SEMINARIUM 3-4

1. KATALIZA, ENERGIA AKTYWACJI - definicja pojęć.

• KATALIZA - jest to zjawisko polegające na zwiększeniu szybkości reakcji chemicznej i/lub skierowaniu reakcji na jedną z kilku możliwych termodynamicznie dróg prowadzących do różnych produktów, w obecności niewielkich ilości substancji zwanych katalizatorami. Substancje te tworząc nietrwałe połączenia przejściowe, nie są jednakże zużywane w reakcji i nie występują w jej równaniu stechiometrycznym. Katalizator nie zmienia przy tym położenia równowagi chemicznej, wpływa jedynie na szybkość dochodzenia układu do tego stanu.

• Katalizator definiuje się więc jako substancję, która zwiększa szybkość z jaką reakcja chemiczna osiąga stan równowagi, sama się jednak nie zużywa i której symbol nie występuje w równaniu stechiometrycznym.

• ENERGIA AKTYWACJI - jest to najmniejsza ilość energii, którą trzeba dostarczyć 1 molowi substancji, aby 100% cząsteczek uległo aktywacji.

• Stan przejściowy - największa energia swobodna ze wszystkich związków w danej reakcji.

2. ENZYMY A KATALIZATORY NIEORGANICZNE - podobieństwa i różnice.

• Enzymy to katalizatory, które zwiększają szybkość przemiany substratów w produkty, a budowa ich po reakcji nie ulega zmianie.

• Działalność enzymów pozwala na obniżenie energii aktywacji

• same Ne podlegają przemianie (budowa i właściwości są takie same przed i po reakcji)

• Enzymy wykazują zdolność przyspieszenia reakcji chemicznej tylko takiej, która jest termodynamicznie możliwa ( tzn. energia substratów musi być większa od energii produktów) - w ich obecności reakcja może zachodzić 10⁶ - 10¹⁵ razy szybciej

• STRUKTURA:

1. białka

2. (RNA) - rybozymy

3. specyficzne względem substratów i produktów

4. aktywność podlega regulacji

• DZIAŁANIE enzymów polega na:

1. obniżaniu energii aktywacji

2. stabilizacji stanu przejściowego

3. nie zmienia energii substratów i produktów

np. katalazy w reakcji: 2 H₂O₂ ------ H₂O + O₂ obniżają energię aktywacji z 75 do 8,4 kJ/mol, prędkość reakcji zwiększa 300 mld razy




ENZYMY KATALIZATORY NIEORGANICZNE




1. to białka (znane są reakcje katalizowane związki nieorganiczne

przez RNA)




2. często do reakcji wymagają dodatkowej

cząsteczki zwanej koenzymem

3. charakteryzują się dużą specyficznością

do substratu

4. obniżają energię aktywacji obniżają energię aktywacji

5.

3. HOLOENZYM, APOENZYM, KOENZYM, GRUPA PROSTETYCZNA - definicje pojęć, funkcje w katalazie

• KOENZYM - drobnocząsteczkowe związki organiczne lub jony nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest niezbędna do katalitycznego działania tego enzymu.

a) Określa rodzaj katalizowanej reakcji. Może brać udział w różnych reakcjach chemicznych zależnie od białka z którym jest związany.

b) Koenzymy są składnikami łatwo odszczepialnymi, tworzącymi luźne połączenia z białkiem enzymatycznym

• APOENZYM - to część białkowa enzymu.

Decyduje o specyficzności substratowej enzymu czyli jaki substrat ulega przemianie w produkt oraz o kierunku reakcji (ten sam substrat może dawać różne produkty)

• HOLOENZYM = APOENZYM + KOENZYM

• Koenzym i grupa prostetyczna enzymu decydują najczęściej o rodzaju katalizowanej przez ten enzym reakcji

• GRUPA PROSTETYCZNA - jest to niebiałkowy składnik enzymu związany z nim stosunkowo trwale i tworzący z białkiem pozornie niedysocjujące połączenia.

Ich oddzielenie i ponowne połączenie z białkiem nie zawsze prowadzi do odtworzenia katalitycznie czynnego enzymu.

