ten jest następnie ekstrahowany 95 % alkoholem. Okazuje się, że te bakterie, które mają grubą warstwę mureiny (peptydoglikanu) w ścianie komórkowej nie tracą barwnego kompleksu i pozostają fioletowe po działaniu alkoholem. Te natomiast, których warstwa mureiny jest cienka, łatwo tracą barwnik i ulegają odbarwieniu. Aby je uwidocznić stosuje się drugi barwnik - kontrastowy, którym jest czerwona fuksyna zasadowa. W efekcie część komórek zabarwi się na fioletowo, a część na czerwono. Te pierwsze określa się mianem bakterii gramdodatnich, drugie mianem bakterii gramujemnych.

Barwienie Grama jest więc barwieniem różnicowym, gdyż pozwala zróżnicować bakterie na dwie podstawowe grupy, w zależności od tego, którym barwnikiem się zabarwią. Strukturalnym podłożem tych różnic jest przede wszystkim różnica w budowie ściany komórkowej.

Znaczenie barwienia Grama polega na tym, że różnice w barwliwości bakterii gramdodatnich i gramujemnych są skorelowane z innymi, bardziej istotnymi różnicami między nimi. Oto tylko niektóre z nich:

Bakterie gramdodatnie:

• mają grubą ścianę komórkową z dużym procentowym udziałem mureiny,

• są wrażliwe na penicylinę,

• są wrażliwe na lizozym (enzym występujący np. we łzach), który rozpuszcza ich ścianę komórkową (a konkretnie peptydoglikan mureinę) pozostawiając tzw. protoplasty - komórki bez ściany,

• są bardzo wrażliwe na detergenty anionowe,

• część z nich ma zdolność wytwarzania przetrwalników (endospor).

Bakterie gramujemne:

• mają cienką ścianę komórkową z niewielkim udziałem peptydoglikanu ale z dodatkową specyficzną błoną na zewnątrz ściany (tzw. błoną zewnętrzną),

• są zwykle mało wrażliwe na penicylinę,

• są odporne na działanie samego lizozymu,

• są mało wrażliwe na detergenty anionowe,

• nie mają zdolności do wytwarzania endospor.

Bakteriami gramdodatnimi są zasadniczo laseczki i ziarniaki, natomiast typowe pałeczki

(np. pałeczki jelitowe) są gramujemne. Barwliwość metodą Grama nie jest cechą stałą bakterii. Niektóre z nich, w zasadzie gramdodatnie, w starych hodowlach barwią się gramujemnie lub mozaikowato: część komórki jest fioletowa a część czerwona. Dlatego wiarygodny wynik barwienia dają tylko komórki pochodzące ze świeżych hodowli. Trzeba też wspomnieć, że nie wszystkie bakterie barwią się metodą Grama, np. prątki, zaliczane do promieniowców (w tym słynny prątek gruźlicy) mają ścianę tak silnie wysyconą substancjami lipidowymi i woskami, że barwniki nie wnikają do wnętrza ich komórek. Natomiast barwią się metodą Grama grzyby (np. drożdże), które zwykle są gramdodatnie.

Niektóre bakterie mogą występować zarówno w postaci komórek wegetatywnych, tzn. aktywnych metabolicznie i zdolnych do rozmnażania się, odżywiania, poruszania itd., jak i w postaci form przetrwalnych, których aktywność życiowa jest zahamowana. Najbardziej znaną formą przetrwaną są endospory, zwane też przetrwalnikami. Wytwarzają je głównie laseczki tlenowe z rodzaju Bacillus i laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium. Tworzą one endospory w niekorzystnych warunkach, szczególnie po wyczerpaniu się w podłożu substancji pokarmowych. Endospory są niezwykle odporne na wysoką temperaturę, wysychanie, promieniowanie, a także na działanie związków chemicznych, w tym barwników. W korzystnych warunkach są one zdolne przejść z powrotem w formę wegetatywną. W celu zabarwienia przetrwalników stosuje się specjalne metody z zastosowaniem wysokiej temperatury umożliwiającej przeniknięcie barwnika przez osłony endospor.

Temat 3: Morfologia grzybów drożdżowych i pleśni

Grzyby, w przeciwieństwie do bakterii, są organizmami eukariotycznymi. Kiedyś były one uważane za rośliny i jeszcze do dziś są omawiane w podręcznikach botaniki. Jednak grzyby tworzą zupełnie odrębne królestwo organizmów, nie spokrewnione z roślinami ani zwierzętami. Przedmiotem zainteresowania mikrobiologii są jedynie tzw. grzyby mikroskopowe obejmujące drożdże i pleśnie.

Drożdże są grzybami jednokomórkowymi i występują dziko w miejscach o dużym nagromadzeniu węglowodanów: w sokach wydzielanych przez rośliny (np. po zranieniu lub jako nektar w kwiatach), na owocach, a także w glebie czy na odchodach zwierzęcych. Niektóre powodują choroby u człowieka, zwane drożdżycami (ogólnie mikozami), a wywołane np. przez Candida sp. - kandydozami. Candida albicans wywołuje tzw. pleśniawki, zmiany w błonie śluzowej jamy ustnej w postaci charakterystycznych białych plamek. Drożdże w szerokim znaczeniu obejmują zarówno drożdże właściwe, jak i grzyby drożdżopodobne. Drożdże właściwe należą do workowców, ponieważ wytwarzają zarodnie workowe (worki), a w nich zarodniki workowe (askospory) w procesie rozmnażania płciowego. Należą tu powszechnie znane drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae. Natomiast grzyby drożdżopodobne (drożdżoidalne, drożdże bezworkowe) nie rozmnażają się płciowo, a więc nie wytwarzają worków i są zaliczane do prowizorycznego taksonu tzw. grzybów niedoskonałych, grupujących grzyby, które zatraciły zdolność do wytwarzania ogranów rozmnażania płciowego. Należą tu np. gatunki z rodzaju Candida i Rhodotorula.

Drożdże, zarówno workowe, jak i bezworkowe, cechuje charakterystyczny sposób rozmnażania bezpłciowego w postaci tzw. pączkowania. Polega ono na tym, że w pewnym miejscu komórka tworzy rosnące stopniowo uwypuklenie, do którego przechodzi jedno z powstałych po podziale jąder potomnych. Następnie wytwarza się ściana komórkowa oddzielająca komórkę potomną od macierzystej. U drożdży piekarniczych powstałe komórki są jednakowej wielkości i oddzielają się od siebie. Po oddzieleniu, na obu komórkach (potomnej i macierzystej) pozostaje trwała blizna. W miejscu starej blizny komórka nie może utworzyć nowego pączka, a więc liczba blizn świadczy zarówno o wieku komórki, jak i o jej zdolności do rozmnażania. U grzybów drożdżoidalnych komórki często nie rozdzielają się po pączkowaniu i wydłużają tworząc tzw. pseudogrzybnię w postaci rozgałęziających się łańcuszków, gron lub krzaczków. Pseudogrzybnia (pseudomycelium) to wydłużone, nitkowate struktury, często rozgałęziające się, utworzone wyłącznie przez komórki pączkujące. Struktura ta przypomina prawdziwą grzybnię (mycelium). Ta jednak utworzona jest przez komórki dzielące się, a nie pączkujące i jest charakterystyczna dla grzybów pleśniowych.

Chociaż zdolność do pączkowania jest cechą charakterystyczną większości drożdży, to nie jest to cecha wyłącznie tej grupy grzybów (zdolność do pączkowania mają też np. niektóre podstawczaki). Niektóre drożdże nie pączkują, lecz rozmnażają się bezpłciowo przez zwykły podział komórki. Są to tzw. drożdże rozszczepkowe.

Drożdże mogą również rozmnażać się przez zarodniki, czyli spory. Oprócz wspomnianych zarodników workowych, czyli askospor (wytwarzanych tylko przez drożdże właściwe w procesie płciowym), drożdże wytwarzają też zarodniki na drodze bezpłciowej. Mogą to być blastospory, które powstają w wyniku pączkowania (charakterystyczne np. dla Candida sp.) lub chlamydospory, czyli zarodniki przetrwalnikowe, charakteryzujące się grubą ścianą.

Drugą grupą grzybów mikroskopowych są pleśnie. Jest to popularna nazwa określająca grzyby tworzące grzybnię zbudowaną z luźno skupionych strzępek, tzw. grzybnię powietrzną. Grzybnia ta tworzy charakterystyczne watowate skupienia o różnorodnym zabarwieniu (zielonym, zielononiebieskim, żółtym, różowym, białym lub czarnym). Wytwarza ona zarodniki i wyrasta z tzw. grzybni wegetatywnej, wrośniętej w podłoże, z którego pobiera substancje odżywcze. Podobnie jak drożdże, pleśnie również nie stanowią grupy jednorodnej systematycznie. Należą tu bowiem zarówno przedstawiciele grzybów niższych - sprzężniaki z rzędu pleśniakowców (pleśniak i rozłożek), jak i grzyby wyższe - workowce właściwe (kropidlak, pędzlak). Pleśnie rozmnażają się za pomocą zarodników.

Sprzężniaki z rzędu pleśniakowców, jak pleśniak biały (Mucor mucedo), czy rozłożek czerniejący (Rhizopus nigricans) wytwarzają grzybnię nie podzieloną ścianami poprzecznymi (septami) na poszczególne komórki. Są więc komórczakami - tworzą jedną dużą wielojądrową komórkę. Wytwarzają one (bezpłciowo i na drodze płciowej) zarodniki wewnątrz kulistych zarodni (sporangiów) osadzonych na trzonkach zarodnionośnych (sporangioforach). Pleśnie te wytwarzają więc zarodniki wewnętrzne.

Pleśnie należące do workowców, a więc kropidlaki (Aspergillus spp.) i pędzlaki (Penicillium spp.) tworzą grzybnie wielokomórkowe, a więc podzielone ścianami poprzecznymi i wytwarzają tzw. zarodniki konidialne (konidiospory), czyli konidia. Konidia to zarodniki tworzone zewnętrznie, tj. przez odcięcie końcowej (górnej) części specjalnej, pionowo wzniesionej strzępki, zwanej strzępką konidionośną albo konidioforem.

Temat 4-5: Sterylizacja i dezynfekcja

1. Sterylizacja

Sterylizacja, czyli wyjaławianie, jest to niszczenie lub usuwanie wszystkich drobnoustrojów, zarówno ich form wegetatywnych (wykazujących aktywność życiową: odżywiających się, oddychających, rozmnażających się itp.) jak i przetrwalnych (endospory laseczek, zarodniki grzybów). Efekt taki można uzyskać poprzez zastosowanie czynników fizycznych, takich jak temperatura i promieniowanie oraz przez filtrację.

Sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem

Metodą tą uzyskuje się najlepsze efekty jałowienia. Prowadzi ona do usunięcia form wegetatywnych i przetrwalnych wszystkich drobnoustrojów znajdujących się w sterylizowanych materiałach. Proces ten można przeprowadzać w szybkowarach i autoklawach. Najszersze zastosowanie ma autoklaw. Para wodna zasilająca to urządzenie może przechodzić z zewnętrznego źródła i wówczas przed wprowadzeniem do autoklawu wmontowany jest reduktor ciśnienia. Większość autoklawów posiada własne wytwornice pary wmontowane do aparatu. Autoklaw jest to dwuścienny kocioł z grubej blachy, zamykany szczelnie ciężką pokrywą. Zaopatrzony jest w manometr, termometr i zawór bezpieczeństwa. Zwykle wodę podgrzewa się za pomocą grzejnika elektrycznego. Wytworzona para wodna wypycha powietrze przez otwarty wypust. Następnie urządzenie zamyka się i para wytwarza w kotle ciśnienie wyższe od atmosferycznego. Dzięki temu podnosi się temperatura. Zwiększenie ciśnienia o 0,5 atmosfery powoduje ogrzanie pary wodnej do 111,7⁰ C, a zwiększenie o 1 atmosferę do 121,6⁰ C. W takich warunkach giną nawet formy przetrwalne drobnoustrojów. Najczęściej do sterylizacji podłoży bakteriologicznych stosuje się temperaturę 121⁰ C przez 20 minut. Nie jest to pełny cykl pracy urządzenia, bo należy także doliczyć czas usuwania powietrza, wprowadzania pary oraz czas schładzania, co razem zajmuje około 100 minut. Materiały, do których para wodna ma utrudniony dostęp wymagają zwiększenia ciśnienia pary wodnej lub wydłużenia czasu efektywnej pracy autoklawu.

Dekoktacja

Jest to wyjaławianie w gorącej parze bieżącej o temp. 100⁰ C. Proces ten prowadzi się w aparacie Kocha. Urządzenie to ma budowę kotła z pokrywą. Wyposażone jest w grzałkę do podgrzewania wody wypełniającej dno kotła. Nad wodą znajduje się metalowa siatka, na której ustawia się przedmioty i podłoża przeznaczone do jałowienia. Następnie kocioł nakrywa się. Para wydzielająca się podczas podgrzewania wody usuwa powietrze z kotła i przy ciśnieniu równym atmosferycznemu, przepływa przez aparat. Dekoktację prowadzi się przez 20 - 30 minut. W takich warunkach nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów i wirusy zapalenia wątroby typu B. Metoda ta służy do wyjaławiania pożywek i przedmiotów termowrażliwych.

Tyndalizacja

Zabieg ten polega na trzykrotnym ogrzaniu materiałów w bieżącej parze wodnej przez 30 minut w odstępach 24 - godzinnych. W takich warunkach przy pierwszym ogrzaniu giną jedynie formy wegetatywne drobnoustrojów. W okresach 24 - godzinnych pomiędzy poszczególnymi ogrzewaniami, próby inkubuje się w termostacie w temp. pokojowej. Kiełkują wówczas formy przetrwane drobnoustrojów. Powstałe z nich formy wegetatywne ulegają zniszczeniu w czasie następnego ogrzania. Dla pewności, że wszystkie przetrwalniki miały szansę wykiełkowania, po następnej 24 godzinnej przerwie przeprowadza się trzecie ogrzanie próby.

Pasteryzacja

Proces ten pozwala na częściowe wyjałowienie materiału i polega na jednorazowym podgrzaniu płynu do temp. 62⁰ C przez 30 min. W warunkach przemysłowych stosuje się temp. wyższe (70 - 90⁰ C), krótszy czas pasteryzacji (sekundy) oraz szybkie schładzanie, w celu maksymalnego ograniczenia rozpadu składników odżywczych (witamin) zawartych w wyjaławianych produktach oraz uniknięcia zmian smaku i zapachu. Pasteryzuje się m.in. mleko, soki owocowe i warzywne, moszcz winny i piwo. Zabieg ten niszczy większość bakterii i innych drobnoustrojów (pierwotniaki, grzyby, glony, wirusy). Natomiast nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów oraz wirusy zapalenia wątroby typu B. Tych ostatnich nie usuwa także gotowanie.

Gorące powietrze

Metoda ta służy do sterylizacji przedmiotów opornych na działanie wysokiej temperatury. Wyjaławianie przeprowadza się w zakresie temperatur od 140-180⁰ C. Służą do tego celu urządzenia zwane sterylizatorami lub suszarkami. Przedmioty poddawane sterylizacji muszą być opakowane w celu ich ochrony przed wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym po zakończeniu sterylizacji. W praktyce najczęściej używa się do tego celu papieru lub specjalnych metalowych tubusów. Czas pracy suszarki zależy od zastosowanej temperatury, stopnia wypełnienia suszarki, czasu jej nagrzewania i oziębiania. W sterylizatorach wyposażonych w wentylatory przeciętny czas ekspozycji wsadu w temp. 160⁰ C wynosi 60 minut, a czas cyklu pracy ok. 150 minut, natomiast w temp 180⁰ C czas ekspozycji wynosi 30 min. W sterylizatorach starego typu, tzw. suszarkach, nie mających wymuszonego obiegu powietrza, czas sterylizacji jest dłuższy. W 160⁰ C czas ekspozycji wsadu wynosi 100 - 120 min. a pełny cykl pracy aparatu trwa kilka godzin.

Wyjaławianie przez spalanie i opalanie.

Spalanie służy do niszczenia materiałów i przedmiotów zakażonych drobnoustrojami chorobotwórczymi. Spala się np. plastikowe płytki Petriego z hodowlą zakaźnych mikroorganizmów zwłoki zwierząt doświadczalnych. Opalanie nad płomieniem palnika stosuje się jako jałowienie drobnych przedmiotów nie ulegających spaleniu, takich jak ezy, druciki platynowe, igły preparacyjne, łopatki, skalpele. Ponadto opala się zawsze brzegi kolb i probówek, w celu zabezpieczenia hodowli przed zakażeniem z zewnątrz.

