Temat zajęć: Fotometryczne oznaczanie zawartości białka

Prowadzący: Dr inż. Sławomir Orzechowski

Wykonanie: xxxxx

Cel: Celem głównym ćwiczenia było zapoznanie z zasadami, na których oparte są najczęściej stosowane metody oznaczania białka - związane z cechami jego budowy. Celem szczegółowym było zetknięcie się, na przykładzie metody Lowry'ego i współpracowników, oraz metody spektrofotometrycznej z często wykonywaną analizą ilościową białka.

1. Metoda spektrofotometryczna.

Opis: Wykonałam ćwiczenie zgodnie z zaleceniami w skrypcie i z wskazówkami prowadzącego. Zmierzyłam wartość absorbancji dla otrzymanego roztworu przy długości fali 260 i 280 nm. Wyniki zapisałam i użyłam do obliczeń.

Obliczenia: Uzyskane wyniki to 0,037 (dla 260nm) i 0,050 (dla 280 nm). Wstawiam je do wzoru:

Białko (mg/ml) = 1,55 x A₂₈₀ - 0,76 x A₂₆₀

Białko (mg/ml) = 1,55x0,037 - 0,76x0,050 = 0,04938 mg/ml

Następnie korzystam ze schematu rozcieńczeń:

500 mg → 1000ml

↓

2,5 ml → 10 ml → 0,5 ml

Obliczam zawartość białka w próbce:

1ml - 49,38 μg

10ml - 493,8 μg

(493,8 x 1000) / 2,5 = 197520 μg = 197,52 mg

Oraz jego zawartość procentową:

500 mg - 100%

197,52 mg - y%

y = 39,504%

Zatem zawartość białka w próbce wynosi 197,52 mg, co stanowi 39,5 % czystego białka w preparacie handlowym.

2. Metoda da Lowry'ego i współpracowników.

Opis: Wykonałam ćwiczenie zgodnie z zaleceniami w skrypcie i z wskazówkami prowadzącego. Zmierzyłam wartość absorbancji dla 5 roztworów przy długości fali 750 nm oraz dla roztworu otrzymanego w dwóch powtórzeniach (Rząd A i B). Wyniki zestawiłam w tabelce, obliczając przy okazji średnią dla każdego roztworu:

Roztwory białka	20	40	80	140	200	Roztwór otrzymany
Rząd A	0,091	0,154	0,250	0,420	0,533	0,338
Rząd B	0,107	0,158	0,305	0,364	0,519	0,320
Średnia absorbancja dla 750 nm	0,099	0,156	0,278	0,392	0,526	0,329

Następnie sporządzam wykres za pomocą programu Graph(v.4.3), zaznaczając absorbancję dla danego roztworu (szary romb) i stężenie (szary X):

Korzystając z funkcji, którą obliczył program (wzór funkcji Krzywej wzorcowej), obliczam stężenie białka.

f(x) = 0,0028020588 * x + 0

0,329 = 0,0028020588 * x

x = 0,329 / 0,0028020588

x = 117,4137 μg/ml

Zatem w 0,5 ml znajduje się 58,70683 μg białka

Obliczam zawartość białka w próbce:

0,5 ml - 58,70683 μg

10 ml - 1174,137 μg

(1563,136 x 1000) / 3,5 = 469654,7 μg = 469,6547 mg

Oraz jego zawartość procentową:

500 mg- 100 %

469,6547 mg - z %

z=93,93 %

Zatem zawartość białka w probówce wynosi 469,6547 mg, co stanowi 93,93 % czystego białka w preparacie handlowym.

Wnioski:

Porównując wyniki obu metod, stwierdzam, że metoda Lowry'ego i współpracowników daje lepsze wyniki - bliższe prawdzie.

Niestety jest to metoda dłuższa (dwuetapowa) i polega na skonstruowaniu krzywej wzorcowej białka. Nie dość, że dobranie białka jest zazwyczaj dosyć kłopotliwe, to stworzenie krzywej dopasowanej do wyników empirycznych jest obarczone pewnym błędem. Błąd ten może wynikać z dokładności przeprowadzającego doświadczenie - pobrane próbki mogą mieć objętość mniej lub bardziej dokładnie pobraną pipetą; dopasowania białka; jak również ze sposobu pobierania cieczy - jeśli stosowane są pipety automatyczne, błąd ten można pominąć.

Druga metoda (spektrofotometryczna), jest mniej dokładna. Dość duży błąd tej metody może wynikać z podanego wzoru na ilość białka w mg/ml. Jest to wzór ustalony empirycznie dla danego białka, lecz zawiera w sobie dość duży błąd. Zaletą tej metody jest jej szybkość i jednoetapowość; wadą - mała dokładność i duży błąd wyniku.

---