Przykłady:

- pochodne flawinowe - FAD, FMN

dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, oksydaza aminokwasowi, dehydrogenaza acyloCoA, dehydrogenaza aldehydowa, dehydrogenaza kwasu liponowego.

- żelazoporfiryny

oksydaza ksantynowa, katalaza, peroksydaza

• Różnice pomiędzy grupą prostetyczną a koenzymem:

1. siły wiązania z apoenzymem

Przykłady grup prostetycznych:

- pochodne flawinowe - FAD i FMN (dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza: ksantynowa, aminokwasowa, dehydrogenaza: acyloCoA, aldehydowa, kwasu limonowego

- żelazoporfiryny - oksydaza ksantynowa, katalaza, peroksydaza

Koenzymy są składnikami łatwo odszczepialnymi. Tworzą raczej luźne połączenia z białkiem enzymatycznym. Po oddzieleniu koenzymu od apoenzymu stanowią one jednostki nieczynne katalitycznie, które po ponownym połączeniu z białkiem enzymatycznym tworzą aktywny holoenzym.

Przykłady koenzymów:

- NAD⁺ i NADP⁺ - które występują głównie w dehydrogenazach

NAD⁺ w mleeczanowej, alkoholowej i jabłczanowej

NADP⁺ - d. glukozo-6-fosforanowej

2. sposobem regeneracji w reakcji enzymatycznej

4. ROLA METALI W KATALAZIE ENZYMATYCZNEJ, metaloenzymy a enzymy aktywowane przez metale

• METALOENZYMY - zawierają atom metalu

• ENZYMY AKTYWOWANE PRZEZ METALE -

5. IZOENZYMY - definicja, metody rozdziału, znaczenie diagnostyczne

• Są to różne formy enzymów katalizujących tą samą reakcję.

• Są to cząsteczki kodowane przez różne geny - np.: CPK w mm szkieletowych, sercu i mózgu

• Izoenzymy - są to genetycznie uwarunkowane odmiany enzymu, występujące w organizmach tego samego gatunku, katalizujące tą samą reakcję, a różniące się strukturą molekularną i niektórymi parametrami kinetyki enzymatycznej

• Zazwyczaj różnią się składem podjednostkowym lub sekwencją aminokwasowi

• POCHODZENIE IZOENZYMÓW:

1. izoenzymy są wytworzone przez różne geny zajmujące różne loci - MULTI LOCI

1. geny dla danych izoenzymów mogą występować na tym samym chromosomie np.: amylaza (enzym występujący w soku trzustkowym oraz enzym występujący w ślinie jest kodowany przez geny występujący na tym samym chromosomie)

2. geny izoenzymów są na różnych chromosomach np. dehydrogenaza jabłczanowa, enzym cyklu Krebsa

2. w obrębie danego allelu występuje duży polimorfizm - czyli loci jest jedno, ale są różne postacie alleliczne genu kodującego dany enzym. Takie enzymy nazywamy ALLELOZYMAMI lub alleloenzymami np.: dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa, kluczowy enzym cyklu pentozowego. Możemy wśród formallelicznych izoenzymatycznych tego enzymu wyselekcjonować, takie formy, których aktywność będzie obniżona - enzym nie będzie pełnił swojej funkcji, a klinicznie będzie się to manifestowało hemolizą czyli rozpadem krwinki czerwonej

3. Jeśli enzym ma charakter oligomeryczny - każda z podjednostek jest kodowana przez inny gen. W efekcie może być różna asocjacja podjednostek - izoenzymy HYBRYDOWE

• Izoenzymy są bardziej charakterystyczne dla danej tkanki, niż całkowita aktywność enzymów

• Izoenzymy - zmiana profilu

1. zależna od rozwoju

np. fosfataza alkaliczna - u dzieci do około 12 roku życia, głównym izoenzymem jest izoenzym kostny. Powyżej 12 roku życia głównym izoenzymem jest izoenzym wątrobowo-żółciowy

2. zależna od choroby

np. fosfataza alkaliczna

Niespecyficzne tkankowo fosfatazy alkaliczne (pochodzenia kostnego, wątrobowego, nerkowego) są kodowane na chromosomie 1. istnieje drugi rodzaj fosfatazy alkalicznej, który jest kodowany na chromosomie 2 - w warunkach fizjologicznych pojawia się ona wyłącznie w ciąży. W niektórych chorobach nowotworowych pojawiają się izoenzymy, które przypominają izoenzym łożyskowy. Ich główna cecha fizykochemiczna to odporność na temperaturę.