Sterylizacja za pomocą radiacji

Do wyjaławiania stosuje się dwa typy promieniowania jonizującego: beta i gamma. Promieniowanie gamma charakteryzuje się dużą przenikliwością, natomiast promieniowanie beta jest promieniowaniem elektronowym o dużej energii. Skuteczna dawka promieniowania gamma waha się w zakresie 0,1 -1 megarada. Przy stosowaniu tego typu wyjaławiania należy zwrócić uwagę na właściwy dobór dawki. Zbyt mała dawka może spowodować, że wśród komórek bakterii, które przeżyły wyjaławianie, pojawią się mutanty o zmienionych właściwościach biologicznych. Niektóre z tych cech mogą okazać się niebezpieczne np. podwyższenie zjadliwości (zdolności wywoływania choroby). Praktycznie stosowana dawka sterylizująca jest duża i wynosi 2,5 - 3,0 megaradów. Należy także zwrócić uwagę na fakt, że promieniowanie jonizujące może powodować zmiany struktury związków chemicznych lub ich rozpad, co wiąże się ze zmianą cech chemicznych oraz odmiennym oddziaływaniem na drobnoustroje. Ponadto w wyniku napromieniowania związków organicznych powstają często nadtlenki, związki o podwójnych wiązaniach i wolne rodniki. Prowadzić to może do powstania produktów wykazujących działanie mutagenne i rakotwórcze.

Wyjaławianie przez filtrację

Proces ten polega na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze. Działa on na zasadzie sita i w związku z tym średnica porów filtra musi być mniejsza od średnicy komórek oraz form przetrwalnych. Dodatkowo, część mikroorganizmów zatrzymywana jest przez siły adsorpcyjne na powierzchni filtra. Wyjaławianie tego typu stosowane jest do płynów, których składniki charakteryzują się dużą wrażliwością na działanie czynników fizycznych. Metoda ta pozwala na usunięcie nie tylko żywych komórek, form przetrwalnych, ale także komórek martwych oraz ich części.

Do najczęściej stosowanych filtrów należą: filtry z ziemi okrzemkowej, spiekanego szkła oraz filtry membranowe. Posiadają one zbyt małe pory, aby filtrację można było przeprowadzić z wykorzystaniem siły ciężkości. Konieczne jest więc zastosowanie nadciśnienia lub podciśnienia. Uzyskuje się je za pomocą pompy próżniowej.

Filtr z ziemi okrzemkowej

Znane są m. in. filtry Berkefelda. Zwykle są to świece otrzymane poprzez spiekanie w temp. 2000^o C ziemi okrzemkowej. Charakteryzują się one dużą sprawnością działania. Skutecznie usuwają z filtrowanych roztworów formy wegetatywne i przetrwalne, jednakże nie zatrzymują wirusów. Wadą tych urządzeń jest też zbyt duża kruchość, wypłukiwanie ich cząstek do filtratu. Ponadto, część sączonego płynu pochłaniana jest przez filtr.

W mikrobiologii stosowane są filtry o najdrobniejszych porach, o symbolu W. Świece sterylizuje się w autoklawie. Podczas filtracji sączony płyn nalewa się tak, aby świeca była w nim całkowicie zanurzona.

Filtry ze szkła spiekanego

Najpopularniejsze w tej grupie są filtry Schotta. Powstają one poprzez stopienie w odpowiedniej temperaturze sproszkowanego szkła. Są to lejki z warstwą filtracyjną na dnie. Do wyjaławiania roztworów stosowane są tylko filtry nr 5, o najmniejszej średnicy porów. Filtry ze szkła spiekanego charakteryzują się dużą sprawnością działania oraz brakiem efektów ubocznych w postaci adsorpcji sączonych płynów, wymywania składników filtrów oraz zmiany pH przesączu. Ponadto mogą być one jałowione termicznie. Filtry tego typu zatrzymują wszystkie formy drobnoustrojów oprócz wirusów.

Filtry membranowe

Filtry (sączki) membranowe zbudowane są z pochodnych celulozy (np. z nitrocelulozy). Są to cienkie błony o grubości 80- 150 μm. Wielkość porów w filtrach jest zróżnicowana. Odpowiedni dobór sączka pozwala na całkowite usunięcie z roztworów drobnoustrojów. Filtry produkowane są w postaci krążków o różnych średnicach. Jałowi się je przez gotowanie w wodzie destylowanej. Następnie umieszcza w odpowiednich jałowych aparatach filtracyjnych. Sączenie odbywa się w podciśnieniu lub nadciśnieniu w zależności od konstrukcji aparatu. Sączony płyn nie ulega żadnym zmianom odczynu, nie jest adsorbowany przez filtr oraz do przesączu nie są uwalniane składniki filtra.

Filtry membranowe są stosowane nie tylko do sterylizacji płynów, ale także w badaniu stanu sanitarnego wody, gdzie celem nie jest oczyszczenie z mikroorganizmów, lecz wydzielenie ich z wody i dalsza hodowla na specjalnych pożywkach.

2. Dezynfekcja

Dezynfekcją nazywamy proces niszczenia wegetatywnych form drobnoustrojów za pomocą czynników chemicznych i fizycznych. Dezynfekcja nie niszczy wszystkich form przetrwanych. Celem dezynfekcji jest możliwie szybkie zabicie drobnoustrojów, ale głównym jej zadaniem jest wyeliminowanie mikroorganizmów chorobotwórczych z powierzchni sprzętów, podłóg, naczyń, pojemników z płynami, z części ciała ludzkiego (ręce, pole operacyjne), z ciała zwierząt.. A zatem dotyczy ona tych obiektów, które należy odkazić, nie mogąc poddać ich sterylizacji. Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych jest tak różny jak różna jest budowa chemiczna dezynfektantów.

Środki dezynfekcyjne powodują bardzo istotne, nieodwracalne zmiany zarówno struktury jak i metabolizmu komórki bakteryjnej. Zmiany te mogą mieć charakter okresowego hamowania rozwoju drobnoustrojów, bądź ich całkowitego wyeliminowania. W związku z tym, środki dezynfekcyjne można podzielić na dwie grupy:

1. środki bakteriostatyczne - mające właściwości hamowania rozmnażania bakterii (po ich usunięciu bakterie jednak ponownie zaczynają się rozmnażać);

2. środki bakteriobójcze, posiadające właściwości zabijania bakterii, a więc ich działanie jest nieodwracalne.

Działanie dezynfektantów zależy od wielu czynników, do których należą :

1. stężenie środka dezynfekcyjnego,

2. czas działania,

3. temperatura,

4. obecność substancji organicznych w środowisku,

5. wilgotność środowiska,

6. odczyn środowiska,

Ad a) Na szybkość procesu dezynfekcji ma wpływ stężenie środka dezynfekcyjnego. Im stężenie jest wyższe, tym proces przebiega szybciej. Nie jest to jednak zależność proporcjonalna, np. podwojenie stężenia fenolu skraca czas wymagany do zabicia wszystkich osobników w hodowli Salmonella paratyphi w przybliżeniu siedmiokrotnie.

Ad b) W celu wyznaczenia zakresu działania środka dezynfekcyjnego oznacza się przeżywalność drobnoustrojów jako funkcję czasu działania badanego dezynfektanta w określonym stężeniu i przy określonej gęstości badanej hodowli.

Ad c) Wpływ temperatury na skuteczność procesu dezynfekcji wyraża się za pomocą tzw. współczynnika temperatury, według wzoru:

Czas wymierania w temp. x

Wsp. temp = -------------------------------------

Czas wymierania w temp. x + 10

Wartości współczynnika są tym wyższe im wyższa jest temperatura, w której przebiega proces.

Ad. d ) Charakter wpływu obecności związków organicznych może być chemiczny bądź fizyczny, przy czym mogą zachodzić różnego rodzaju reakcje:

1. Środek dezynfekcyjny reaguje ze związkami organicznymi, co powoduje jego unieczynnienie. W sytuacji, gdy związki organiczne są konkurencyjne w stosunku do drobnoustrojów, w reakcjach może dojść do całkowitego związania dezynfektanta i pozbawienia go skuteczności np. chlor stosowany do dezynfekcji wody jest wiązany przez zanieczyszczające ją związki organiczne tak, że efektywne stężenie dezynfektanta jest znacznie niższe od zastosowanego.

2. Środek dezynfekcyjny może dawać, w wyniku reakcji ze związkami organicznymi związek nierozpuszczalny, czego skutkiem jest jego wypadanie z roztworu i wyeliminowanie ze środowiska.

3. Eliminacja środka dezynfekcyjnego ze środowiska może być wynikiem jego adsorpcji przez mające postać zawiesiny lub koloidu substancje organiczne.

4. Tłuszcze, fosfolipidy, niektóre kationy i aniony mogą unieczynniać środek dezynfekcyjny poprzez jego eliminację ze środowiska

5. Związki organiczne mogą tworzyć wokół komórki bakteryjnej warstwę o mniejszej zawartości wody utrudniając dostęp środowiska dezynfekcyjnego do komórki.

Ad e) Duże znaczenie dla skuteczności dezynfekcji ma wilgotność środowiska, gdyż większość środków dezynfekcyjnych nie działa w środowisku suchym. Odpowiednia wilgotność umożliwia prawidłową kondensację czynnika dezynfekcyjnego na powierzchni komórek i wnikanie w głąb.

Ad f) Stężenie jonów wodorowych wpływa nie tylko bezpośrednio na organizm bakteryjny, lecz również na same środki odkażające, bowiem dla wielu substancji dezynfekcyjnych charakterystyczna jest mniejsza aktywność form zjonizowanych niż niezdysocjowanych, np. fenol w środowisku alkalicznym jest zdysocjowany, co poważnie obniża jego właściwości bakteriobójcze.

Istotnym problemem jest powstawanie drobnoustrojów opornych na środki dezynfekcyjne. Główną tego przyczyną jest stosowanie środków w stężeniach subtelnych. Przyczyną oporności może być adaptacja enzymatyczna. Enzymy indukcyjne biorące udział w rozkładzie środka dezynfekcyjnego powstają w komórce dopiero po zetknięciu się z odpowiednim związkiem lub jego analogiem. W okresie adaptacji wzrost bakterii ustaje, część bakterii zamiera, natomiast te, które przeżyły mają zdolność do enzymatycznego rozkładu (biodegradacji) dezynfektanta. Poddając dostatecznie dużą populację bakterii działaniu czynnika szkodliwego, jakim są środki dezynfekcyjne, wśród przeżywających komórek znajdujemy mutanty charakteryzujące się zwiększoną opornością na stosowany czynnik, w stosunku do komórki macierzystej.

Do najczęściej stosowanych chemicznych środków dezynfekcyjnych zaliczamy:

1) Kwasy i zasady - silne środki dezynfekcyjne - zabijają formy wegetatywne oraz formy przetrwalne. Stosowanie ich jest jednak ograniczone ze względu na niszczące działanie na przedmioty i materiały.

Zastosowanie znalazły :

1. mleko wapienne w postaci 20% zawiesiny wodorotlenku wapnia,

2. 10% roztwory zasad do dezynfekcji powierzchniowej,

3. 1-10% gorące roztwory węglanu sodu do dezynfekcji szkła laboratoryjnego,

4. mydła, zwłaszcza bardziej alkaliczne mydło szare, których skuteczność zwiększają nienasycone kwasy tłuszczowe,

2) Środki utleniające

Do grupy tej należą chlorowce i ich pochodne. Mechanizm ich działania polega na wydzielaniu zjonizowanego chlorowca lub tlenu po zetknięciu się z komórką.

Są to:

1. podchloryny zawierające około 20% czynnego chloru,

2. chloraminy nieorganiczne oraz organiczne jak np. chloramina T zawierająca 12, 5% czynnego chloru, chloramina T zawierająca 29,5% czynnego chloru. Są to związki dobrze rozpuszczalne w wodzie , mało wrażliwe na światło, trwałe w temp. pokojowej, których działanie bakteriobójcze jest najsilniejsze przy pH 6- 6,2. Do dezynfekcji

rąk np. stosuje się 0,6 - 1% roztwory chloramin. Do odkażania powierzchni podłóg i

stołów 5% roztwór. Do odkażania wody wystarczy 1mg/ dm³.

3. odpowiednie roztwory nadmanganianu potasu,

4. 3% woda utleniona,

5. 10% roztwór jodu (jodyna) lub połączenia organiczne jodu. Związki tego typu niszczą wirusy, bakterie i pierwotniaki,

6. ozon działający bakterio- i wirusobójczo, stosowany do dezynfekcji wody.

3) Sole metali ciężkich

Działają one zabójczo na drobnoustroje, zwłaszcza przy dłuższym czasie działania i przy zastosowaniu wyższych stężeń. W niższych stężeniach działanie niektórych metali ma charakter bakteriostatyczny. Ponieważ metale ciężkie są toksyczne dla organizmów wyższych, ich stosowanie jako dezynfektantów jest ograniczone. Pewne zastosowania znajdują związki organiczne rtęci jak merkurochrom, a także sole srebra.

4) Alkohole

Mechanizm ich działania polega na denaturacji białek komórkowych, przy czym wpływ ma tu obecność wody, dlatego lepiej działają 60- 70 % roztwory alkoholu niż 90%. Jako środek dezynfekcyjny używany jest:

1. alkohol etylowy w stęż. 70% do odkażania skóry i w mieszaninie z innymi związkami do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych,

2. 70% mieszanina złożona w 50 % z etanolu i 20% propanolu,

3. alkohol izopropylowy, benzylowy oraz glikol stosowane do dezynfekcji powietrza.

5) Związki fenolowe i pochodne fenolu

Fenole i ich pochodne mają działanie bakteriobójcze. Fenole niszczą bakterie, ale i grzyby. Największą aktywność dezynfekcyjną mają w środowisku kwaśnym. Fenol jest związkiem toksycznym i drażniącym, z tego względu nie jest obecnie stosowany do dezynfekcji. Zastosowanie znajduje natomiast szereg związków fenolu.

1. mieszanina związków fenolowych i szarego mydła zwana lizolem stosowana w 3-10% roztworze

2. alkilowe pochodne fenoli o działaniu dezynfekcyjnym, tym silniejszym im dłuższy jest łańcuch alkilowy

3. izomery drugo- i trzeciorzędowe, chlorofenole oraz arylofenole

4. cały szereg preparatów handlowych zawierających chloroheksydyny. Chloroheksydyna działa na bakterie gramdodatnie i gramujemne, drożdżaki i wirusy.

6) Czwartorzędowe związki amoniowe

Są to związki działające na wirusy, bakterie, drożdże i grzyby. Związki te charakteryzują się wysoką aktywnością powierzchniową. W wodzie ulegają dysocjacji na kompleksowe kationy i ujemnie naładowany jon chlorowca, który wzmaga aktywność bakteriobójcza. W użyciu znajduje się cały szereg preparatów zawierających różne stężenia związków amoniowych (np.Sterinol)

7) Aldehydy

W praktyce stosuje się aldehyd glutarowy i formaldehyd. Formaldehyd stosowany jest w 5% roztworze. Ma silne działanie bakteriobójcze pod warunkiem, że temperatura środowiska będzie niższa niż 40⁰ C. Roztworem 40 % posługują się laboratoria i prosektoria. Materiały biologiczne utrwala się roztworem formaldehydu. Ponadto może on służyć do gazowej dezynfekcji pomieszczeń w stężeniu 1-2 mg/ dm³ powietrza. Dla skuteczności dezynfekcji powietrza formaldehydem konieczna jest duża wilgotność sięgająca 80%

Do fizycznych czynników dezynfekcji należy promieniowanie UV, które stosuje się głównie do dezynfekcji powietrza i dostępnych powierzchni. Silne działanie przeciwbakteryjne wykazuje promieniowanie o długości fali 240 - 280 nm (szczególnie 260 - 270 nm). Jednakże poszczególne gatunki i formy drobnoustrojów wykazują różną wrażliwość na działanie tego promieniowania. Metoda dezynfekcji powietrza promieniami nadfioletowymi jest skuteczna przy zachowaniu odpowiednich warunków i zależy od szeregu czynników:

1. stopnia zanieczyszczenia powietrza cząstkami mechanicznymi,

2. objętości napromieniowanego powietrza,

3. intensywności ruchu powietrza,

4. długości fal emitowanych przez promiennik,

5. czasu napromieniowania,

6. bezpośredniego padania promieniowania,

7. wilgotności powietrza,

8. odległości, na jaką działają promienie.

Stosując odpowiednią dawkę promieniowania UV można uzyskać nawet efekt całkowitego wyjałowienia (sterylizacji).

