Wykład 10

Mutacja

Metody częstości mutacji mogą być bezpośrednie i wtedy częstość danej mutacji = częstość pojawienia się danej cechy dominującej u potomstwa rodziców niewykazujących tej cechy, i pośrednie, polegające na założeniu, że w populacji zachodzi równowaga pomiędzy przyrostem częstości genów spowodowanym mutacjami, a zmniejszeniem się częstości zmutowanego allela w wyniku selekcji.

Częstość mutacji przypadających na jedną gametę to:

m = (1 - f) a

f - współczynnik adaptacji biologiczne mutantów

a - częstość występowania cechy

Tam jest dla cech autosomalnych recesywnych

f = liczba potomstwa mutantów / liczba osób z cechą wyjściową

Wzór dla częstości cechy sprzężonej z chromosomem X

X_m = 1/3 (1 - f) a

a - częstość cechy występującej u kobiet

Mutacje cechy dominującej:

• częstość mutacji 2m = P(A) x S

• tempo mutacji m = [ P(A) x S]

Mutacje cechy recesywnej

• częstość = tempo mutacji m = q² x S

Selekcja

Jeżeli poszczególne fenotypy danej pary cech nie są równoważne pod względem śmiertelności i rozrodu, występuje dobór naturalny. Powoduje to oddalenie od teoretycznego rozkładu cech w populacji. Dobór naturalny wywołany działaniem czynników abiotycznych i biotycznych środowiska jest podstawowym mechanizmem mikroewolucji.

Selekcja dotyczny tylko cech dziedziczących się i jest nieskuteczna w zakresie czystej linii, czyli u homozygot. Działa ona w gametogenezie, embriogenezie i rozwoju postnatalnym.

Selekcja cechy dominującej jest szybka, a cechy recesywnej wolna i mniej wydajna, ponieważ znaczna część genów zachowuje się w heterozygotach, które zwykle nie podlegają doborowi naturalnemu.

Współczynnik selekcji ujemnej jest to ułamek wskazujący, jaka część osobników o danym fenotypie ginie lub nie dochodzi do rozrodu.

Wzór na częstość fenotypu w n-pokoleniu

• fenotyp dominujący P(A)_n = 2pq (1 - S)ⁿ

• fenotyp recesywny P(a)_n = [q₀ / (1 + nq₀)]²

Dryf genetyczny

Miarą wielkości dryfu genetycznego jest odchylenie standardowe allela ulegającego dryfowi. znak + i - oznaczają, że częstość allela może wzrastać lub maleć. Dryfowi ulegają osobnicy, nie allele!

S_q = -⁺.....

Genoterapia

Genoterapia to nowoczesna metoda leczenia wszystkich wrodzonych błędów genetycznych polegająca na wprowadzaniu z zewnątrz prawidłowego genu do komórek chorego w taki sposób, aby gen ten przyjął funkcje nieprawidłowego genu. Ponadto terapia genowa może być wykorzystana w leczeniu niektórych ciężkich chorób nabytych takich jak nowotwory, AIDS, w których dotychczasowe metody nie przyniosły zadowalających efektów. Są 2 typy genoterapii.

Metoda ex vivo

polega na tym, że pobiera się komórki chorego, utrzymuje się w hodowlach in vivo wprowadza do nich terapeutyczne geny. Następnie komórki te zostają ponownie wczepione do organizmu chorego. Jest to metoda o tyle wygodna, że można wybrać odpowiedni typ komórek i wprowadzić gen terapeutyczny w odpowiednie m-ce w genowie. ¾ genoterapii wykonuje się ta metodą.

Metoda i vivo

polega na tym, ze terapeutyczny gen wprowadza się bezpośrednio do organizmu chorego za pomocą wektora. Do terapii ta metoda nadaje się najlepiej przypadki wrodzonych błędów metabolizmu powstające zazwyczaj w wyniku mutacji pojedynczego genu kodującego określony enzym - pozytywne wyniki w leczeniu mukowiscydozy i ciężkiej niewydolności immunologicznej. Metoda ta wydaje się być bezpieczniejsza i skuteczniejsza.

Skuteczność metody zależy od tego czy nowo wprowadzony gen jest aktywny tzn. czy zachodzi jego transkrypcja i to w dostatecznym natężeniu i czy działa on wystarczająco długo, aby uzyskać efekt terapeutyczny.

Aby gen mógł podlegać transkrypcji i translacji muszą zostać pokonane 3 podstawowe metody:

1. trudna penetracja przez błonę komórkową, która jest nieprzepuszczalna dla cząstek o ujemnym ładunku elektrycznym,

2. degradacja DNA lub RNA wewnątrz komórki przez nukleazy,

3. trudności w penetracji błony jądrowej komórek, aby dostać się do wnętrza jądra.