Izoenzym Nagao, izoenzym Regan, izoenzym Kasahara. Pojawienie się tych izoenzymów u osoby, która nie jest w ciąży np. u mężczyzny świadczy o przestrojeniu nowotworowym komórki

• ZRÓŻNICOWANIE WŁAŚCIWOŚCI IZOENZYMÓW

1. zmienia się ruchliwość elektroforetyczna - przy czym nie zawsze jest to uchwytne rutynowymi metodami elektroforetycznymi (często wiąże się to tylko ze zmianą ładunku).

2. zmienia się rozpuszczalność

3. zmiana odporności na inaktywacje fizykochemiczna (najprostszy sposób inaktywacja cieplna, ale jest to technika dość mało specyficzna)

4. zmiana wrażliwości na inhibitory (np. L-winian stosowany przy różnicowaniu izoenzymów fosfatazy kwaśnej)

5. zmienia się aktywność molekularna czyli liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkty, w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu, w optymalnych warunkach

6. zmienia się powinowactwo do pewnych substratów - stała Michaelisa

7. zmienia się zdolność do katalizy reakcji z udziałem analogów substratów

8. zmienia się antygenowość

Antygenowość zmienia się najczęściej w dwóch przypadkach:

- są to enzymy pochodzące z różnych loci

- lub enzymy zbudowane z różnych podjednostek

Czyli do oceny tych izoenzymów możemy używać metod immunologicznych

• METODY ROZDZIAŁU IZOENZYMÓW:

1. Elektroforeza

1. elektroforeza wysokonapięciowa

2. elektroogniskowanie w gradiencie pH

2. Chromatografia

1. najczęściej chromatografia powinowactwa

2. HPLC - chromatografia wysokociśnieniowa

3. Inaktywacja chemiczna - czyli stosowanie swoistych inhibitorów

4. Inaktywacja fizyczna - najczęściej cieplna

5. Właściwości katalityczne

1. używanie analogów substratów, które są przemieniane tylko przez jedną formę izoenzymu

2. używanie swoistych inhibitorów, które hamują konkretny izoenzym

6. metody immunologiczne

• Enzymy heterogenne nie będące izoenzymami

- enzymy zmodyfikowane posttranslacyjnie

1. acylacja - enzym jest inny, ma inną ruchliwość elektoferetyczną

2. przyłączenie reszty cukrowej - glikacja - ma duże znaczenie, występuje głównie w cukrzycy. W wyniku takiej glikacji szereg enzymów, w tym enzymy antyoksydacyjne jak: dysmutaza ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa tracą swą aktywność. Mają one inną ruchomość elektroforetyczną, inne powinowactwo do substratu, ale nie są izoenzymami (jest to nieprawidłowo zmutowane białko)

3. Przemiana proenzymu w enzym - proenzym i enzym jest to ten sam enzym, ale raz w formie nieaktywnej, a raz w aktywnej

4. D-amidacja

5. Powstawanie mostka disulfitowego - np. t-PA w formie łańcuchowej i dwułańcuchowej - jest to to samo białko enzymatyczne

6. zmiany w fosforylacji - np. aktywna i nieaktywna fosforylaza (enzym biorący udział w glikogenolizie i glikogenogenezie). Są to różne formy enzymu, ale nie izoenzymy

7. Asocjacja z innymi białkami - szczególnie lubią asocjować z enzymami immunoglobuliny np. amylaza trzustkowa może połączyć się z Ig i wtedy jej pewne właściwości ulegają zmianie

8. agregacja molekuł - powstają formy dimeryczne (oligomeryczne)

6. CENTRA AKTYWNE ENZYMU

• centrum aktywne - to miejsce, które wiąże substraty i odpowiada za przebieg reakcji katalizowanej przez enzym

• Miejsce aktywne zajmuje stosunkowo małą część całkowitej objętości cząsteczki enzymu

• Miejsce aktywne jest układem przestrzennym złożonym z grup chemicznych reszt aminokwasowych, zajmujących różne liniowo odległe pozycje.