Temat 6: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów (1)

Dzięki hodowli można w warunkach laboratoryjnych (in vitro) namnażać drobnoustroje żyjące w środowisku naturalnym. Aby założyć hodowlę drobnoustrojów należy wprowadzić je do sterylnej pożywki, czyli posiać. Posiewane mikroorganizmy określa się mianem inokulum lub zaszczepu. Nie zawsze znamy skład drobnoustrojów tworzących zaszczep, np. kiedy posiewamy próbę środowiskową, w której zwykle znajduje się wiele różnorodnych bakterii i grzybów (woda, ścieki, gleba itp.). Posiane drobnoustroje inkubuje się, czyli przetrzymuje w pożywce określony czas (czas inkubacji), w określonej temperaturze (temperatura inkubacji). Podczas inkubacji posiane komórki rosną i dzielą się. Trzeba jednak wspomnieć, że są drobnoustroje, które nie rosną na żadnych pożywkach i nie można ich hodować, np. krętek blady, wywołujący kiłę lub prątek trądu.

Różne mogą być cele posiewu, a więc i założonej hodowli:

• wyizolowanie określonych drobnoustrojów z prób środowiskowych (wody, gleby), w tym uzyskanie czystych szczepów, czyli zbiorów komórek pochodzących z jednej komórki macierzystej, z zamiarem ich dalszych badań (m.in. identyfikacji),

• namnożenie komórek już wyizolowanego i zidentyfikowanego szczepu, np. w celu pozyskania pewnych produktów jego metabolizmu, lub zbadania jego zdolności do rozkładu określonych zanieczyszczeń,

• policzenie komórek wchodzących w skład posiewanej próby.

Pożywka, w której prowadzi się hodowlę określonych drobnoustrojów musi zaspokajać ich wymagania odżywcze. Poza tym hodowla powinna być prowadzona w optymalnych dla wzrostu warunkach środowiskowych, takich jak temperatura, odczyn, natlenienie, ciśnienie osmotyczne.

Wymagania pokarmowe.

Wszystkie bakterie i grzyby potrzebują do wzrostu i rozmnażania się źródła energii, węgla, azotu i wielu innych składników pokarmowych. Określa to łatwy do zapamiętania skrót CHOPKNS, będący szeregiem symboli chemicznych najważniejszych pierwiastków. Oprócz wymienionych składników, w każdej pożywce niezbędna jest również obecność żelaza, magnezu oraz tzw. pierwiastków śladowych, koniecznych w bardzo małych stężeniach (np. Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).

Na szczególną uwagę zasługuje zapotrzebowanie na źródło energii i węgla. W przypadku mikroorganizmów autotroficznych źródłem energii jest promieniowanie słoneczne (fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych związków nieorganicznych (chemoautotrofy), źródłem węgla natomiast obecny w atmosferze CO₂. Dlatego pożywki do hodowli autotrofów nie muszą zawierać związków węgla.

Dla heterotrofów natomiast źródłem energii i węgla są związki organiczne. Pod względem zapotrzebowania na związki organiczne mikroorganizmy dzieli się na dwie grupy:

• prototrofy, wymagające do wzrostu tylko jednego rodzaju związku węgla,

• auksotrofy, wymagające przynajmniej dwóch rodzajów związków węgla.

Prototrofy są wyjątkowo uzdolnione metabolicznie, gdyż potrafią wszystkie potrzebne składniki komórkowe zsyntetyzować z często bardzo prostych, nawet jednowęglowych związków wyjściowych, np. metanu czy mrówczanu. Są to przede wszystkim drobnoustroje żyjące w środowisku ubogim w składniki pokarmowe (woda, gleba), ale są wśród nich również mieszkańcy środowisk bogatych w pokarm, np. występująca powszechnie w jelicie człowieka pałeczka okrężnicy (Escherichia coli).

Auksotrofami są często drobnoustroje żyjące w innych organizmach, np. liczne bakterie i grzyby chorobotwórcze. Występuje wśród nich duża rozpiętość wymagań pokarmowych, od jednego dodatkowego związku (np. pałeczka duru brzusznego Salmonella typhi wymaga aminokwasu tryptofanu) po liczne aminokwasy, zasady purynowe, pirymidynowe i witaminy potrzebne bakteriom fermentacji mlekowej.

W mikrobiologii stosuje się różne rodzaje pożywek, w zależności od celu badań. Ze względu na konsystencję można je podzielić na:

• płynne,

• stałe,

• półpłynne.

Pożywki płynne stosowane są zwykle do namnażania w celu otrzymania dużej biomasy komórek i pozyskiwania produktów ich metabolizmu. Przykładem może być bulion odżywczy, jedna z najczęściej używanych pożywek. Bulion jest mieszaniną peptonu (produktu enzymatycznej hydrolizy białek), wyciągu mięsnego (ekstraktu zawierającego m.in. zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ciśnienia osmotycznego. Na bulionie dobrze rosną mikroorganizmy o średnich wymaganiach pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojów żyjących w środowiskach ubogich w pokarm (glebowych i wodnych), jest on zbyt bogatą pożywką, hamującą ich rozwój. Z kolei dla bardzo wymagających bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi być wzbogacony, np. o krew lub wyciąg drożdżowy. Tego typu pożywki określa się mianem wzbogaconych (patrz niżej).

Pożywki stałe stosuje się głównie do izolacji czystych szczepów, przechowywania ich, do badań morfologii kolonii, oraz w badaniach ilościowych (określaniu liczby komórek w próbie). Do zestalania pożywek płynnych używa się głównie agar, a także żelatynę. W przypadku hodowli niektórych bakterii autotroficznych, wrażliwych na większe stężenia związków organicznych, stosuje się żel krzemionkowy, którym zestala się pożywkę mineralną.

Agar jest mieszaniną dwóch polisacharydów: agarozy i agaropektyny, które są polimerami galaktozy. Jest on wytwarzany przez pewne glony morskie z grupy krasnorostów, jako składnik ich ścian komórkowych. Produkuje się go w postaci proszku lub granulek. Po wymieszaniu z wodą i podgrzaniu do temp. 95-98⁰C agar rozpuszcza się, a w trakcie schładzania zachowuje swoją płynną konsystencję do temperatury ok. 45-48⁰C, kiedy krzepnie przechodząc w galaretowaty żel. Sam agar (tzw. agar-agar) nie jest pożywką dla większości bakterii, gdyż nie potrafią go rozkładać. Jest on używany wyłącznie do zestalania pożywek płynnych (w ilości 1,5-2 %). Dodany do bulionu odżywczego tworzy tzw. agar odżywczy, w skrócie MPA.

Żelatyna, czyli tzw. klej kostny, jest białkiem otrzymywanym w wyniku dłuższego gotowania odpadków zawierających kolagen (skóra, kości). Wadą żelatyny jako podłoża mikrobiologicznego jest to, że rozpuszcza się ona już w temp. ok. 30-35⁰C, a więc poniżej temperatury inkubacji wielu drobnoustrojów. Niektóre bakterie i grzyby potrafią rozkładać żelatynę upłynniając ją, co jest wykorzystywane w badaniach diagnostycznych (identyfikacyjnych).

Pożywki półpłynne mają konsystencję pośrednią między pożywkami płynnymi a stałymi, i zawierają 0,15-0,2 % agaru. Służą one do badania zdolności ruchu u bakterii. Po zaszczepieniu słupka z agarem półpłynnym, bakterie zdolne do ruchu będą się przemieszczać i, dzięki małej gęstości agaru, zasiedlą całą objętość pożywki. W efekcie licznych podziałów, po okresie inkubacji powstanie zmętnienie w całej objętości słupka agarowego. W przypadku bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziały komórkowe spowodują jedynie wzrost wzdłuż linii wkłucia.

Inny podział pożywek uwzględnia wymagania odżywcze drobnoustrojów:

• pożywki proste,

• pożywki wzbogacone,

• pożywki specjalne,

• pożywki wybiórcze (selektywne),

• pożywki wybiórczo-namnażające,

• pożywki wybiórczo-różnicujące.

Pożywki proste zaspokajają niskie i średnie wymagania pokarmowe mikroorganizmów. Należą tu m.in. omówione wyżej bulion i agar odżywczy. Stanowią one podstawę dla innych, bardziej złożonych pożywek.

Pożywki wzbogacone stosuje się do hodowli bardziej wymagających drobnoustrojów chorobotwórczych (np. paciorkowców i gronkowców), przystosowanych do życia w bogatym w substancje odżywcze środowisku wnętrza organizmu żywiciela. Czynnikiem wzbogacającym może być odwłókniona krew (często barania), wyciągi z narządów zwierzęcych, np. wątroby, wyciąg z drożdży, hydrolizat kazeiny - głównego białka mleka i inne.

Pożywki specjalne służą do hodowli drobnoustrojów o szczególnych wymaganiach odżywczych, takich jak prątki gruźlicy, dwoinki rzeżączki czy maczugowce błonicy. Używa się w nich wysokowartościowych składników odżywczych (żółtka jaj kurzych, surowice, witaminy).

Pożywki wybiórcze umożliwiają wzrost określonym drobnoustrojom (które chcemy wyizolować z próby) dzięki stworzeniu im sprzyjających warunków wzrostu lub dodanie składnika hamującego wzrost niepożądanych mikroorganizmów. Przykładem może być pożywka umożliwiająca wyosobnienie z gleby bakterii Azotobacter, wiążącej azot atmosferyczny. W pożywce tej nie ma związku zawierającego azot, pierwiastek niezbędny do wzrostu wszystkim komórkom. Tylko drobnoustroje zdolne do asymilacji (przyswojenia) azotu cząsteczkowego (N₂) z powietrza mogą na takiej pożywce rosnąć. Poza tym, zawiera ona mannitol, ulubione źródło węgla bakterii Azotobacter. Innym przykładem mogą być pożywki zakwaszone, które są wybiorcze dla grzybów. Obniżony odczyn hamuje wzrost większości bakterii, które zwykle preferują odczyn obojętny lub lekko zasadowy, natomiast grzyby jako mikroorganizmy kwasolubne dobrze rosną i dzielą się na takich podłożach.

Pożywki wybiórczo-namnażające są często pożywkami płynnymi i umożliwiają nie tylko wyosobnienie określonego drobnoustroju (który zwykle występuje w znikomej ilości), ale też namnożenie go do dużej biomasy umożliwiającej dalsze badania (np. identyfikacyjne). Przykładem może być podłoże z kwaśnym selenianem sodowym, stosowane do izolacji pałeczek Salmonella np. z produktów żywnościowych lub gleby (selenian jest tu czynnikiem hamującym wzrost drobnoustrojów gramdodatnich, a zwłaszcza ziarniaków).

Pożywki wybiórczo-różnicujące umożliwiają nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom, ale też pozwalają je zróżnicować. Przykładem może być pożywka Endo, często stosowana w sanitarnych badaniach środowiska. Pozwala ona rosnąć jedynie bakteriom gramujemnym, czyli jest dla nich wybiórcza (obecność w podłożu fuksyny hamuje rozwój bakterii gramdodatnich), ale też umożliwia zróżnicowanie wyrosłych bakterii na zdolne, i nie zdolne do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru powstaje bowiem aldehyd octowy, który daje czerwone zabarwienie po połączeniu się z fuksyną (dotąd bezbarwną, bo zredukowaną przez siarczyn sodu, również dodawany do pożywki). Dlatego bakterie fermentujące laktozę (jak pałeczka okrężnicy) tworzą kolonie koloru czerwonego z metalicznym (tzw. fuksynowym) połyskiem, a nie zdolne do fermentacji - koloru różowego lub bezbarwne.

Pożywki dzieli się też na:

• syntetyczne (o ściśle zdefiniowanym składzie ilościowym i jakościowym),

• naturalne (o nie znanym dokładnie składzie, na bazie składników pochodzenia naturalnego, np. wyciąg z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, krew, mleko itp.),

• półsyntetyczne (pożywka mineralna o znanym składzie, plus składniki pochodzenia naturalnego, o nie sprecyzowanym dokładnie składzie).

Temperatura

Drobnoustroje wykazują duże zróżnicowanie wymagań termicznych, które muszą być uwzględnione podczas hodowli. Dla każdego mikroorganizmu można określić trzy tzw. temperatury kardynalne:

• minimalną, poniżej której wzrost komórek i podziały nie występują,

• optymalną, w której komórki rosną i dzielą się najszybciej,

• maksymalną, powyżej której wzrost i podziały nie zachodzą.

Temperatury niższe od minimalnych i wyższe od maksymalnych nie muszą być dla drobnoustrojów zabójcze, zawsze jednak hamują ich rozwój. Punkty kardynalne nie zawsze oznaczają ściśle określonej temperatury. Może to być pewien (zwykle wąski) zakres temperatur, zależny od innych czynników, np. od odczynu podłoża. Temperatura inkubacji hodowli zwykle pokrywa się z temperaturą optymalną dla danego drobnoustroju. Aby zachować właściwą temperaturę podczas rozwoju hodowli, prowadzi się ją w tzw. cieplarkach, czyli szafkach zaopatrzonych w urządzenie termostatowe umożliwiające nastawienie odpowiedniej temperatury i utrzymanie jej.

Punkty kardynalne są podstawą do podziału mikroorganizmów na trzy podstawowe grupy:

• psychrofilne (zimnolubne), o temperaturze optymalnej ok. 20⁰C (minimum ok. -10⁰C, maksimum ok. 30⁰C),

• mezofilne (średniotemperaturowe), o optimum w 37⁰C (minimum 15⁰C, maksimum 45⁰C),

• termofilne (ciepłolubne), o optimum w 55⁰C (minimum 30⁰C, maksimum 75⁰C).

Psychrofilami jest większość drobnoustrojów żyjących w środowisku wodnym i glebowym.

Mezofilami są głównie drobnoustroje żyjące w ciele (i na ciele) zwierząt stałocieplnych (ptaki i ssaki). Są wśród nich zarówno gatunki chorobotwórcze, jak i niechorobotwórcze (saprofityczne) tworzące tzw. mikroflorę organizmu.

Do mikroorganizmów termofilnych należą głównie gramdodatnie laseczki i ziarenkowce. Występują one np. w fermentujących resztkach roślinnych, np. w oborniku, kompoście, stogach siana, w nawozie, gorących źródłach itp. Istnieje też grupa mikroorganizmów prokariotycznych zwana archeonami (do niedawna zaliczana do bakterii), która żyje w warunkach ekstremalnych, gdzie temperatura przekracza 100⁰C. Chodzi o tzw. kominy termalne na dnie oceanów. Drobnoustroje żyjące w tak wysokich temperaturach określa się mianem ekstremalnych termofili.

Odczyn

Podobnie jak w przypadku temperatury (i innych czynników środowiska), tu również wyróżnia się dla każdego drobnoustroju wartość optymalną odczynu, jego minimum i maksimum. Odpowiednie stężenie jonów wodorowych (którego ujemny logarytm oznacza się jako pH) ma poważny wpływ na rozwój komórek. Większość bakterii preferuje odczyn obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 - 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku kwaśnym (pH ok. 5,2 - 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn dość szybko się zmienia, z powodu powstawania produktów przemiany materii. Aby utrzymać optymalny odczyn, pożywki przygotowuje się na bazie odpowiednich buforów

Natlenienie

Pod względem stosunku do tlenu mikroorganizmy dzieli się na:

• Bezwzględne tlenowce (bezwzględne aeroby),

• Bezwzględne beztlenowce (bezwzględne anaeroby),

• Względne beztlenowce (względne anaeroby),

• Mikroaerofile.

Bezwzględne tlenowce, jak sugeruje ich nazwa, wymagają warunków tlenowych w stężeniu atmosferycznym (20%). W hodowli nie napowietrzanej na pożywce płynnej (np. bulionie), rosną tylko na powierzchni, w postaci kożuszka, pozostawiając pożywkę przezroczystą (np. laseczki z rodzaju Bacillus i wiele grzybów). W głębi pożywki mogą one rosnąć jedynie w warunkach napowietrzania.

Bezwzględne beztlenowce nie tolerują tlenu, ponieważ w jego obecności powstaje w procesach metabolizmu nadtlenek wodoru (H₂O₂), związek silnie utleniający, a drobnoustroje te nie wykazują aktywności katalazowej (katalaza jest enzymem rozkładającym H₂O₂). Przykładem bezwzględnych beztlenowców są niektóre laseczki z rodzaju Clostridium, np. laseczka tężca (C. tetani). Hodowla takich bakterii wymaga usunięcia tlenu z pożywki, co można osiągnąć różnymi metodami (patrz niżej).

Względne beztlenowce mogą rozwijać się zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Przykładem może być pałeczka okrężnicy (Escherichia coli), pospolity mieszkaniec jelita grubego człowieka. W nie napowietrzanej hodowli bulionowej rośnie ona w całej objętości pożywki (a więc w miejscach o różnym stopniu natlenienia) tworząc jednolite zmętnienie. Ten typ wzrostu określa się jako dyfuzyjny.

Mikroaerofile to drobnoustroje wymagające do wzrostu tlenu, ale w niewielkim stężeniu, dlatego w nie napowietrzanej hodowli na pożywce płynnej tworzą zmętnienie tylko na pewnej głębokości pożywki, gdzie stężenie tlenu jest odpowiednio niskie. Przykładem mogą być bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus.