Ad. 1. te trudności pokonuje się umieszczając transportujący gen w odpowiednim wektorze (liposomy lub polikardiony) wektory ułatwiające penetrację błony

Ad. 2. uniknięcie wymaga odpowiedniej modyfikacji całego wektora lub przenoszonego fragmentu kwasu nukleinowego

Ad. 3. stosuje się wektory wirusowe, które w cyklu życiowym się wbudowuje do chromosomu komórkowego i wprowadza geny terapeutyczne.

Ekspresja genu terapeutycznego można uzyskać również bez jego integracji z chromosomem komórkowym - w tym przypadku funkcjonuje on jako, epison, czyli gen znajdujący się w cytoplazmie, którego ekspresja jest stosunkowo krótka. Po pewnym czasie zostaje on zdegradowany przez nukleazy i dlatego procedurę należy powtarzać co kilka tygodni lub miesięcy.

Dla trwałości wyników genoterapii ogromne znaczenie ma wybór właściwego typu komórek do translacji. Przy odpowiednim doborze komórek i zastosowaniu właściwego wektora ekspresja genu terapeutycznego może trwać nawet całe życie.
Komórkami takimi są przede wszystkim komórki pnia hemopoetycznego, z którego powstają wszystkie komórki krwi. Używa się także komórek nabłonka dróg oddechowych nabłonka, fibroblastów, hepatocytów, bioblastów, biocytów, neuronów, asterocytów OUN.

Najczęściej stosowanymi wektorami są wektory wirusowe: retrowirusy, adenowirusy i Herpex simplex. Przed wykorzystaniem wirusa należy usunąć z niego geny niezbędne do funkcji wirusowych, zapobiega to rozwojowi wirusa w organizmie. Takie delecyjne wirusy określa się jako przygotowane. Podany gen wprowadza się do przygotowanego wirusowego genomu. Zaletą wektorów retowirusowych jest ich duża łatwość integracji z genomem biorcy, natomiast wadą - niezbędność obecności komórek dzielących się. Wektory adenowirusowe mogą transfekować komórki postmitotyczne, a więc niedzielące się, np. neurony; wykazujące małą cytotoksyczność, ale ich działanie jest krótkotrwałe. Wirusy HSV mogą pozostawać w komórce na etapie nie replikującego się prionu.

Wadami wszystkich wektorów wirusowych są:

• mała wydajność systemu przenoszenia genów

• uruchamianie przez nie odpowiedzi immunologicznej

• bliskie pokrewieństwo z wirusami indukującymi nowotwory

Z tego względu obecnie kładzie się większy nacisk na wektory niebiologiczne. Najbardziej obiecującymi są: liposomy, lipidowe micelle, które mogą być użyte do przenoszenia DNA przez błonę komórkową wielkość odcinków DNA może być dowolna, nie wywołuje ona odpowiedzi immunologicznej, mogą działać zarówno in vivo jak i ex vivo, ale przenoszone przez nie fragmenty DNA ulegają degradacji z chromosomem gospodarza tylko z niewielką częstością.

Genotrapia nowotworów polega na:

1. Eliminowanie funkcji nieprawidłowych genu i hamowanie transkrypcji DNA - metoda ta jest stosowana do usuwania lub wycinania nadmiernie aktywnych, nieprawidłowo działających antygenów.

2. aktywacji odporności przeciwciał przez transport komórek odpornościowych organizmu tj. limfocytów i makrofagów.

3. wprowadzaniu genów samobójczych - t tym celu albo uzyskuje się wektor in vivo wprost do guza lub dożylnie. Komórki nowotworowe są transfekowane genem kodującym białko zwiększające toksyczność chemiterapeutyków, metoda ta jest skuteczna w fazie S cyklu komórkowego. Druga metoda polega na utrzymaniu genów zmniejszających metabolizm komórek nowotworowych np. gen cytochromu H50, który wewnątrz komórki przekształca niektóre cytostatyki w bardzo aktywne formy silnie toksyczne dla komórek. Metoda ta jest skuteczna we wszystkich fazach cyklu komórkowego.

4. zwiększenie odporności prawidłowych komórek szpiku na leczenie chemioterapeutyczne poprzez wprowadzenie do komórek szpiku kostnego większych dawek bez obawy uszkodzenia szpiku.

Genoterapię stosuje się do tej pory w nowotworach takiego typu jak: glejak wielopostaciowy, rak nerki, okrężnicy gruczołu piersiowego, krokowego, raku płuc i czerniaka.