• Aminokwasy biorące bezpośredni udział w katalizie znajdują się w odległości 0,2 nm od substratu

• W tworzeniu miejsca aktywnego uczestniczą przede reszty aminokwasowi, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami lub akceptorami protonów

Np. grupy β - karboksylowe asparaginianu

grupy γ - karboksylowe glutaminianu

grupy ε - aminowe lizyny

atomy azotu zawarte w pierścieniu imidazolowym histydyny

grupy -OH seryny, treoniny i tyrozyny

grupy -SH cysteiny

• TEORIE WIĄZANIA SUBSTRATU PRZEZ ENZYM:

1. Teoria E. Fischera - zakładała, że substrat pasuje do centrum aktywnego enzymu jak klucz do zamka

2. Teoria D. E. Koshland - aktualnie dominująca - miejsce aktywne enzymu wytwarza się w chwili kontaktu enzymu z substratem

• Centrum aktywne = miejsce aktywne . W jego obszarze wyróżnia się:

1. miejsce wiązania substratu ( miejsce określające swoistość enzymu)

2. miejsce katalityczne, gdzie zachodzi reakcja

3. w przypadku enzymów allosterycznych - miejsce wiążące efektor czyli centrum allosteryczne

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią - dzieli się

na cztery kategorie:

1. aminokwas lub a m i n o k w a s y b e z p o ś r e d n i o d z i a ł a j ą c e ; w enzymach złożonych ich rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne,

2. a m i n o k w a s y w s p o m a g a j ą c e ,

3. aminokwasy kontaktowe , zwane również w i ą ż ą c y m i ,

4. aminokwasy pomocnicze .

Aminokwasy pomocni c ze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są

do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego

(można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego).

Aminokwasy kont aktowe (w i ą ż ą c e ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i

„wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach

kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów

7. CENTRUM KATALITYCZNE - struktura i funkcja

*

8. MODELE WIĄZANIA SUBSTRATU PRZEZ ENZYM

*

9. SWOISTOŚĆ ENZYMU WZGLĘDEM KATALIZOWANEJ REAKCJI I WZGLĘDEM SUBSTRATU

*

10. MECHANIZM KATALAZY ENZYMATYCZNEJ

*

11. STRUKTURA MOLEKULARNA ENZYMÓW - enzymy mono- i oligomeryczne, przykłady

• ENZYMY MONOMERYCZNE - są to enzymy nie mające budowy podjednostkowej. Wyróżniamy wśród nich:

1. enzymy o budowie pojedynczego łańcucha polipeptydowego np. występujący w ślinie lizozym oraz elastaza, trypsyna, heksokinaza

2. enzymy posiadające więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy np. chymotrypsyna

• ENZYMY OLIGOMERYCZNE - czyli enzymy zbudowane z podjednostek, tzn. takie, w których jeden fragment cząsteczki z drugim jest połączony wiązaniami niekowalencyjnymi.

1. Typy wiązań niekowalencyjnych występujące w cząsteczce enzymów oligomerycznych:

- najważniejsze znaczenie - oddziaływania hydrofobowe

- wiązania jonowe

- wiązania wodorowe

2. Pod względem budowy podjednostkowej można je podzielić na:

1. homooligomery

2. heterooligomery

Podział ten zależny jest od tego czy wszystkie podjednostki maja taką samą budowę, czy różną.

3. Z budowy podjednostkowej enzymu wynikają dwa podstawowe fakty:

1. Poprzez dysocjację podjednostek, czyli ich rozerwanie enzym może nie stracić zupełnie swojej aktywności, ale tor tej aktywności może się całkowicie zmienić.