Aby zapewnić dobre natlenienie hodowli, stosuje się wytrząsanie (w hodowlach płynnych), doprowadzanie powietrza za pomocą pompki membranowej (w każdym typie hodowli) oraz zapewnienie możliwie dużych powierzchni wymiany gazów (szczególnie w przypadku hodowli na podłożach stałych).

Warunki beztlenowe w hodowli można osiągnąć różnymi metodami, m.in. przez:

• zagotowanie pożywki bezpośrednio przed posiewem,

• wprowadzenie na powierzchnię pożywki płynnej warstwy sterylnej parafiny,

• posiew wgłębny w podłożu zestalonym,

• dodanie do pożywki związków redukujących, które obniżają potencjał oksydacyjno-redukcyjny (kwas askorbinowy, tioglikolan sodu),

• hodowlę w jednym naczyniu hodowlanym (szczelnie zamkniętym) tlenowców i beztlenowców (tlenowce zużywają tlen i stwarzają warunki beztlenowe),

• hodowlę w tzw. anerostatach, w których powietrze jest usuwane np. pompką wodną, a w jego miejsce wprowadzany gaz obojętny, np. azot,

Ciśnienie osmotyczne

Większość drobnoustrojów może rosnąć tylko przy określonym stężeniu soli, w roztworze izotonicznym (stężenie soli na zewnątrz i wewnątrz komórki są sobie równe). Komórki w roztworze hipotonicznym, gdy stężenie soli na zewnątrz komórki jest mniejsze i woda ma tendencje do wnikania do wnętrza, mogą ulec pęknięciu (dzięki ścianie komórkowej udaje im się jednak wytrzymać określony napór wody). Z tego powodu do rozcieńczania prób w mikrobiologii nie stosuje się wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny będący 0,85% roztworem NaCl. W roztworach hipertonicznych (stężenie na zewnątrz jest większe) przeżywalność komórek zależy od zdolności do przeciwstawiania się wypływowi wody i wysuszeniu. Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania większych stężeń soli (do ok. 15%) określane są mianem osmotolerancyjnych (np. gronkowce), natomiast te, które wytrzymują jeszcze wyższe stężenia to tzw. osmofile lub halofile (niektóre archeony).

Rodzaje hodowli.

Hodowle dzieli się zwykle na:

• statyczne (okresowe),

• ciągłe,

• zsynchronizowane.

W hodowli statycznej mikroorganizmy posiane do pożywki rosną i rozmnażają się do czasu wyczerpania się składników pokarmowych lub (i) nagromadzenia się toksycznych produktów przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji bakterii przebiega w kilku charakterystycznych fazach, które można zobrazować na wykresie w postaci tzw. krzywej wzrostu:

• faza zastoju,

• faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),

• faza stacjonarna,

• faza zamierania.

W fazie zastoju w zaszczepionych komórkach (inokulum) zachodzą procesy adaptacji polegające na syntezie potrzebnych enzymów, replikacji DNA, syntezie białek i w efekcie komórki zwiększają swoje rozmiary. Długość tej fazy zależy od podobieństwa warunków hodowli poprzedniej (z której pochodzi inokulum) do warunków panujących w nowej hodowli. Im jest ono większe, tym faza jest krótsza.

W fazie wzrostu logarytmicznego komórki zaczynają się dzielić. Sygnałem do podziałów jest osiągnięcie przez komórki odpowiedniej długości. Każda komórka dzieli się na dwie. Po określonym czasie wzrostu powstałe komórki znowu dzielą się na dwie, stąd liczbę powstałych komórek (czyli wzrost populacji) określa wzór 2ⁿ, gdzie n - to liczba podziałów, która jest równoznaczna z liczbą pokoleń. Czas między dwoma kolejnymi podziałami, to tzw. czas generacji lub wiek osobniczy. Zależy on od warunków hodowli i od cech gatunkowych drobnoustroju. W konkretnej hodowli jest on więc stały. Jeśli liczba komórek w inokulum wynosi N₀, to powstała liczba komórek N po n pokoleniach wyniesie N = N₀ x 2ⁿ. Liczba bakterii podwaja się co każdy okres generacji, rośnie więc wykładniczo z upływem czasu. Do czasu hodowli proporcjonalny jest więc logarytm liczby bakterii, a nie sama ich liczba. Stąd nazwa - faza logarytmiczna.

W fazie stacjonarnej obserwuje się spadek przyrostu liczby bakterii, w wyniku zamierania części komórek z powodu wyczerpywania się składników pokarmowych, tlenu i wytwarzania produktów przemiany materii. Zamieranie to jest w pewnej równowadze z dzieleniem się innych komórek

Z czasem komórek zamierających jest więcej i dochodzi do spadku ogólnej liczby komórek - hodowla się przerzedza i z czasem zamiera.

Jednak opisana sekwencja zdarzeń w hodowli może być inna. Jeśli tylko zapewni się usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Na tym właśnie polega hodowla ciągła. Jest więc ona, w przeciwieństwie do hodowli statycznej, układem otwartym, z ciągłym przepływem pożywki (zużytej i świeżej). Prowadzi się ją w tzw. chemostatach, umożliwiających kontrolowanie wzrostu komórek za pomocą dozowania odpowiednich ilości pożywki i regulowania szybkości przepływu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie stanu równowagi, w którym zagęszczenie komórek jest stałe. Ma to duże znaczenie w badaniach procesów fizjologicznych drobnoustrojów, kiedy niezbędne są warunki stabilne. Hodowle ciągłe są wykorzystywane m.in. w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji określonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotyków) i biomasy (np. drożdży). Hodowle w procesach produkcyjnych prowadzi się w bioreaktorach (fermentorach). Rodzajem hodowli ciągłej jest również biologiczna oczyszczalnia ścieków, w której hoduje się bakterie (jako tzw. osad czynny) na bazie pożywki, jaką stanowią ciągle dopływające ścieki.

Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w której komórki dzielą się równocześnie (czyli synchronicznie), w przeciwieństwie do innych hodowli, gdzie podziały komórek są nieskoordynowane. Dzięki jednoczesności podziałów, zmiany w hodowli synchronicznej są odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komórce. Umożliwia to badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle nieuchwytnych ze względu na zbyt małą czułość metod badawczych. Zsynchronizowanie podziałów można osiągnąć wieloma metodami, m.in. przez szok wywołany niską temperaturą. Bakterie przenosi się na ok. 15 - 60 min. do temperatury dużo niższej od optymalnej. W tych warunkach dochodzi do zrównania stanu fizjologicznego komórek, które przeniesione do temperatury optymalnej, równocześnie zaczynają podziały komórkowe. Osiągnięta synchronizacja nie jest trwała i, jeśli nie jest utrzymywana, szybko spontanicznie zanika.

TEMAT 8: Analiza mikrobiologiczna wody

Dlaczego kontrolujemy jakość sanitarną wody?

Możliwość zakażenia ludzi przez wodę zmusza do stałej kontroli higieniczno-sanitarnej, zarówno wody przeznaczonej do picia, jak też i wody w basenach kąpielowych, a nawet w zbiornikach wód powierzchniowych. Przyczyną zakażeń są mikroorganizmy chorobotwórcze wydalane przez ludzi chorych i nosicieli (osobnicy, którzy po przebyciu choroby wydalają zarazki jeszcze przez długi czas z kałem lub moczem). Zarazki występują w ściekach i w wodach powierzchniowych w znacznie mniejszych ilościach niż pozostałe drobnoustroje. Z tego też względu znacznie trudniej jest je wykryć niż występujące masowo w wodzie bakterie saprofityczne, tym bardziej, że w celu ich wykrycia konieczne jest stosowanie znacznie bardziej skomplikowanych metod diagnostycznych.

Co to są mikroorganizmy wskaźnikowe?

Obowiązujące normy oparte są na pośrednim wnioskowaniu o obecności mikroorganizmów chorobotwórczych na podstawie liczebności w wodzie bakterii wskaźnikowych, które stale żyją jako saprofity w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt wyższych. Ich obecność w wodzie świadczy o jej zanieczyszczeniu fekalnym, a zatem również o niebezpieczeństwie zakażenia wody mikroorganizmami chorobotwórczymi.

Bakterie pełniące rolę wskaźników sanitarnych powinny spełniać następujące warunki:

• muszą być stale obecne w przewodzie pokarmowym człowieka, co pozwala zawsze na wykrycie kałowego zanieczyszczenia wody

• do grupy organizmów wskaźnikowych powinny należeć także formy nie przetrwalnikujące, co umożliwia wykrycie świeżego fekalnego zanieczyszczenia wody

• ich identyfikacja musi być możliwa przy użyciu łatwo dostępnych metod

• długość życia bakterii wskaźnikowych w środowisku zewnętrznym musi być większa niż długość życia gatunków chorobotwórczych

• liczebność bakterii wskaźnikowych w jelicie człowieka i kale powinna być duża

• nie powinny się one rozmnażać w środowisku wodnym.

Jakie bakterie wskaźnikowe wykorzystywane są do oceny jakości zdrowotnej wody?

W rutynowej pracy laboratoriów, prowadzących nadzór sanitarno - epidemiologiczny, niemożliwe jest stałe badanie wody w kierunku wykrywania wszystkich drobnoustrojów chorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych, które mogą w niej występować. Dlatego też badania rutynowe koncentrują się przede wszystkim na wykrywaniu bakterii wskazujących na kałowe zanieczyszczenie wody. Do oceny jakości sanitarnej wody wykorzystywana jest mikroflora saprofityczna zasiedlająca jelito grube człowieka. Przyjęto następujące wskaźniki fekalnego zanieczyszczenia wody:

• -Escherichia coli

• -bakterie grupy coli,

• -paciorkowce kałowe (Enterokoki),

• -laseczki z rodzaju Clostridium ( Clostridium perfringens), redukujące siarczyny

oraz w niektórych przypadkach

• gronkowce koagulazo-dodatnie

• Pseudomonas aeruginosa

• Legionella sp.

Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli)

Fakultatywnie tlenowa, Gram-ujemna pałeczka należąca do rodziny Enterobacteriaceae. Wchodzi w skład fizjologicznej flory bakteryjnej jelita grubego człowieka oraz zwierząt stałocieplnych. W jelicie spełnia pożyteczną rolę, uczestnicząc w rozkładzie pokarmu, a także przyczyniając się do produkcji witamin z grupy B, C oraz K. E. coli spotyka się również w glebie i wodzie, gdzie trafiają z wydzielinami i kałem. Bakterie te, zwykle nieszkodliwe w jelicie, mogą jednak powodować groźne schorzenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych, a ostatnio często dróg oddechowych.

Bakterie z grupy coli

Bakterie grupy coli to przede wszystkim szczepy Escherichia coli oraz drobnoustroje z rodzaju Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella. Wykrywane są one na podłożach z laktozą po inkubacji w temperaturze 37 ^oC.

Bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) to głównie szczepy Escherichia coli i tylko te nieliczne szczepy z rodzajów Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella, które mają zdolność fermentacji laktozy w temperaturze 44 ^oC.

Obecność w badanej próbce wody bakterii grupy coli lub bakterii grupy coli typu kałowego świadczy o stosunkowo świeżym zanieczyszczeniu wody kałem, ściekami, glebą lub gnijącym materiałem roślinnym. W zasadzie dla większości rodzajów wód zalecane jest oznaczanie liczby bakterii obu grup coli.

Paciorkowce kałowe

Paciorkowce kałowe to grupa bakterii kulistych lub owalnych, występujących w postaci komórek pojedynczych, dwoinek lub krótkich łańcuszków. Obejmuje ona drobnoustroje z rodzajów: Enterococcus i Streptococcus należące do grupy serologicznej Lancefield D, m. in. Streptococcus faecalis, S. faecium, S. equinus i S. bovis. Występują one powszechnie w kale ludzi i zwierząt. Stwierdzenie obecności paciorkowców kałowych w badanej próbie świadczy o jej kontakcie z zanieczyszczeniami typu kałowego, podobnie jak obecność bakterii grupy coli. Występowanie enterokoków w liczbie znacznie przewyższającej liczbę bakterii grupy coli, sugerować może zanieczyszczenie wody kałem zwierzęcym lub ściekami, pochodzącymi z ferm hodowlanych. Paciorkowce fekalne na ogół charakteryzuje dłuższa przeżywalność w wodzie oraz większa odporność na działanie chloru niż bakterie grupy coli.

Najważniejsze cechy charakterystyczne tej grupy bakterii to:

- zdolność wzrostu w temperaturze 45^oC, w obecności 40% żółci oraz obecności azydku sodowego;

- zdolność wzrostu w temperaturze 10^oC ( z wyjątkiem S. bovis i S. equinus) przy pH 9,6, w

obecności 6,5% chlorku sodowego;

- ujemny test na katalazę oraz barwienie dodatnie w metodzie Grama.

Laseczki z rodzaju Clostridium

O starym, odległym w czasie zanieczyszczeniu kałowym może świadczyć wykrycie w badanej próbce wody bakterii redukujących siarczyny (głównie szczepy Clostridium perfringens); ich przetrwalniki mogą zachować żywotność przez wiele lat w niesprzyjających warunkach. Clostridia redukujące siarczyny są też bardzo dobrym wskaźnikiem prawidłowości prowadzonych procesów uzdatniania wody, takich jak koagulacja, sedymentacja i filtracja. Przetrwalniki tych bakterii, a wraz z nimi również cysty pasożytniczych pierwotniaków (Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia) powinny być wyeliminowane właśnie w tych etapach uzdatniania wody, gdyż są one bardzo oporne na działanie środków dezynfekcyjnych. Wykrycie bakterii z rodzaju Clostridium jest technicznie znacznie bardziej proste od poszukiwania pierwotniaków pasożytniczych i daje dużą pewność, że woda uzdatniona jest wolna od pierwotniaków i jaj robaków chorobotwórczych (helmintów).

Pseudomonas aeruginosa

Obok wymienionych elementów analizy sanitarnej proponuje się obecnie dodatkowo wykrywanie bakterii z gatunku Pseudomonas aeruginosa w wodzie do picia i na potrzeby gospodarcze a także w wodzie dla zakładów kąpielowych oraz w wodach powierzchniowych. Przedstawicieli tego gatunku wyizolowano z kału ludzkiego oraz w przypadkach zakażeń organizmu - z dróg moczowych, ucha środkowego, ropiejących ran itp. Bakterie te stanowią potencjalny czynnik chorobotwórczy dla ludzi i zwierząt. Poza tym występują one powszechnie w wodach powierzchniowych i glebie. Warto także podkreślić, że mogą one bytować w chlorowanej wodzie, gdyż odznaczają się znaczną odpornością na zabiegi dezynfekcyjne.

Bakterie z rodzaju Legionella

Bakterie z rodzaju Legionella są to Gram ujemne pałeczki posiadające polarnie umieszczone wici w liczbie od 1 do 3. Do wzrostu potrzebują żelaza i cysteiny. Ich naturalnym rezerwuarem są wody śródlądowe i morskie. Licznie występują również w glebie i gorących źródłach wody. Wyizolowano do tej pory 46 gatunków z rodzaju Legionella, wśród których zidentyfikowano 70 grup serologicznych. Bakterie z rodzaju Legionella są wewnątrzkomórkowymi pasożytami pierwotniaków. Mogą również powodować nietypowe zapalenie płuc u ludzi, jak i gorączkę Pontiac. Szczególnie niebezpieczne dla człowieka są bakterie należące do gatunku Legionella pneumophila. Dostają się one do płuc w mikroaerozolach o średnicy 2,0 - 5,0 µm powstających np. w kabinach prysznicowych. Postaci płucnej legionellozy towarzyszy suchy kaszel, zaburzenia w oddychaniu, temperatura powyżej 40°C, zaburzenia świadomości. Śmiertelność wynosi 10-20% zachorowań. Rezerwuarem tych bakterii są systemy ciepłej wody i urządzenia wentylacyjne. Bakterie te mogą kolonizować wewnętrzne części rur z ciepłą wodą, zbiorniki na ciepłą wodę, wieże chłodnicze, perlatory zaworów czerpalnych (głowice natryskowe pryszniców).

Ogólna liczebność bakterii

W badaniach rutynowych określa się również ogólną liczbę bakterii, jako liczbę jednostek tworzących kolonie, w skrócie j.t.k.(odpowiednik angielski: cfu - colony forming units) obecnych w 1 ml wody, po wykonaniu posiewu próbki na agar odżywczy i inkubacji w temperaturach 22±2^oC przez 72 godz. (psychrofile), oraz w 36±2^oC przez 24 godz. (mezofile).