Genoterapia błędów metabolicznych - obiecującymi obiektami terapii są: talasemia i inne hemoglobinopatie, wrodzone niedobory immunologiczne - w 20% przypadków mamy do czynienia ciężkim niedoborem spowodowanym brakiem aktywnego enzymu dezaminazy adenozyny - jest on dziedziczony autosomalnie recesywnie i przejawi się w pierwszych miesiącach życia ciężkimi zarażeniami wirusowymi i bakteryjnymi. Dzieci wykazują limfopenię, nie wytwarzają immunoglobin, maja wady układu kostnego i objawy chorobowe z strony nerek i ukł. moczowego. W leczeniu stosuje się wiele wstrzyknięć antologicznych limfocytów T zależnych od interleukiny 2, które zostały transfekowane ex vivo genem D-amiazy adenozyny za pomocą wektora retrowirusowego.

Mukowiscydoza - leczenie genowe polega na wprowadzaniu do komórek nabłonka prawidłowego genu CFTR. Jest to gen kodujący białko błon komórkowych zwane regulatorem przewodzenia transmembranowego. Ten gen wprowadzany jest wektorem liposomowym lub adenowirusowym. Wektor podaje się donosowo lub podczas bronchoskopii, ale działanie jest krótkotrwałe. Ostatnio zmodyfikowano i ulepszono wektory, które zbudowane są z promotora genu wirusa i promotora genu surfaktantu - taki wektor jest trwały przez ok. 10 dni.

Fenuloketonuria i wady cyklu mocznikowego - wydaje się, że genoterapię będzie można zastosować również w przypadku chorób zakaźnych i pasożytniczych np.: przy zakażeniach salmonellą, Mycobacterium, Schistosoma, Leischmania, Plasmodium.

Dotychczas prawie wszystkie przeprowadzane u człowieka genoterapie były dokonywane u osób dorosłych z wyjątkiem udanej genoterapii niedobory dezaminazy adenozyny, które wykrywano u dzieci.

Ponieważ wrodzone błędy metabolizmu i związane z nimi ciężkie stany chorobowe ujawniające się u bardzo małych dzieci, a nawet noworodków, wobec tego za genoterapie w późniejszym wieku jest już za późno (albo pacjent umrze albo zmiany są zbyt zaawansowane, żeby przeprowadzić skuteczne leczenie).

w tej sytuacji wprowadzenie terapeutycznego prawidłowego genu do komórek dałoby najlepsze rezultaty, gdyby przeprowadzić je przed urodzeniem. Dodatkowe korzyści genoterapii płodowej to możliwość wprowadzenia genu terapeutycznego do komórek pnia, co zapewnia jego ekspresję o dużej liczbie komórek pochodzenia z transfekowanego pnia. Istnieje jednak jeden warunek - obce geny nie mogą pod żadnym pozorem uprowadzone do komórek linii płciowej. Musi być to koniecznie genoterapia somatyczna.

Głównym celem genoterapii płciowej jest:

• wprowadzenie terapeutycznych genów możliwie wcześnie, aby zapobiec nieodwracalnym zmianom w tkankach

• zapewnienie trwałej ekspresji genu przez wbudowanie go do genomu biorcy

• zapobieżenie potencjalnym reakcjom immunologicznym, które mogą wystąpić po urodzeniu (u płodu występuje z reguły zjawisko tolerancji)

• wykorzystanie faktu, że u płodu istnieje możliwość wprowadzenia terapeutycznego genu do narządu, które po urodzeniu nie są dostępne dla genoterapii.

Chorobami, w których genoterapia płodowa stwarza większe szanse uzyskania efektów terapeutycznych, niż genoterapia przeprowadzona później, są:

• mukowiscydoza

• defekt, dekarboksylazy ornityny

• dystrofia mięśniowa typu Dischena

Wektorami dla somatycznej genoterapii płodowej mogą być integrujące się z genomem błony. Zmodyfikowane retrowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom. Wektory nieintegrujące się z genomem biorcy, ale nadające się do genoterapii płodowej to adenowirusy i kompleksy DNA z lipidami.

Miejscami wprowadzenia genów terapeutycznych u płodu może być jama owodni, otrzewnej i płodowy układ krążenia.

Prawie 13% projektów genoterapii dotyczy terapii chorób monogenowych.

Ponad 65% - terapii nowotworów

Około 8% - choroby infekcyjne

70% badań wykonuje się w USA, a 20% w Europie. Jednym z projektów (terapia czerniaków) prowadzony jest także w Polsce.

Blisko 70% badań znajduje się na I etapie trójfazowego testu klinicznego.

Manipulacje genetyczne mogą być przeprowadzane na ludziach tylko w celach terapeutycznych i tylko na komórkach somatycznych.

Terapia germinalna - gdy dokonamy w komórce rozrodczej na ich wczesnym etapie rozwoju jest prawie zabroniona.

Komisja etyki Lekarskiej Akademii Umiejętności i komitet Etyki w Nauce PAN

1,5 mld lat temu - 50'C

2,5 mld lat temu - odwodnienie planety

1

---