Np. dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (jeden z enzymów glikolizy) w stanie natywnym występuje pod postacią tetrameru i wykazuje wtedy 2 aktywności:

- dehydrogenazy

- esterazy (hydrolaza rozrywająca wiązania estrowe)

Jeśli doprowadzimy ją do dysocjacji czyli powstanie enzym w formie dimerowej, to traci on aktywność dehydrogenazy, ale pozostaje mu jeszcze aktywność esterazy.

2. Podjednostki enzymu oligomerycznego wykazują zjawisko kooperacji między sobą co nosi nazwę allosterii.

12. KOMPLEKSY WIELOENZYMOWE - budowa, stopnie organizacji, znaczenie, przykłady

• Kompleksy wieloenzymowe - ME = MultiEnzyme Complex - jest to kompleks kilku enzymów, które katalizują reakcje zazwyczaj następujące po sobie. Łączą się one w wyżej zorganizowane struktury.

• Celem tych połączeń jest doprowadzenie do sytuacji termodynamicznej korzystnej czyli takiej, w której transfer związków pośrednich następował od jednego enzymu do drugiego bez straty energii.

• Przykłady:

1. kompleks dehydrogenazy pirogronianowej - katalizuje przemianę kwasu pirogrononowego do acetyloCo-A - czyli proces dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu

2. Najwyżej zorganizowanymi kompleksami wieloenzymowymi są kompleksy związane z błonami np. kompleks enzymatyczny łańcucha oddechowego związanego z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Strata energii reakcji katalizowanych przez ten kompleks jest bardzo mała

3. kompleks bez tzw. pompy, w którym intermedianty (produkty pośrednie) oddysocjowują od kompleksu. Przykładem jest kompleks enzymatyczny pierwszych trzech reakcji, katalizujący biosyntezę pirymidyn - komplet CAD = MEpyr 1-3. C - oznacza syntetazę karbonoilofosforanową II = CPS II, A - ATC-aza czyli karbanoilotransferaza asparaginowa, trzecim enzymem jest dihydroprotaza.

W kompleksie tym wykryto po raz pierwszy zjawisko umownie nazwane kabałowaniem czyli channelingiem (channeling). Zjawisko to ma polegać na przemieszczaniu się w sposób preferencyjny, bez strat energii intermediantu od jednego enzymu do drugiego.

Czwarty enzym na szlaku biosyntezy pirymidyn jest enzymem wolnym

4. natomiast dwa kolejne enzymy szlaku biosyntezy pirymidyn tworzą znowu kompleks wieloenzymowy MEpyr 5-6.

• Kompleksy wieloenzymowe dotyczą różnych enzymów, które tworzą pewne ugrupowania katalizujące kolejne etapy szlaków metabolicznych

13. ENDOENZYMY, EKTOENZYMY

*

14. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ - hiperboliczna i niehiperboliczna, sposoby jej przedstawiania, ocena powinowactwa enzym-substrat.

• Kinetyka reakcji enzymatycznych - określa szybkość i przebieg reakcji. Jest ważnym czynnikiem umożliwiającym zachowanie homeostazy przez dostosowanie szybkości reakcji enzymatycznych w organizmie do aktualnych warunków środowiska lub bodźców hormonalnych.

• Hiperboliczną kinetykę reakcji enzymatycznej obrazuje model Michaelisa - Menten.

1. Jego założeniem jest, że zawsze się tworzy kompleks E-S jako pośredni etap całego procesu

2. Równanie Michaelisa - Menten określa zależność szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.




V - prędkość katalizowanej reakcji

V_max = prędkość max. jaką można byłoby teoretycznie osiągnąć w warunkach optymalnych

[S] - stężenie substratu

K_M - stała Michaelisa, równa takiemu stężeniu substratu, przy którym prędkość reakcji jest równa połowie prędkości maksymalnej.