Ogólna liczebność bakterii psychrofilnych

W niższej temperaturze rosną przede wszystkim nie chorobotwórcze bakterie wodne. Należy jednak mieć na uwadze fakt, że Gram-ujemne bakterie wodne wytwarzają lipopolisachardy ściany komórkowej mogące działać toksycznie - tak jak endotoksyny bakterii chorobotwórczych. Z tego powodu ich liczba powinna być także monitorowana. Ponadnormatywny wzrost ich liczebności świadczyć może między innymi, o obecności w wodzie łatwo przyswajalnych związków organicznych. Teoretycznie, obecność w wodzie 0,1 mg węgla organicznego może spowodować wzrost liczby bakterii w 1 ml do 10⁸ j.t.k. (cfu). Również fosfor jest czynnikiem stymulującym wzrost drobnoustrojów. Dodanie niewielkiej ilości tego pierwiastka (<50mg/l) powoduje nawet 10-krotne przyspieszanie rozwoju bakterii w wodociągach.

Ogólna liczebność bakterii mezofilnych

Ze względów zdrowotnych, bardziej niebezpieczna jest ponadnormatywna liczba bakterii rosnących w temperaturze 37^oC, ponieważ mogą wśród nich być również bakterie chorobotwórcze. Duża ich liczba w badanej próbce wody, może świadczyć, między innymi, o źle przebiegających procesach uzdatniania lub zasysaniu zanieczyszczonej wody.

Co może być powodem zwiększenia ogólnej liczby bakterii w wodzie?

Zwiększenie ogólnej liczby bakterii obecnych w próbce wody może świadczyć o namnażaniu się drobnoustrojów na wewnętrznych powierzchniach instalacji wodnych, szczególnie na złączach rur i uszczelkach oraz tworzeniu się warstwy tzw. biofilmu. Przekroczenie dopuszczanego poziomu ogólnej liczby bakterii powinno być zawsze sygnałem do znalezienia przyczyny zanieczyszczenia i do podjęcia odpowiedniego postępowania. Niekiedy może istnieć konieczność dodatkowego chlorowania, np. wody do picia, powyżej 0,2 mg Cl₂/l. W niektórych przypadkach dopiero zmiany konstrukcyjne sieci wodociągowej i usunięcie biofilmu są w stanie skutecznie zabezpieczyć odbiorcę przed wzrostem liczebności drobnoustrojów w wodzie.

Kryteria jakości sanitarnej wody do picia w Polsce.

Jakość bakteriologiczna wody do picia w Polsce oceniana jest na podstawie liczebności dwóch grup bakterii wskaźnikowych: Escherichia coli i enterokoków (tabela 1). Dodatkowo dokonuje się analizy bakterii z grupy coli oraz klostridiów redukujących siarczyny (tabela 2).Według stosowanych w Polsce kryteriów w 100 ml wody podawanej do sieci wodociągowej nie może być ani jednej komórki bakterii uznanych za wskaźnikowe. Podobne normy jakości wody obowiązują w Unii Europejskiej. Dodatkowym ważnym kryterium jakości wody do picia jest także ogólna liczebność bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml wody. Według stosowanych w Polsce kryteriów w wodzie do spożycia przez ludzi liczebność bakterii psychrofilnych nie powinna przekraczać 100 komórek w 1ml, natomiast bakterii mezofilnych 50 komórek w 1 ml wody (tabela 2).

Osobne wymagania dotyczą wód wprowadzanych do jednostkowych opakowań (tabela 3) oraz wód w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego (tabela 4). Jakość wody ciepłej ocenia się na podstawie liczebności bakterii z rodzaju Legionella (tabela 5).

Tabela 1. Podstawowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Escherichia coli	0	100
2	Enterokoki	0	100

Tabela 2. Dodatkowe wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda do picia

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Bakterie grupy coli	0	100
4	Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2^oC po 48 h	50	1
	Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2^oC po 72 h	100	1
5	Clostridium perfringens	0	100

Tabela 3. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda wprowadzana do

opakowań jednostkowych.

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Escherichia coli	0	250
2	Enterokoki	0	250
3	Pseudomonas aeruginosa	0	250
4	Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2^oC po 48 h	20	1
5	Ogółna liczba mikroorganizmów w 22±2^oC po 72 h	100	1

Tabela 4. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać woda w cysternach, zbiornikach magazynujących wodę w środkach transportu lądowego, powietrznego lub wodnego.

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość parametru w próbce wody pobranej
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Escherichia coli	0	100
2	Enterokoki	0	100
3	Pseudomonas aeruginosa	0	100
4	Ogółna liczba mikroorganizmów w 36±2^oC po 48 h	100	1

Tabela 5. Wymagania mikrobiologiczne, jakim powinna odpowiadać ciepła woda użytkowa

Lp.	Parametr	Najwyższa dopuszczalna wartość
				Liczba mikroorganizmów [jtk]	Objętość próbki [ml]
1	Legionella sp.	<100	100

Temat 9: Analiza mikrobiologiczna gleby

1.Gleba - to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały, przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Gleba jest złożonym utworem umożliwiającym funkcjonowanie ekosystemów glebowych. W skład gleby wchodzą cząstki stałe mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy żywe - edafon. Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na tym samym poziomie właściwym dla danej gleby.

2. Edafon glebowy

• Organizmy zasiedlające glebę tworzą złożony zespół o bardzo dużej liczebności zwany edafonem. Są to mikroorganizmy, grzyby, jednokomórkowce roślinne i zwierzęce, rośliny naczyniowe oraz bezkręgowce bytujące w przypowierzchniowej warstwie gleby.

• Edafon może stanowić od 1 do 10% suchej masy substancji organicznej gleby.

Ze względu na rozmiar organizmy żyjące w glebie można zaliczyć do trzech grup:

- Mikrobiota (niedostrzegalne gołym okiem)- wirusy, bakterie, grzyby, pierwotniaki, glony

- Mezobiota (0,2-2 mm) - wazonkowce, nicienie, ślimaki, owady bezskrzydłe, wije, roztocza i inne, małe rośliny,

- Makrobiota (>2 mm) - dżdżownice, krety, gryzonie np. myszy polne, większe owady, korzenie dużych roślin i drzew.

3. Charakterystyka mikroorganizmów glebowych.

Wirusy

• Wirusy prowadzą wyłącznie pasożytniczy tryb życia - reprodukują się w komórkach bakterii, roślin, zwierząt i człowieka.

• W środowisku glebowym najważniejszą rolę odgrywają wirusy bakterii - bakteriofagi,

• Fagi są jednym z elementów nisz ekologicznych ograniczającym nadmierny rozwój bakterii,

• Rola fagów w środowisku glebowym polega na ich zdolności niszczenia niektórych populacji bakterii i w związku z tym - prowadzenia ich selekcji, zarówno negatywnej, jak i pozytywnej. Przykładem negatywnego ich działania są fagi atakujące bakterie brodawkowe z rodzaju Rhizobium będące przyczyna spadku plonów roślin motylkowych

Bakterie

• Bakterie stanowią podstawową masę mikroorganizmów glebowych. Charakteryzują się one wysoką aktywnością metaboliczną.

• Większość bakterii glebowych odznacza się właściwością przylegania (adhezji) do powierzchni cząstek mineralnych i koloidów glebowych.

• Szczególnie duże ilości bakterii gromadzą się w pobliżu resztek tkanek roślinnych i zwierzęcych oraz w odchodach zwierząt dostających się do gleby. Środowiskiem specjalnie sprzyjającym rozwojowi bakterii są korzenie roślin i ich inne podziemne części.

• Bakterie glebowe można podzielić na dwie grupy: takie, które występują w glebie zawsze, niezależnie od jej rodzaju i żyzności (autochtoniczne) oraz takie, które rozwijają się w niej masowo po wprowadzeniu do gleby dużej ilości materii organicznej (zymogeniczne).

• Wśród licznych bakterii glebowych ilościowo dominują promieniowce oraz maczugowce z rodzaju Arthrobacter

Grzyby

• Grzyby należą do organizmów eukariotycznych. Są bezwzględnymi chemoorganotrofami, większość z nich to tlenowce lub grzyby fermentacyjne. Energię i węgiel do budowy własnych komórek czerpią z rozkładu substancji organicznej. Nie posiadają chlorofilu. W przeciwieństwie do bakterii, ściana komórkowa grzybów zawiera chitynę, glukan i inne polisacharydy.

• Bytują one zwykle w powierzchniowych warstwach gleby; można je także spotkać na głębokości do ok. 1 m.

• Wchodzą w symbiotyczne zależności z glonami, owadami, i roślinami wyższymi. Wiele gatunków grzybów jest patogennych dla człowieka, roślin i zwierząt.

• Ich formy wegetatywne tworzą nitkowate strzępki, mniej lub bardziej rozgałęzione, zwykle wielokomórkowe, których gęste sploty formują grzybnię lub plechę. Poszczególne komórki mają wielkość ok. 10 μm.

• Do najpospolitszych grzybów glebowych należą rodzaje:Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Verticillium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Zygorhynchus, Chaetomium.

• Grzyby rozwijają się silnie w glebach kwaśnych i wpływają istotnie na zmiany odczynu gleby.

Rola bakterii i grzybów

• Są współtwórcami struktury gleby - tworzą próchnicę - najważniejszy koloid glebowy, wpływający w zasadniczy sposób na jej strukturę, właściwości sorpcyjne, zasobność w składniki organiczne.

• Wpływają w decydujący sposób na powstawanie gruzełkowatej, gąbczastej struktury gleby przez wytwarzanie śluzów otoczkowych oraz, w przypadku bakterii nitkowatych i grzybów, przez formę swego wzrostu.

Flora glebowa (fitoedafon)

Fitoedafon stanowią głównie glony, oraz w mniejszym stopniu rośliny wyższe.

Glony stanowią główny składnik fitoedafonu. Najliczniej występują na powierzchni gleby; do głębszych warstw dostają się na skutek jej uprawy, przesiąkania wody, działalności zwierząt i zdolności migracji. Wyróżniamy zbiorowiska glonów żyjących na powierzchni gleby - epifitoedafon oraz w głębszych jej warstwach - endofitoedafon

Fauna glebowa

Mikrofauna glebowa reprezentowana jest przez pierwotniaki (Protozoa). Odżywiają się one głównie bakteriami, ich rola polega na selekcji i odmładzaniu populacji bakterii glebowych. Dominują wśród nich korzenionóżki (ameby) i wiciowce. Mezofaunę reprezentują nicienie, wazonkowce, ślimaki, owady, wije, roztocza i inne. Odżywiają się one martwą materią organiczną przyczyniając się do tworzenia próchnicy. Spośród makrofauny pewne znaczenie mają dżdżownice, krety, gryzonie, które rozdrabniają materiał glebowy i przenoszą go na znaczną głębokość. Najważniejszą rolę wśród bezkręgowców odgrywają w glebie dżdżownice, które odżywiają się martwą materią organiczną, pobierając ją wraz z mineralną częścią gleby. Niestrawione resztki zmieszane z glebą mineralną i metabolitami wydalają w postaci grudek (koprolitów), przyczyniając się w ten sposób do tworzenia korzystnej gruzełkowatej struktury gleby i do jej spulchniania. W ciągu roku dżdżownice mogą na hektarze przepuszczać przez swój przewód pokarmowy około 7 tys. kg gleby. Dzięki ruchliwości zwierząt gleba ulega ciągłemu mechanicznemu mieszaniu, co powoduje lepsze jej napowietrzenie, natlenienie i przepływ wody.

4. Podział mikroflory glebowej ze względu na pochodzenie

Mikroflora autochtoniczna

Mikroflorę gleby dzieli się na autochtoniczną i zymogeniczną. Drobnoustroje autochtoniczne czerpią energię z rozkładu materii organicznej powodując jej mineralizację. Przedstawicielami tej grupy w glebie są najczęściej drobnoustroje, dla których źródło węgla i energii stanowią substancje humusowe, tj. związki powstałe z rozkładu i przetworzenia materii organicznej pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Przedstawicielami tej grupy są najczęściej tlenowe nieprzetrwalnikujące bakterie z rodzaju Arthrobacter oraz prątki z rodzaju Mycobacterium. Stałymi mieszkańcami gleby są także promieniowce z rodzaju Streptomyces i Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales). Dla gleby, choć nie tylko dla niej, charakterystyczne są bakterie wiążące azot atmosferyczny, bakterie nitryfikacyjne. Pospolite są także tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium.

Mikroflora zymogeniczna

Drobnoustroje zymogeniczne wprowadzane są do gleb okresowo. Pochodzą one z wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów powstających w hodowli zwierząt (np.obornik i gnojówka), Są to organizmy o dużych wymaganiach odżywczych, których rozwój uzależniony jest od dopływu świeżej, łatwo przyswajalnej materii organicznej. Bakterie zymogeniczne bytujące w glebie to głównie gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium.

W glebie zanieczyszczonej odchodami czy szczątkami zwierząt i roślin mogą występować drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla człowieka są pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella i pałeczki czerwonki - Shigella., beztlenowe laseczki wywołujące tężec - Clostridium tetani, zgorzel gazową - Clostridium perfringens, zatrucia pokarmowe - Clostridium botulinum oraz tlenowe laseczki wąglika - Bacillus anthracis, a także prątki - Mycobacterium tuberculosis.

Ponadto do bakterii chorobotwórczych występujących w glebie zalicza się niektóre promieniowce wywołujące tzw. promienicę. Grzyby są przyczyną zakażeń skóry i tkanek wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki - chorób głównie przewodu pokarmowego. Szczególną uwagę należy zwrócić na możliwość występowania w glebie jaj robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i wykazują dużą odporność na działanie czynników zewnętrznych. Podobnie jak endospory bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka.

5. Ocena jakości gleby za pomocą analizy mikrobiologiczno-helmintologicznej.

5.1. Analizę stosuje się do oceny:

• metod unieszkodliwiania odpadków miejskich,

• jakości osadów ściekowych, odpadów i nawozów wykorzystywanych do celów rolniczych,

• stanu sanitarnego gleby przy planowaniu i budowie osiedli mieszkaniowych , żłobków przedszkoli, obiektów dla służby zdrowia i przemysłu spożywczego oraz rekreacyjnych, jak również do oceny stanu sanitarnego gleby na cele rolnicze.

Ponadto uzyskane wyniki mogą być przydatne do wyjaśnienia dróg zakażenia i określenia czasu przeżywalności mikroorganizmów chorobotwórczych w glebie. Są one również istotne z punktu widzenia możliwości zakażenia poprzez glebę wód gruntowych i powierzchniowych.

5.2. Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powinien obejmować:

• Oznaczenie obecności w glebie bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella. W glebie przeznaczonej do celów rolniczych nie mogą się znajdować bakterie należących do tego rodzaju.

• Badania helmintologiczne polegające na określeniu liczby żywych jaj robaków jelitowych: glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.), włosogłówki (Trichuris trichiura), określeniu stadium ich rozwoju oraz stopnia odporności na różne warunki mikroklimatyczne.

Stopień zanieczyszczenia gleby jajami robaków (helmintów) określa się w odniesieniu do 100 g gleby, uznając glebę za:

• nie zanieczyszczoną - nie wykrycie jaj,

• słabo zanieczyszczoną - wykrycie pojedynczych jaj (1-3),

• średnio zanieczyszczoną - wykrycie do 10 jaj,

• silnie zanieczyszczoną - wykrycie 10 jaj i więcej

Ponadto badania uzupełnić można o oznaczenia:

• ogólnej liczby bakterii - wykonywane na podłożu agarowym, temperatura - 28⁰C, czas inkubacji -48 h,

• bakterii przetrwalnikujących (sporowych) - podłoże agarowe, temperatura 28⁰C, czas inkubacji-48 h,

• bakterii termofilnych - podłoże agarowe, temperatura 55⁰C, czas inkubacji-24 h.

• liczebności bakterii wskaźnikowych:

• pałeczek grupy coli,

• pałeczek grupy coli typu fekalnego (termotolerancyjnych), głównie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli),

• laseczek Clostridium perfringens,

5.3. Określenia stosowane w analizie mikrobiologiczno-helmintologicznej gleby:

• Miano - najmniejsza ilość badanej gleby wyrażona w gramach, w której stwierdza się jeszcze obecność badanych bakterii.

• Bakterie grupy coli - Gram-ujemne pałeczki niewytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 35-37^OC. Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae.

• Bakterie coli typu fekalnego (termotolerancyjne) pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) - są to pałeczki z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy (pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, niewytwarzające przetrwalników, względnie beztlenowe, fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 37⁰C w ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo) mają ponadto zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a w szczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w temperaturze 44⁰C

• Bakterie Clostridium perfringens - są to nieruchliwe, beztlenowe laseczki Gram-dodatnie wytwarzające otoczki i wykazujące zdolność do fermentacji glukozy, laktozy, rozkładu żelatyny, a także redukcji siarczynów do H₂S.

• Bakterie z rodzaju Salmonella - chorobotwórcze pałeczki przewodu pokarmowego. Wiele gatunków bakterii tego samego rodzaju wywołuje salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe. Salmonella typhi wywołuje chorobę zwaną durem brzusznym.