3. Jeżeli stężenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania połowy szybkości max., to szybkość reakcji zależy od stężenia substratu, bo V_max i K_M są wielkościami stałymi

[S] << K_M


4. Jeżeli [S] jest znacznie większe od K_M, to szybkość początkowa V , jest szybkością maksymalną V_max

V = V_max

[S] >> K_M

5. Gdy [S] = K_M to prędkość początkowa równa się połowie szybkości maksymalnej reakcji

V = ½ V_max

[S] = K_M

15. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

1. Temperatura

2. pH

3. stężenie enzymu

4. stężenie substratu

5. aktywatory i inhibitory

16. REGULACJA ILOŚCI ENZYMU

*

17. REGULACJA AKTYWNOŚCI ENZYMU

• Czynniki wpływające na aktywność enzymu

1. stężenie substratu

2. stężenie produktu

3. stężenie koenzymu

4. temperatura:

1. szybkość reakcji rośnie wraz ze wzrostem temperatury ( do pewnego stopnia) - jest to związane ze zwiększeniem energii kinetycznej reagujących cząsteczek

2. optimum temperatury 30 - 50⁰ C

3. ograniczona temperatura inaktywacji enzymu ( 70⁰ C)

4. współczynnik Q₁₀ (określa o ile wzrośnie prędkość reakcji przy wzroście temperatury o 10⁰ C)

Q₁₀

5. termostabilność i termolabilność - identyfikacja izoenzymu

6. enzymy bakterii termofilnych (do 100⁰ C) - polimeraza Taq

5. pH

1. optimum pH - szeroki zakres

2. większość optimum 5 - 8

6. potencjał red-ox

1. potencjał poza optimum może wywołać inaktywację

2. redukcja lub utlenienie wiązań disiarczkowych

7. stała dielektryczna - siła jonowa

8. inhibitory

9. aktywatory

18. REGULACJA KATALITYCZNEJ SPRAWNOŚCI ENZYMU (wpływ na sprawność katalityczną enzymu), interkonwsersja enzymu. Aktywacja proenzymu, kompartmentalizacja enzymów w organellach komórkowych - mechanizmy, przykłady

• Czyli zmiana aktywności enzymu bez zmian jego ilości

1. regulacja allosteryczna - regulacja aktywności enzymu poprzez wprowadzenie białka allosterycznego

1. związki pod wpływem, których enzym zyskuje aktywność to kinazy allosteryczne dodatnie (aktywatory allosteryczne)

2. związki, pod których wpływem traci aktywność to kinazy allosteryczne ujemne (inhibitory allosteryczne)

2. aktywacja proenzymów (zymogenów); np. enzymy trawienne

Niektóre enzymy, szczególnie proteazy są syntetyzowane pod postacią nieaktywnych proenzymów.

Przejście zymogenu w aktywny enzym wymaga odłączenia fragmentu cząsteczki fragmentu cząsteczki, który hamuje powstawanie lub funkcjonowanie miejsca aktywnego.

W niektórych przypadkach enzym powstały z zymogenu staje się jego aktywatorem proteolitycznym.

Zjawisko aktywacji zymogenu przez aktywną postać enzymu nosi nazwę autoaktywacji lub autokatalizy.

1. Pepsynogen - pepsyna

Pepsyna, enzym powstający w komórkach głównych błony śluzowej żołądka powstaje w postaci nieaktywnego pepsynogenu.

Zawiera on N-końcowy odcinek prekursorowi (44 aminokwasów), który jest usuwany w wyniku hydrolizy.

Proces ten zachodzi spontanicznie pod wpływem pH < 5.

Pepsyna jest białkiem silnie anionowym. W jej centrum aktywnym znajdują się 2 reszty kwasu asparaginowego - jedna grupa β - karboksylowa w postaci COO^-, druga COOH.

Odcinek prekursorowi blokuje dostęp do centrum aktywnego (ujemnie naładowane grupy karboksylowe asparaginianu i glutaminianu odcinka prekursorowego wiążą się z dodatnio naładowanymi grupami aminowymi reszt lizyny i argininy nieaktywnej pepsyny). Pod wpływem kwaśnego pH dochodzi do odsłonięcia centrum aktywnego, które hydrolizuje wiązanie peptydowe pomiędzy pepsyną a odcinkiem prekursorowym.

pepsynogen ----------
pepsyna

2. Trypsynogen - trypsyna

Enzym soku trzustkowego, który jest syntetyzowany w postaci nieaktywnego zymogenu, trypsynogenu.

Jego aktywacja zachodzi pod wpływem enzymu proteolitycznego błony śluzowej dwunastnicy - enterokinazy.

Enterokinaza odłącza odcinek prekursorowi 6-cio aminokwasowi, co powoduje zmiany konformacji w obrębie cząsteczki białka enzymatycznego. Powstająca trypsyna jest aktywatorem kolejnych cząsteczek trypsynogenu.

trypsynogen-------
trypsyna

3. Chymotrypsynogen - chymotrypsyna

Chymotrypsynogen białko jednołańcuchowe złożone z 245 reszt

aminokwasowych, którego struktura jest stabilizowana przez 5

wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych.

Centrum aktywne enzymu jest utworzone przez reszty

aminokwasowe His-51, ASP-102 i Ser-195.

I-szy etap aktywacji zachodzi pod wpływem trypsyny - hydroliza

wiązania peptydowego pomiędzy 15 i 16 aminokwasem -

powstaje dwułańcuchowa chymotrypsyna π - postać aktywna

enzymu, lecz mało stabilna.

II-gi etap - aukataliza - odłączenie dipeptydu Ser-Arg - powstaje

przejściowo chymotrypsyna δ (białko dwułańcuchowe)

III etap - dalsza proteoliza i odłączenie dipeptydu Thr-Asn -

powstaje trójłańcuchowa stabilna chymotrypsyna.

3 z pośród 5-ciu mostków dwusiarczkowych, stają się mostkami

międzyłąńcuchowymi

chymotrypsynogen----
chymotrypsyna π----
chymotrypsyna δ----
chymotrypsyna

4. Inne proteazy przewodu pokarmowego powstają pod

wpływem ograniczonej proteolizy proenzymów.

Np. pod wpływem trypsyny z odpowiednich zymogenów

powstaje elastaza czy karboksypeptydaza

3. Kompartmentalizacja - czyli brak możliwości ruchów pomiędzy przedziałami komórkowymi poprzez istnienie struktur błoniastych.

Np.:

a) syntetaza karbanoilofosforanowa II = CPS II znajduje się w cytosolu i jest odpowiedzialna za syntezę pirymidyn. Syntetaza karbanoilofosforanowa I = CPS I znajduje się w mitochondrium i jest odpowiedzialna za cykl mocznikowy. Enzymy te nie mogą zamiennie spełniać swoich funkcji.

4. Modyfikacje posttranslacyjnie białka enzymatycznego:

1. interkonwersja enzymu - czyli przyłączenie lub odłączenie reszt fosforanowych

Niektóre białka enzymatyczne są aktywowane przy udziale kinaz białkowych. Źródłem reszt fosforanowych jest ATP, a miejscem ich wiązania grupy -OH reszt seryny, treoniny lub tyrozyny.

Hydrolityczne odłączenie reszt fosforowych (defosforylacja) jest katalizowane przez fosfatazę białkową - inaktywacja enzymu.

Natomiast kinazy białkowe - aktywują enzym

Np.; aktywacja i inaktywacja fosforylazy glikogenowej

Kinaza fosforylazy glikogenowej z udziałem 4 cząsteczek ATP fosforyzuje grupy -OH seryny dwu cząsteczek nieaktywnej fosforylazy b. ufosforylowane cząsteczki asocjują i tworzą aktywną formę fosforylazy a.

Fosfataza białkowa powoduje hydrolityczne odłączenie 4 cząsteczek fosforanu i przejście w formę nieaktywną.

Równowaga pomiędzy fosforylazą nieaktywną i aktywną jest utrzymywana przez układ hormonalny.

Innym przykładem jest kompleks dehydrogenazy pirogronianowej - postać aktywna, niefosforylowana, postać nieaktywna, fosforyzowana.