• Bakterie wytwarzające przetrwalniki (bakterie sporowe) - Gram-dodatnie laseczki (tlenowe i beztlenowe) wytwarzające przetrwalniki (zwane również endosporami). Należą głównie do rodzaju Bacillus i Clostridium.

• Bakterie termofilne - to bakterie rozwijające się w wyższych temperaturach, 45-60⁰C (optimum - 55⁰C), głównie w oborniku i kompoście, stosowanych do nawożenia i mogą być wskaźnikiem ich obecności w glebach uprawnych.

• „Ogólna” liczba bakterii - to wskaźnik zawartości związków organicznych w glebie.

• W końcowym etapie procesu mineralizacji, w miarę wyczerpywania się łatwo rozkładalnych źródeł pokarmowych wzrasta ilość spor bakteryjnych Stosunek ogólnej liczby bakterii do liczby bakterii sporowych - świadczy o stopniu rozkładu w glebie związków organicznych.

• Badania helmintologiczne - służą wykrywaniu robaków jelitowych w glebie, a głównie ich jaj (tzw. jaj „geohelmintów”):

• glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides),

• glisty psiej (Toxocara sp.),

• włosogłówki (Trichuris trichiura).

• Stadium tworzenia się larwy w jaju i okresy zdolności życiowych robaków (helmintów) w glebie, mogą być użyte do oceny, od jak dawna gleba jest zanieczyszczona.

Temat 11: Analiza mikrobiologiczna powietrza

Powietrze jest środowiskiem niesprzyjającym życiu mikroorganizmów, w którym nie mogą one rosnąć i dzielić się. Jest ono jedynie miejscem ich okresowego przebywania i ośrodkiem umożliwiającym przemieszczanie się. Drobnoustroje dostają się do powietrza w wyniku podmuchów wiatru, porywającego je z różnych środowisk (gleby, wody, odpadów, powierzchni roślin, zwierząt i in.), bądź też są tam aktywnie wyrzucane np. podczas kichania, kaszlu, czy w procesie napowietrzania ścieków. Mikroorganizmy zawieszone w powietrzu można traktować jako układ koloidalny - aerozol biologiczny (tzw. bioaerozol), w którym ośrodkiem rozpraszającym jest powietrze, a fazę rozproszoną tworzą drobnoustroje.

W powietrzu działają 3 podstawowe czynniki ograniczające występowanie mikroorganizmów:

• brak wystarczającej ilości składników pokarmowych,

• częsty deficyt wody, grożący wyschnięciem,

• promieniowanie słoneczne.

Pierwszy z wymienionych czynników w sposób oczywisty uniemożliwia rozwój każdej komórki. Drobnoustroje w powietrzu są ciągle narażone na wyschnięcie, a bez wody niemożliwe są jakiekolwiek procesy życiowe. Niektóre bakterie są szczególnie wrażliwe na deficyt wody i wysuszenie działa na nie bakteriobójczo (np. dwoinki rzeżączki lub krętki kiły giną zaraz po dostaniu się do powietrza). Wiele mikroorganizmów znosi jednak dobrze deficyt wody i, choć nie mogą wtedy normalnie funkcjonować, to w stanie wysuszenia przeżywają miesiące, a nawet lata (przetrwalniki laseczek, zarodniki grzybów).

Promieniowanie słoneczne również działa szkodliwie na drobnoustroje zawieszone w powietrzu, ponieważ powoduje powstawanie mutacji i przyczynia się do wysychania komórek (w wodzie i glebie światło jest zwykle słabe lub nie ma go wcale).

Przystosowanie mikroorganizmów do przebywania w powietrzu

W atmosferze najdłużej mogą przebywać te formy, które ze względu na swoją budowę lub skład chemiczny są odporne na wysychanie i działanie promieniowania słonecznego. Można je podzielić na następujące grupy:

• formy przetrwalne bakterii,

• formy wegetatywne bakterii wytwarzające barwniki karotenoidowe lub specjalne warstwy ochronne (otoczki, specjalna budowa ściany komórkowej)

• zarodniki grzybów,

• wirusy mające otoczkę.

Oczywiście, oprócz wymienionych form szczególnie odpornych, w powietrzu występują też bardziej wrażliwe komórki i wirusy, ale ich żywotność jest dużo mniejsza. Uważa się, że spośród form wegetatywnych, bakterie gramdodatnie wykazują większą odporność niż gramujemne (zwłaszcza na wysuszenie), ze względu na grubszą ścianę komórkową. Poza tym, wirusy są zwykle bardziej odporne niż bakterie.

Przeżywalność i rozprzestrzenianie się bioaerozoli

Drobnoustroje po opuszczeniu swojego pierwotnego miejsca zasiedlenia i przedostaniu się do powietrza, są nagle poddane działaniu licznych czynników niesprzyjających przeżyciu i część z nich ginie od razu, głównie z powodu wysuszenia. Te, które przeżyją stres nagłej zmiany warunków życia, są jednak nadal poddawane ich działaniu i z czasem zamierają. Na przeżywalność mikroorganizmów w powietrzu wpływają następujące czynniki:

• odporność właściwa dla danego drobnoustroju,

• warunki meteorologiczne (m.in. wilgotność względna, temperatura, promieniowanie słoneczne),

• zanieczyszczenia powietrza,

• czas przebywania w powietrzu.

Jednym z głównych czynników warunkujących przeżywalność jest zawartość wody w powietrzu. Przy bardzo niskiej wilgotności i wysokiej temperaturze komórkom grozi wysuszenie, natomiast wysoka wilgotność może chronić komórki przed napromieniowaniem, poprzez jego absorpcję. Drobnoustroje różnie reagują na stopień wilgotności powietrza, choć dla większości z nich korzystniejsze warunki przetrwania stwarza wysoka wilgotność.

Temperatura może działać pośrednio, poprzez zmianę wilgotności względnej powietrza (im wyższa temperatura, tym niższa wilgotność względna) lub bezpośrednio, powodując w skrajnych przypadkach wysuszenie komórek i denaturację białek (temperatury wysokie) albo krystalizację wody zawartej w komórkach (temperatury poniżej 0^oC). Wynika z tego, że optymalne dla bioaerozolu są temperatury niskie, ale powyżej 0^oC. (według niektórych badaczy ok. 15^oC).

Promieniowanie słoneczne ma negatywny wpływ na przeżywalność bioaerozolu, zarówno jako światło widzialne, jak i promieniowanie podczerwone i ultrafioletowe (UV). Jest tak z następujących przyczyn:

• powoduje ono powstawanie mutacji,

• powoduje powstawanie wolnych rodników, które uszkadzają ważne makromolekuły,

• stwarza zagrożenie wysuszeniem.

Obecne w powietrzu zanieczyszczenia, zwłaszcza węglowodory, ozon i tlenki azotu, aktywowane promieniowaniem słonecznym (szczególnie UV) tworzą różnorodne, silnie reaktywne zanieczyszczenia wtórne, określane ogólnie jako utleniacze fotochemiczne (m.in. azotan peroksyacetylu - PAN). Działają one toksycznie na wszelkie formy życia, w tym i na mikroorganizmy zawieszone w powietrzu. Natomiast nietoksyczne aerozole niebiologiczne (pyły, mgły), rozpraszają i absorbują promieniowanie słoneczne i przez to zwiększają szansę przeżycia bioaerozolu.

Należy zaznaczyć, że omówione wyżej czynniki działają równocześnie i często są ze sobą

powiązane, np. promieniowanie słoneczne zwiększa temperaturę, a wysoka wilgotność osłabia promieniowanie.

Stężenie mikroorganizmów w powietrzu

O stężeniu bioaerozolu, czyli stopniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza, decydują m. in. następujące czynniki:

• wielkość emisji drobnoustrojów, zależna od źródła emisji,

• odległość od źródła emisji,

• prędkość wiatru,

• przeżywalność drobnoustrojów (zależna od czynników omówionych wyżej),

• opady atmosferyczne.

Wielkość emisji i skład gatunkowy emitowanego bioaerozolu zależy od źródła emisji. Różne mogą być czynniki wpływające na stężenie początkowe powstającego bioaerozolu. Np. dla komory napowietrzania biologicznej oczyszczalni ścieków są to m. in.: stężenie mikroorganizmów w ściekach i sposób ich napowietrzania.

Powstały bioaerozol rozprzestrzenia się podobnie jak aerozol niebiologiczny (np. pył zawieszony) z tą różnicą, że mikroorganizmy z czasem zamierają. Wiejący wiatr rozrzedza aerozol i powoduje, że jego stężenie na zawietrznej od źródła emisji spada wraz z oddalaniem się od niego. Dodatkowymi czynnikami zmniejszającymi stężenie bioaerozolu jest grawitacja, działająca głównie na większe cząstki, i opady atmosferyczne, niekiedy radykalnie redukujące stężenie aerozolu (po intensywnych opadach deszczu lub śniegu, powietrze jest praktycznie wolne od drobnoustrojów).

Zagrożenia związane z obecnością drobnoustrojów w powietrzu

Można wyróżnić następujące grupy zagrożeń:

• Choroby zakaźne: wirusowe, bakteryjne, grzybowe i pierwotniacze,

• Choroby alergiczne,

• Zatrucia (np. endotoksyny i mikotoksyny).

Główne źródła emisji bioaerozolu

Można wyróżnić dwa podstawowe źródła bioaerozolu:

• naturalne

• bytowe (związane z działalnością człowieka)

Źródła naturalne to przede wszystkim gleba i woda, z których mikroorganizmy są wynoszone przez ruchy powietrza, a także organizmy, np. grzyby emitujące olbrzymie ilości zarodników roznoszonych przez wiatr. A więc w powietrzu istnieje zawsze pewna liczba drobnoustrojów tworząca naturalne tło.

Z higienicznego punktu widzenia, ważniejsze od naturalnych są bytowe źródła bioaerozolu, związane z działalnością człowieka. Emisje z tych źródeł są niebezpieczne z dwóch powodów:

• mogą rozprzestrzeniać drobnoustroje patogenne (chorobotwórcze),

• często powodują silne zwiększenie liczebności mikroorganizmów w powietrzu, znacznie przekraczające naturalne tło.

Źródła emisji aerozolu biologicznego mogą mieć charakter punktowy (np. komora napowietrzania ścieków) lub powierzchniowy (np. pole nawadniane ściekami).

Do najważniejszych źródeł bioaerozolu należą:

• rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy,

• oczyszczanie ścieków,

• gospodarka odpadami (składowiska i kompostownie),

Rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy

Pod względem wielkości emisji jest to najpoważniejsze źródło bioaerozolu, będące efektem intensyfikacji metod produkcji rolnej. Aerozol powstaje podczas wykonywania większości prac rolniczych, np. zbioru plonów, w czasie transportu, przechowywania i przerobu surowców roślinnych i zwierzęcych, oraz w pomieszczeniach hodowlanych.

Do najważniejszych składników tego aerozolu należą:

• grzyby pleśniowe, m. in. tzw. grzyby przechowalniane (Aspergillus, Penicillium) i tzw. grzyby polowe (Cladosporium i Alternaria), najpospolitsze grzyby w powietrzu,

• pałeczki gramujemne, głównie z rodzaju Ervinia,

• promieniowce termofilne,

• pył pochodzenia biologicznego (m. in. fragmenty naskórka, pierza, cząstki wydalin i pył roślinny).

Ekspozycja na taki aerozol często powoduje przewlekłe choroby układu oddechowego, np. alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych.

Oczyszczanie ścieków

Wielkość emisji bioaerozolu zależy tu m. in. od składu ścieków, przepustowości oczyszczalni, metody oczyszczania i rodzaju stosowanych urządzeń technologicznych. Sprzyjające warunki do tworzenia się bioaerozolu powstają zwłaszcza przy wylewaniu ścieków, ich napowietrzaniu, mieszaniu i rozpryskiwaniu. Skład jakościowy powstałej mikroflory powietrza jest ściśle związany ze składem oczyszczanych ścieków.

Za najbardziej specyficzne dla bioaerozoli ściekowych uważa się bakterie jelitowe (pałeczki z grupy coli, pałeczki durowe) i wirusy jelitowe, gdyż zazwyczaj nie spotyka się ich w powietrzu po stronie nawietrznej oczyszczalni. Z tego powodu uważa się je za mikroorganizmy wskaźnikowe, pomocne w wyznaczaniu strefy oddziaływania oczyszczalni na środowisko.

Gospodarka odpadami

Źródłem emisji bioaerozolu są różne formy gospadarki odpadami m. in.: składowanie odpadów i kompostownie.

Składowanie odpadów

W powietrzu wokół składowisk występują głównie pospolite w przyrodzie bakterie i grzyby saprofityczne pochodzenia glebowego i wodnego, z których część ma charakter patogenów oportunistycznych. Oznacza to, że w sprzyjających warunkach (osłabienie układu odpornościowego, wniknięcie do organizmu w dużej ilości) mogą one wywołać u człowieka stan chorobowy. Dobrymi mikroorganizmami wskaźnikowymi oddziaływania składowisk na otoczenie są grzyby ciepłolubne (rosnące w temp. 37^oC) i keratynolityczne (rozkładające keratynę).

Kompostownie

Kompostownie również emitują duże ilości drobnoustrojów, zwłaszcza bakterii. Szczególnie duże zanieczyszczenie powietrza powstaje przy sortowaniu odpadów, gdzie liczne są bakterie gramujemne, potencjalnie niebezpieczne dla człowieka. Dobrym wskaźnikiem oddziaływania kompostowni na otoczenie jest pospolity w kompoście grzyb pleśniowy - kropidlak popielaty (Aspergillus fumigatus).

Wykrywanie obecności drobnoustrojów w powietrzu

Stosowane metody można podzielić umownie na:

• mikroskopowe

• hodowlane.

Niekiedy stosowane metody mają charakter pośredni lub używa się jednocześnie obu metod.

Metody mikroskopowe

Polegają one na:

• przepuszczaniu powietrza przez filtr membranowy bądź umieszczaniu na drodze zasysanego powietrza szkiełka powleczonego lepką substancją (np. wazeliną),

• barwieniu wyłapanych drobnoustrojów i

• badaniu mikroskopowym, polegającym głównie na liczeniu komórek.

Zalety metod mikroskopowych są następujące:

• możliwość wykrycia w powietrzu nie tylko żywych, ale i martwych mikroorganizmów,

• możliwość wykrycia także tych drobnoustrojów, które niechętnie wyrastają na pożywkach; dzięki temu oznaczenia liczby drobnoustrojów są zwykle przynajmniej o rząd wielkości wyższe, niż w metodach hodowlanych,

• można wykryć i zidentyfikować inne obiekty biologiczne, np.: pyłki roślin, alergogenne roztocze, nieożywiony pył organiczny ( fragmenty naskórka, piór, roślin)

Jednak metody te mają poważną wadę: niemożność identyfikacji gatunkowej mikroorganizmów (bakterii, grzybów, wirusów).

Metody hodowlane

Metody te polegają na przeniesieniu mikroorganizmów z powietrza na powierzchnię odpowiedniej pożywki. Po okresie inkubacji w optymalnej temperaturze, liczy się wyrosłe kolonie i podaje wynik jako liczbę jednostek tworzących kolonie przypadających na 1 m³ powietrza (jtk/m³ lub cfu/m³ - z ang. colony forming units - jednostki tworzące kolonie). Jako że kolonia może powstać nie tylko z jednej, ale i z kilku połączonych komórek, w rzeczywistości w powietrzu może się znajdować więcej mikroorganizmów, niż wskazuje na to wynik wyrażony w jednostkach jtk (cfu). Poza tym, za pomocą metod hodowlanych można wykryć jedynie żywe komórki i tylko te, które są w wstanie wyrosnąć na stosowanych pożywkach.

Można wyróżnić trzy podstawowe sposoby pobierania prób powietrza stosowane w metodach hodowlanych:

• metoda sedymentacyjna Kocha,

• metody filtracyjne (stosowane również w metodach mikroskopowych),

• metody zderzeniowe (impakcyjne).

Metoda sedymentacyjna

Jest to najprostsza metoda i polega na opadaniu komórek z powietrza na odkryte szalki Petriego z odpowiednią pożywką. Siła grawitacji działająca na cząstki bioaerozolu ma znaczenie jedynie w stosunku do większych cząstek, natomiast mniejsze uderzają w eksponowaną pożywkę pod wpływem ruchów powietrza. Po określonym czasie ekspozycji (zwykle 10 lub 30 min.) płytki inkubuje się i liczy wyrosłe kolonie.

Zaletą tej popularnej metody jest, oprócz prostoty, jej poręczność i taniość. Można ją jednak stosować jedynie do orientacyjnego określania liczby mikroorganizmów w powietrzu, oraz do badań porównawczych, ponieważ ma ona szereg wad. Należą do nich:

• nieznajomość objętości powietrza, do której należy odnieść stwierdzoną wartość jtk (cfu),

• niemożność wykrycia najdrobniejszych cząstek, które osiadają bardzo wolno lub w ogóle nie ulegają sedymentacji (niska wydajność metody),

• duża niedokładność, powodowana przez ruchy powietrza zmieniające warunki sedymentacji.

Pierwsza z wymienionych wad jest częściowo rekompensowana stosowaniem empirycznego wzoru przeliczeniowego, opartego na założeniu, że w ciągu 5 minut na powierzchnię 100 cm² opadają komórki znajdujące się w 10 dm³ powietrza. Wzór ma następującą postać:

a ⋅ 5 ⋅ 10⁴

x =

πr² ⋅ t

gdzie: x - liczba mikroorganizmów w powietrzu (w jtk/m³ lub cfu/m³),

a - liczba kolonii wyrosłych na płytce Petriego,

πr² - pole powierzchni płytki Petriego (w cm²),

t - czas ekspozycji w minutach (w min.).

Aby ograniczyć zaburzenia związane z ruchami powietrza, zaleca się, aby badania prowadzić przy słabym wietrze.

Metody aspiracyjne (filtracyjne)

Metody te są również stosunkowo tanie i proste, ale mają dwie zasadnicze zalety w porównaniu z metodą sedymentacyjną:

• znana jest objętość badanego powietrza,

• można wykryć również drobne cząstki zanieczyszczeń mikrobiologicznych, tworzące tzw. frakcję respirabilną, zdolną przenikać do płuc (choć nie można określić jej wielkości).

Metody te polegają na zassaniu przez pompę (aspirator) znanej objętości powietrza, przepuszczeniu go przez sterylną substancję pochłaniającą (ciekłą lub stałą) i przeniesieniu odfiltrowanych drobnoustrojów na odpowiednią pożywkę. Po określonym czasie inkubacji liczy się wyrosłe kolonie. Najczęściej do filtracji powietrza stosuje się roztwór fizjologiczny (0,85 % NaCl) lub filtry membranowe.

Filtracja przez płyny (klasyfikowana niekiedy jako metoda zderzeniowa) jest jedną z najczęściej stosowanych i wysoko cenionych technik pobierania bioaerozolu. Wynika to nie tylko z jej poręczności, ale też z dużej wydajności. Oznacza to zarówno dużą wydajność pobierania bioaerozolu (w tym frakcji respirabilnej), jak i znaczną przeżywalność pobranych mikroorganizmów.

Filtracja przez filtry membranowe umożliwia użycie zarówno metody hodowlanej (filtry z drobnoustrojami kładzie się bezpośrednio na pożywkę lub płucze się je, a następnie posiewa), jak i mikroskopowej (filtry barwi się i ogląda pod mikroskopem). Jednak wadą tej techniki jest stosunkowo niewielka wydajność, wynikająca z oporów przepływu powietrza powstających podczas przepuszczania go przez drobne pory filtra, i mała poręczność.

Metody zderzeniowe

Polegają one na zasysaniu przez aspirator znanej objętości powietrza, które z dużą szybkością uderza w powierzchnię pożywek agarowych. Powoduje to przyklejanie się obecnych w powietrzu drobnoustrojów, które po określonym czasie inkubacji wytwarzają kolonie. Metody zderzeniowe, zwane też impakcyjnymi (od ang. impact - zderzenie) są najwyżej cenionymi i coraz częściej stosowanymi metodami wykrywania mikroorganizmów w powietrzu. Ich największą zaletą jest możliwość wykrycia i określenia wielkości frakcji respirabilnej. Poza tym metody te nadają się do badania wirusów.

Wadą metod zderzeniowych jest spadek żywotności drobnoustrojów spowodowany szokiem związanym z nagłym uderzeniem o pożywkę agarową oraz możliwość zarastania pożywek w przypadku silnego zanieczyszczenia powietrza. Poza tym zwykle nie są to metody tanie.

Mikrobiologiczna ocena stanu sanitarnego powietrza

Ocena stanu sanitarnego powietrza obejmuje aspekt ilościowy i jakościowy, i zależy od rodzaju ocenianego powietrza. Inne kryteria stosuje się do powietrza atmosferycznego, a inne do powietrza wewnątrz różnego typu pomieszczeń. Wartości bezpiecznych stężeń podawane przez różnych autorów różnią się. Według norm przyjętych w Polsce powietrze atmosferyczne jest czyste, jeśli zagęszczenie komórek bakterii mezofilnych nie przekracza 1000 jtk/m³, a grzybów mikroskopowych 3000 jtk/m³.

Wewnątrz pomieszczeń mieszkalnych ogólna liczba bakterii mezofilnych nie powinna przekraczać 2000 jtk/m³, a grzybów 300 jtk/m³.

Jeśli zagęszczenie mikroorganizmów przekracza podane wartości, lub w skład aerozolu wchodzą drobnoustroje niebezpieczne dla człowieka, to takie powietrze uważa się za zanieczyszczone mikrobiologicznie.

Dla pomieszczeń użytkowych dopuszczalne wartości graniczne zależą od ich przeznaczenia, np. na sali operacyjnej nie może być w ogóle grzybów a liczba bakterii nie może przekraczać 100 cfu/m³. Natomiast np. w chlewni dopuszcza się stężenie bakterii wynoszące 200000 cfu/m³, a grzybów 10000 cfu/m³.

Bardzo ważna z higienicznego punktu widzenia jest znajomość wielkości frakcji respirabilnej bioaerozolu. Im większy jest jej udział procentowy, tym większe zagrożenie dla zdrowia stwarza powietrze, nawet jeśli nie ma w nim mikroorganizmów wywołujących choroby zakaźne. Wdychanie takiego powietrza może bowiem być powodem alergii, zatruć i pylic.

Badania jakościowe z konieczności muszą być ograniczone do mikroorganizmów wskaźnikowych, bowiem identyfikacja drobnoustrojów chorobotwórczych jest zwykle żmudna i droga. Gatunki wskaźnikowe same nie muszą być chorobotwórcze, ale ich występowanie wskazuje pośrednio na potencjalne zagrożenie mikroorganizmami patogennymi.

Do stosowanych w sanitarnej analizie powietrza mikroorganizmów wskaźnikowych należą m. in.:

• gronkowce hemolizujące,

• gronkowce mannitolododatnie i mannitoloujemne,

• promieniowce,

• pałeczki Pseudomonas fluorescens.

Gronkowce to jedne z najpospolitszych bakterii w przyrodzie. Nie wszystkie są chorobotwórcze, wiele z nich występuje na skórze i błonie śluzowej człowieka nie powodując chorób. Gatunki chorobotwórcze wykazują wysoką aktywność metaboliczną, dzięki której można je odróżnić od niechorobotwórczych.

Gronkowce chorobotwórcze wywołują m. in.:

• całkowitą hemolizę krwinek czerwonych (erytrocytów) na agarze z krwią,

• kwaśną fermentację mannitolu na podłożu Chapmana.

Hemoliza polega na rozkładzie erytrocytów (krwinek czerwonych) przez pewne toksyny produkowane przez bakterie, co przejawia się powstawaniem charakterystycznych przejaśnień wokół kolonii.

Podłoże Chapmana zawiera 10% NaCl, co powoduje, że wyrastają na nim głównie gronkowce, odporne na duże stężenie soli. Obecność w podłożu mannitolu (wielowodorotlenowego alkoholu) pozwala zróżnicować gronkowce na mannitolododatnie (zdolne do fermentacji mannitolu) i mannitoloujemne (niezdolne). Stwierdzenie hemolizy i fermentacji mannitolu zwiększa prawdopodobieństwo, że wykryte gronkowce są chorobotwórcze.

Promieniowce to typowe bakterie glebowe. W przeciwieństwie do innych bakterii, komórki promieniowców mają często postać rozgałęziających się nitek i mogą tworzyć tzw. pseudogrzybnię, podobnie jak strzępki grzybów. Z tego powodu wytwarzają one charakterystyczne meszkowate kolonie na podłożu Pochona. Wiele promieniowców ma zdolność wytwarzania antybiotyków (promieniowcowym antybiotykiem jest np. streptomycyna). Obecność promieniowców w powietrzu może wskazywać na środowisko glebowe jako źródło zanieczyszczenia powietrza.

Bakteria Pseudomonas fluorescens jest pospolitą bakterią wodną. Na podłożu Kinga B wytwarza ona barwniki fluoryzujące powodujące świecenie kolonii w świetle UV. Obecność tych bakterii w powietrzu może wskazywać na środowisko wodne jako źródło zanieczyszczenia.

Poza tym w badaniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza wokół określonego emitora, wykorzystuje się gatunki charakterystyczne dla tego emitora. Pozwala to na wyznaczenie strefy jego oddziaływania na stan sanitarny powietrza - granicę oddziaływania będzie wyznaczał obszar występowania mikroorganizmu wskaźnikowego.

Temat 12-13: Mikrobiologia osadu czynnego

Wyróżnia się trzy zasadnicze metody oczyszczania ścieków : mechaniczne, chemiczne i biologiczne. W konkretnej oczyszczalni mogą być wykorzystane wszystkie wymienione sposoby lub niektóre z nich. W oczyszczalniach biologicznych zanim ścieki zostaną poddane działaniu mikroorganizmów, są wstępnie oczyszczane na drodze mechanicznej np. na kratach, w osadnikach czy piaskownikach. Istnieją cztery stopnie oczyszczania ścieków :

I stopień - oczyszczanie mechaniczne, polegające na usuwaniu zanieczyszczeń stałych, do zawiesin opadających włącznie,

II stopień - oczyszczanie biologiczne usuwające zanieczyszczenia rozpuszczone,

III stopień - usuwanie związków biogennych (głównie soli azotu i fosforu),

IV stopień - usuwanie resztkowych zanieczyszczeń trudno rozkładalnych, tzw. związków refrakcyjnych (ten stopień oczyszczania określany jest jako odnowa wody).

Biologiczne oczyszczanie ścieków opiera się na naturalnych procesach samooczyszczania, które zachodzą w każdym zbiorniku wodnym oraz w glebie, głównie dzięki aktywności drobnoustrojów. Jednak zdolności samooczyszczania są często niewystarczające do unieszkodliwienia tak dużych ilości ścieków, jakie powstają w wyniku działalności człowieka. Dlatego w biologicznym oczyszczaniu dużych ładunków zanieczyszczeń intensywność procesów samooczyszczania musi być zwielokrotniona metodami inżynieryjnymi. Metody oczyszczania wykorzystujące specjalne urządzenia intensyfikujące te naturalne procesy określa się jako sztuczne, natomiast metody oparte wyłącznie na procesach samooczyszczania nazywane są metodami naturalnymi. Część naturalnych sposobów oczyszczania ścieków ma charakter pośredni ze względu na pewien stopień ingerencji człowieka w proces.

Do naturalnych metod oczyszczania należą m. in.: nawadnianie szerokoprzestrzenne pól, filtry gruntowe, stawy ściekowe i oczyszczalnie hydrobotaniczne (np. trzcinowe).

Do sztucznych biologicznych metod oczyszczania należą: złoża biologiczne i osad czynny. Sztuczne metody biologicznego oczyszczania ścieków, podobnie jak naturalne, wykorzystują procesy samooczyszczania zachodzące w naturze, jednak ze zwielokrotnioną intensywnością. Np. procesy przebiegające w złożach biologicznych przypominają samooczyszczanie w glebie (udoskonalone „filtry gruntowe”), a metoda osadu czynnego opiera się na podobnych zjawiskach zachodzących w środowisku wodnym (ulepszone „stawy ściekowe”).

Osad czynny jest metodą oczyszczania, w której elementem oczyszczającym są bakterie zlepione w kłaczki zawieszone w środowisku płynnym (ścieki). Kłaczki osadu powstają podobnie jak błona biologiczna, w wyniku łączenia się bakterii zooglealnych wytwarzających lepki śluz. Proces tworzenia się kłaczków, zwany flokulacją, zachodzi spontanicznie w trakcie napowietrzania komory wypełnionej ściekami.

W oczyszczalniach pracujących metodą osadu czynnego ścieki, po oczyszczaniu mechanicznym w osadniku wstępnym, są kierowane do komory osadu czynnego, zwanej też komorą napowietrzania, gdzie odbywa się właściwe oczyszczanie biologiczne. Kłaczki osadu wchodzą tu w kontakt ze ściekami w warunkach sztucznego napowietrzania i intensywnego mieszania. Bakterie obecne w kłaczkach pochłaniają substancję organiczną ze ścieków i część jej zużywają jako paliwo (źródło energii), część natomiast przyswajają jako materię budulcową, co prowadzi do zwiększenia biomasy. Efektem tych procesów jest mineralizacja ścieków i wzrost masy osadu czynnego.

Wykorzystanie zanieczyszczeń przez bakterie osadu czynnego.

Po kilku godzinach przetrzymywania ścieków w komorze, są one przepuszczane do osadnika wtórnego, w którym zachodzi oddzielenie kłaczków od oczyszczonych ścieków. Kłaczki osadzają się na dnie osadnika i są recyrkulowane albo z powrotem do komory napowietrzania, by utrzymać stężenie biomasy (osad powrotny), albo do osadnika wstępnego i wraz z osadem wstępnym usuwane z obiegu oraz unieszkodliwiane (osad nadmierny). Układ technologiczny procesu osadu czynnego przedstawia rysunek:

Układ oczyszczalni ścieków z osadem czynnym:

1 - osadnik wstępny, 2 - komora osadu czynnego, 3 - osadnik wtórny, 4 - stacja pomp osadowych, Q_ść - ścieki, Q_n - osad nadmierny, Q_r - osad powrotny

Jako, że elementem oczyszczającym w tej metodzie są kłaczki zlepionych bakterii, dlatego ważne jest, aby proces flokulacji przebiegał prawidłowo i aby powstałe kłaczki miały odpowiednią wielkość, kształt i strukturę. Flokulacja zależy od stopnia obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń. Przy bardzo wysokim i bardzo niskim obciążeniu obserwuje się bowiem zjawisko deflokulacji, czyli rozpraszania się bakterii skupionych w kłaczki. Gdy osad jest nadmiernie obciążony, kłaczki są nie dotlenione, natomiast w przypadku niedociążenia bakterie giną z braku pokarmu.

Wielkość kłaczków jest istotną cechą wpływającą na efektywność oczyszczania. Zależą od niej dwa ważne procesy: biosorpcja (pochłanianie zanieczyszczeń ) i sedymentacja (opadanie kłaczków). Biosorpcja jest etapem poprzedzającym biodegradację i zależy od wielkości powierzchni kłaczków. Powierzchnia ta jest tym większa, im kłaczki są mniejsze. Jednak zbyt małe kłaczki, choć mają dużą powierzchnię sorpcyjną, źle opadają w osadniku wtórnym. Może to prowadzić do wtórnego zanieczyszczenia odbiornika, do którego odprowadza się oczyszczone, ale nie oddzielone od kłaczków ścieki. Natomiast kłaczki zbyt duże, choć świetnie sedymentują, to jednocześnie słabo oczyszczają ścieki. Wynika to z faktu, że bakterie umieszczone w centralnej części dużego kłaczka mają utrudniony dostęp do tlenu i zanieczyszczeń będących substratem pokarmowym. Kłaczki muszą więc wykazywać właściwy stan rozdrobnienia zapewniający odpowiednie warunki tlenowe i pokarmowe.

Kształt kłaczków jest cechą, która może wskazywać na pewne niekorzystne zjawiska w osadzie. Np. kształt gwiaździsty, pierzasty czy siatkowaty wiążą się zwykle z obecnością mikroorganizmów nitkowatych (głównie bakterii i grzybów), których obecność w osadzie jest niepożądana, gdyż powodują jego puchnięcie.

Struktura kłaczka może być spoista bądź luźna. W warunkach niedotlenienia lub braku pokarmu kłaczki przybierają formę zbitych, obłonionych tworów koloru szarego. Obecność takich kłaczków w osadzie powoduje spadek jego aktywności. Wiele różnych czynników powoduje rozluźnienie kłaczków. Należą do nich: rozwój form nitkowatych, nadmiar lub niedostatek tlenu, przeciążenie osadu lub warunki głodowe.

Niekorzystnym zjawiskiem obniżającym zdolności sedymentacyjne kłaczków jest puchnięcie osadu czynnego. Z puchnięciem mamy do czynienia, gdy zwiększa się objętość osadu przy zachowaniu tej samej masy. Liczbowo wyraża to indeks osadu, który przedstawia objętość (w cm³) jednego grama jego suchej masy. Indeks wyraża więc gęstość osadu, lub stopień uwodnienia. Jeden gram suchej masy dobrze pracującego osadu czynnego ma zwykle objętość 67 cm³ (indeks = 67 cm³/g). Indeks osadu spuchniętego mieści się w granicach od 100 - 400 cm³/g. Spuchnięty osad jest co prawda bardzo aktywny (duża powierzchnia biosorpcyjna), jednak z powodu obniżonej opadalności nie może być on oddzielony od oczyszczonych ścieków w osadniku wtórnym . Wiele jest przyczyn puchnięcia osadu. Bezpośrednią przyczyną tego zjawiska mogą być organizmy nitkowate, bakterie zooglealne, rozproszenie kłaczków lub wzrost lekkości osadu spowodowany wydzielaniem się pęcherzyków gazu. Organizmy nitkowate (głównie bakterie i grzyby) wywołują tzw. puchnięcie włókniste. Zwykle dochodzi do niego, gdy skład ścieków jest niewłaściwy (zbyt duże ilości węglowodanów w stosunku do azotu i fosforu), w sytuacji przeciążenia osadu, nagłych zmian obciążenia , niedotlenienia, zakwaszenia, zatrucia, obniżenia temperatury lub niedostatecznie długiego przetrzymywania osadu w komorze napowietrzania. Do najczęściej spotykanych mikroorganizmów nitkowatych należą bakterie: Sphaerotilus, Beggiatoa i promieniowce. Mniej poznanym zjawiskiem jest puchnięcie niewłókniste. Wywołane jest ono nadmierną produkcją pozakomórkowych substancji śluzowych przez pewne bakterie zooglealne. Śluzy te wiążą bardzo dużo wody, co sprawia, że osad jest czterokrotnie silniej uwodniony niż w przypadku spuchnięcia włóknistego. Zwiększenie indeksu osadu może też spowodować rozproszenie kłaczków w wyniku zbyt silnej turbulencji w komorze lub też wynoszenie osadu w osadniku wtórnym. Z tym drugim przypadkiem mamy do czynienia, gdy osad jest zbyt długo przetrzymywany w osadniku i dochodzi do rozwoju beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych wydzielających pęcherzyki azotu cząsteczkowego.

Bakterie tworzące kłaczki nie są jedynymi organizmami występującymi w osadzie czynnym. Oprócz bakterii występują tu liczne pierwotniaki i wrotki, rzadziej robaki, pierścienice i grzyby. Biocenoza osadu czynnego ma charakter heterotroficzny.

Piramida przedstawiająca zależności troficzne w osadzie czynnym.

Bazą pokarmową całego zespołu organizmów jest materia organiczna dopływająca wraz ze ściekami. Pierwszy poziom troficzny tworzą bakterie heterotroficzne, grzyby i pierwotniaki saprotroficzne (korzenionóżki i wiciowce), które odżywiają się materią organiczną w postaci roztworów i zawiesin. Drugi poziom stanowią pierwotniaki holozoiczne (gr.holos - cały) odżywiające się całymi mikroorganizmami. Należą tu orzęski. Wreszcie, najwyższy poziom troficzny zajmują orzęski drapieżne (zwłaszcza osiadłe gatunki z grupy Suctoria, które zjadają pierwotniaki bakteriożerne) , a także bezkręgowce takie, jak wrotki, robaki z grupy nicieni i in.

Organizmy obecne we wpracowanym osadzie czynnym tworzą zespół, który powstał w wyniku procesu sukcesji. Początkowo w ściekach obecne są głównie bakterie, wiciowce (Zooflagellata) i korzenionóżki (ameby) (Rhizopoda), a więc organizmy odżywiające się materią organiczną zawartą w ściekach. Z czasem pojawiają się orzęski (Ciliata) zjadające bakterie i drapieżne. Z orzęsków najwcześniej rozwijają się formy wolno pływające, pożerające bakterie, które nie zlepiły się jeszcze w kłaczki (nie sflokulowane). W następnym etapie, gdy proces flokulacji jest już zaawansowany, pojawiają się formy osiadłe orzęsków (przyczepione do kłaczków). W ostatnim etapie rozwijają się wrotki (Rotatoria). Opisane przemiany ilustruje wykres:

Sukcesja mikroorganizmów podczas hodowli osadu czynnego

Znajomość przemian sukcesyjnych w osadzie oraz właściwości biologicznych mikroorganizmów jest przydatna w ocenie pracy oczyszczalni. Służy do tego analiza mikroskopowa próbki osadu, obejmująca, oprócz opisu wyglądu kłaczków, również badanie składu mikrofauny. Stwierdzenie dużej liczebności wiciowców i ameb (korzenionóżek), a więc pierwotniaków pionierskich, świadczy o przeciążeniu osadu i jego niedotlenieniu (a więc o warunkach przypominających początkowe etapy rozwoju osadu). Występowanie orzęsków natomiast, zwykle świadczy o dobrej pracy osadu. Dotyczy to zwłaszcza form osiadłych. Orzęski bakteriożerne wywierają stałą presję na populacje bakteryjne, które pobudzane są przez to do ciągłych podziałów. Wynikiem tego jest odmładzanie się flory bakteryjnej i jej zwiększona aktywność metaboliczna. Poza tym orzęski przyczyniają się do klarowania ścieków zjadając nie sflokulowane bakterie. Obecność w osadzie wrotków zwykle świadczy o dobrym natlenieniu osadu i jego stabilizacji.

Temat 14: Różnicowanie pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae (z gr. enteron - jelito) tworzą obszerną rodzinę pałeczek występujących głównie w jelicie człowieka i zwierząt. Z tego powodu często określa się je mianem pałeczek jelitowych. Są to średniej wielkości gramujemne pałeczki, nieprzetrwalnikujące, ruchliwe lub nieruchliwe, posiadające otoczki lub bezotoczkowe, rosnące na zwykłych podłożach. Ich wspólnymi cechami biochemicznymi są:

• szybka fermentacja glukozy (także w warunkach beztlenowych)

• redukcja azotanów do azotynów,

• ujemna reakcja na oksydazę cytochromową.

Prawie wszystkie pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają katalazę (enzym rozkładający H₂O₂). W kwasie DNA tych bakterii suma cząsteczek guaniny i cytozyny (G+C) wynosi 39-59%. Granic między poszczególnymi rodzajami nie są ostre, spotyka się liczne formy przejściowe. Dlatego klasyfikacja tej rodziny nie jest jeszcze ostatecznie ustalona.

Zgodnie z klasyfikacją podaną przez Bergeys Manual of Determinative Bacteriology rodzinę Enterobacteriaceae dzielimy na 5 trybów:

Tryb I - Escherichieae - obejmuje rodzaje: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigiella

Tryb II - Klebsielleae - obejmuje rodzaje: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia

Tryb III - Proteae - obejmuje rodzaj Proteus

Tryb IV -Yersinieae - obejmuje rodzaj Yersinia

Tryb V - Erwinieae - obejmuje rodzaj Erwinia.

Podział na tryby oparto głównie na podobieństwie składu DNA, które jest wyrazem pokrewieństwa mikroorganizmów.

Część pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae powoduje zakażenia przewodu pokarmowego (Shigella wywołująca czerwonkę, czy Salmonella powodująca dur brzuszny lub tzw. salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe), inne zaliczamy do względnie chorobotwórczych lub komensali (mikroorganizmów w zasadzie niechorobotwórczych, które zazwyczaj współżyją z organizmem gospodarza). Jednak przeniknięcie niektórych komensali do miejsc w organizmie, w których normalnie nie występują, może stać się przyczyną niebezpiecznych zakażeń. Szczepy Klebsiella pneumonieae, Escherichia coli (pałeczki okrężnicy), Proteus sp. i inne, mogą spowodować trudne do wyleczenia zakażenia dróg moczowych, oddechowych, posocznice u wcześniaków i noworodków.

Jako że dla większości pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae naturalnym miejscem bytowania jest przewód pokarmowy człowieka i zwierząt, ich obecność w innych miejscach, np. w wodzie, glebie, czy w produktach żywnościowych traktowana jest jako wskaźnik bezpośredniego lub pośredniego zanieczyszczenia fekalnego (kałowego). Przykładem może tu być szerokie stosowanie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) w ocenie stanu sanitarnego wody.

Pałeczki Enterobacteriaceae, poza nielicznymi wyjątkami, nie wykazują większych różnic morfologicznych komórek lub kolonii, umożliwiających odróżnienie rodzajów i gatunków. Różnicowanie w ich obrębie oparte jest głównie na określeniu właściwości biochemicznych badanego szczepu. Analizie takiej poddaje się szczepy bakterii wyizolowane z badanego materiału na podłożach wybiórczo-namnażających (SF, Levin, Mc Conkey, SS, Wilson - Blair). Kryterium zaliczenia pałeczek do określonego rodzaju stanowi zespół właściwości biochemicznych, takich jak:

• wytwarzanie niektórych metabolitów (indol, H₂S),

• rozkład cukrów i alkoholi (laktoza, mannitol, dulcytol),

• rozkład aminokwasów (deaminacja, dekarboksylacja),

• przemiany pewnych związków (mocznik, malonian),

• aktywność niektórych enzymów (oksydaza, katalaza).

Diagnostykę bakterii z rodziny Enterobacteriaceae poprzedza wykonanie oznaczeń potwierdzających zdolność wyizolowanych szczepów do:

• wytwarzania oksydazy,

• fermentacji glukozy i

• redukcji azotanów.

Następnie należy przystąpić do bezpośredniej identyfikacji bakterii do rodzaju i gatunku, na podstawie schematów biochemicznych. Badania przeprowadza się etapami.

Pierwszy z nich polega na wykonaniu tzw. szeregu izolacyjnego. Składa się on z czterech podłoży diagnostycznych:

1. wody peptonowej z tryptofanem,

2. podłoża Kliglera,

3. laktozy 10% pod parafiną,

4. podłoża z mocznikiem.

Wzrost bakterii na tych podłożach pozwala na ocenę następujących właściwości:

1. wytwarzania indolu z tryptofanu,

2. zdolności do wytwarzania siarkowodoru (H₂S),

3. wytwarzania gazu przy fermentacji węglowodanów,

4. rozkładu laktozy i mocznika.

Wyniki tych badań są podstawą do zastosowania odpowiedniego szeregu różnicującego w drugim etapie badań.

Etap trzeci, tzw. testy potwierdzające, wykonywany jest tylko w przypadkach wątpliwych, w których nie jest możliwe określenie przynależności taksonomicznej badanego szczepu na podstawie uprzednio przeprowadzonych badań.

Klasyczna diagnostyka drobnoustrojów wymaga zgromadzenia bardzo wielu danych. Jest to praca żmudna, długotrwała i wymagająca zastosowania wielu podłóż i odczynników. Jest to więc badanie drogie. Dlatego w praktyce stosuje się szereg mikrometod ułatwiających i przyśpieszających identyfikację. Metody takie zostały m.in. opracowane dla bakterii będących wskaźnikami stanu sanitarnego, np. szybka identyfikacja pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) spośród bakterii grupy coli typu kałowego możliwa jest dzięki tzw. testowi (szeregowi) IMVC. Skrót ten oznacza następujące cztery badania:

• I - badanie zdolności do wytwarzania indolu z tryptofanu,

• M - reakcja z czerwienią metylową (tzw. odczynnik MR), która przyjmuje czerwone

zabarwienie przy zakwaszeniu podłoża Clarca w wyniku rozkładu glukozy,

• V - badanie zdolności do wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoiny) z glukozy

na podłożu Clarca (tzw. reakcja Vogesa-Proskauera),

• C - badanie zdolności do wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla.

Typowe szczepy Escherichia coli wytwarzają indol z tryptofanu, rozkładają glukozę z wytworzeniem kwasu, nie wytwarzają acetylometylokarbinolu i nie potrafią korzystać z cytrynianu jako jedynego źródła węgla, a więc w teście IMVC dają wynik: ++ − −. Wyjątkowo zdarzają się szczepy E. coli indoloujemne i w tedy wynik szeregu IMVC będzie miał postać: − + − −. Według szeregu IMVC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z grupy coli, u których wcześniej stwierdzono, że fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 44⁰C.

Ważną rolę w badaniach taksonomicznych odgrywa szybkość oznaczenia właściwości biochemicznych drobnoustrojów. Powoduje to tendencję do maksymalnego upraszczania i ograniczania czynności w trakcie diagnostyki. Przykładem tych uproszczeń może być zestaw podłoży Pathotec paper strips oraz Enterotube. Zestaw Pathotec zawiera paski bibuły nasycone odpowiednimi reagentami. Użycie ich pozwala w ciągu kilku godzin oznaczyć takie właściwości szczepu, jak: redukcja azotanów, deaminacja fenyloalaniny, wytwarzanie ureazy, siarkowodoru, dekarboksylacja lizyny, rozkładanie malonianu sodowego i eskuliny.

Zestaw Enterotube zawiera w jednej plastikowej probówce (ang. tube - rurka, probówka) 8 podłoży pozwalających na jednoczesne określenie 11 cech biochemicznych: rozkład glukozy do kwasu i gazu, rozkład laktozy, dulcytolu, deaminacja fenyloalaniny, dekarboksylacja lizyny i ornityny, wytwarzanie siarkowodoru, indolu, rozkład mocznika oraz zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Dodatkową zaletą omawianego zestawu jest łatwość i szybkość posiewu (jednorazowe przeciągnięcie ezy przez wszystkie podłoża) oraz możliwość odczytania wyników nawet przez pomocniczy personel, w oparciu o zamieszczone schematy barwne.

W Polsce produkowany jest zestaw pod nazwą Enteroplast. Są to plastikowe płytki ze studzienkami zawierającymi bezwodne podłoża z substratami różnicującymi. Pozwalają one na oznaczenie 10 cech biochemicznych na podstawie pojawienia się określonego zabarwienia podłoża. Do studzienek wprowadza się zawiesinę badanego szczepu bakterii i poddaje inkubacji w temp. 37⁰C przez 24 godz. W studzienkach bada się następujące reakcje:

• Fermentacja cukrów. W pięciu studzienkach znajdują się cukry: glukoza, sacharoza, laktoza, rafinoza i mannitol (alkoholowa pochodna glukozy). Jeśli bakterie fermentują dany cukier z wydzieleniem kwasu, to podłoże przyjmuje zabarwienie żółte, z powodu zmiany zabarwienia wskaźnika pH obecnego w studzienkach, reagującego na obniżenie odczynu,

• Aktywność ureazowa. Aktywność urazowa polega na hydrolizie mocznika z wydzieleniem amoniaku. Jako że amoniak w środowisku wodnym ma odczyn alkaliczny, obecny w podłożu odpowiedni wskaźnik pH zmienia zabarwienie na czerwone jeżeli dojdzie do hydrolizy mocznika.

• Wytwarzanie siarkowodoru w wyniku redukcji siarczynów. W przypadku powstawania siarkowodoru, reaguje on z obecnymi w podłożu kationami żelaza dając czarny osad siarczku żelaza.

• Deaminacja fenyloalaniny. Reakcja ta polega na odłączeniu grupy aminowej (deaminacji) od aminokwasu fenyloalaniny. W efekcie powstaje kwas fenylopirogronowy, który z chlorkiem żelazowym FeCl₃, dodawanym po inkubacji, daje związek o zabarwieniu zielonym.

• Powstawanie indolu z tryptofanu. Przekształcenie aminokwasu tryptofanu w indol, wykrywa się przez dodanie do studzienki, po okresie inkubacji, odczynnika Kovacsa. Powstanie różowego zabarwienia świadczy o wyniku dodatnim. Jest to jedna z reakcji (I) z szeregu IMVC.

• Wzrost na podłożu z cytrynianem jako jedynym źródle węgla. Bakterie zdolne do wzrostu na tym podłożu rozkładają cytrynian, czemu towarzyszy alkalizacja. Obecny w pożywce wskaźnik pH zmienia wówczas barwę na niebieską. Jest to jedna z reakcji (C) z szeregu IMVC.

• Beztlenowa dekarboksylacja lizyny. Reakcja ta polega na odłączeniu grupy karboksylowej (dekarboksylacji) od aminokwasu lizyny. Przemiana zachodzi w warunkach beztlenowych, stworzonych przez zalanie studzienki sterylną parafiną. W efekcie powstają aminy, które alkalizują podłoże zmieniając jego zabarwienie na fioletowe.

• Kwaśna fermentacja glukozy. W studzience znajduje się podłoże Clarca z glukozą. Jeżeli badana bakteria rozkłada glukozę z wytworzeniem kwasu, dojdzie do obniżenia odczynu do pH < 4,5. Po dodaniu czerwieni metylowej podłoże zmieni zabarwienie na czerwone. Jest to jedna z reakcji (M) z szeregu IMVC.

Na podstawie uzyskanych reakcji barwnych określa się rodzaj bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, korzystając z dołączonych tabel.

Oznaczanie podstawowych cech biochemicznych w tego typu testach pozwala tylko na przybliżoną identyfikację szczepu. Precyzyjne określenie przynależności gatunkowej możliwe jest dopiero po rozszerzonym badaniu biochemicznym i serologicznym (z zastosowaniem specyficznych przeciwciał).

---