2. adenylacja (ATP) - Adenylacja polega na kowalencyjnym przyłączeniu adenozynomonofosforanu (AMP) wiązaniem fosfodiestrowym do grupy hydroksylowej łańcucha bocznego aminokwasu w białku. Reakcja katalizowana jest przez transferazę adenylilową. Przykładem białka ulegającego adenylacji może być syntetaza glutaminianowa. W tym białku enzymatycznym akceptorem AMP jest grupa hydroksylowa specyficznej reszty tyrozynowej, znajdująca się w każdej podjednostce enzymu. Przyłączona wiązaniem fosfodiestrowym reszta AMP, w reakcji odwrotnej, może być usunięta z białka w wyniku fosforolizy, katalizowanej przez ten sam enzym, który przeprowadził adenylację syntetazy glutaminianowej.

3. ADP-rybozylacja (NAD⁺) - Proces ADP-rybozylacji może regulować funkcję wielu białek, w tym enzymatycznych

Mono-ADP-rybozylacja polega na przeniesieniu pojedynczej reszty

Adenozynodifosforybozy (ADP-rybozy) na białko akceptorowe w reakcji

Katalizowanej przez mono-ADP-rybozylotransferazę. Donorem grup ADP

rybozy jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+). W procesie tym

mogą być modyfikowane białka pozajądrowe komórki, mianowicie czynnik

elongacyjny EF2 procesu translacji lub białko G przez niektóre toksyny

Proces poli-ADP-rybozylacji modyfikuje białka jądrowe, takie jak histony H1,

endonukleazy. Reakcję poli-ADP-rybozylacji katalizuje ADP

rybozylotransferaza polimeryzująca, inaczej zwana syntazą poli(ADPR), która

sprawia, że w modyfikowanym białku znajdują się polimery

adenozynodifosforybozy, czyli poli(ADPR). Modyfikacja ta jest odwracalna,

ADP-rybolyzacja z reguły prowadzi do inaktywacji enzymu.

• PODSUMOWANIE - wpływ na sprawność katalityczną enzymu oznacza zmiany aktywności enzymu (wzrost bądź obniżenie) bez zmiany ilości enzymu.

Czyli jeśli zatrzymamy biosyntezę białka w komórce, to:

1. jeśli czynnik modyfikuje aktywność enzymu w drodze w drodze wpływu na sprawność katalityczną enzymu - aktywność enzymu się zmieni

2. jeśli czynnik oddziaływuje poprzez zmianę syntezy białka enzymatycznego - do zmian nie dojdzie wskutek zablokowania syntezy białka enzymatycznego w komórce

19. Hamowanie odwracalne i nieodwracalne, kompetencyjne i niekompetencyjne, mieszane - definicje, mechanizmy, kinetyka reakcji enzymatycznej z inhibitorem w oparciu o wykres podwójnych odwrotności (L-B)

*

20. INHIBITORY ENZYMÓW JAKO LEKI m.in. acetylocholinesterazy, cyklooksygenazy, lipooksygenazy, oksydazy ksantynowej, fosfodiesterazy, anhydrazy węglanowej

• Agregację trombocytów hamuje:

1. blokada cyklooksygenazy (COX) - aspiryna

2. zahamowanie syntazy tromboksanowej - pirmagrel

3. zablokowanie receptora tromboksanowego - sulotroban

Aspiryna powoduje nieodwracalną acetylację seryny w pozycji 530 cyklooksygenazy. . natomiast zastąpienie seryny alaniną nie zmienia aktywności tego enzymu (wskazuje to, że seryna nie wchodzi w skład centrum aktywnego enzymu). Okres półtrwania kwasu acetylosalicylowego wynosi 20 minut, ale jego działanie na płytki krwi jest nieodwracalne - hamuje agregację płytek, ale nie hamuje adhezji.

Cyklogenaza z płytek krwi jest bardziej podatna na hamowanie przez aspirynę niż cyklogenaza w ścianie naczynia.

Małe dawki hamują wytwarzanie trombosanu w trombocytach. Natomiast duże dawki hamują zarówno syntezę TXA₂ jak i PGI₂ w endotelium, co sprzyja tworzeniu zakrzepów.

W przeciwieństwie do nieodwracalnego hamowania cyklooksygenazy przez aspirynę niesterydowe leki p/zapalne, takie jak: indometacyna, fenylobutazon, kwas flufenamowy, oksyfenolobutazon, ibuprofen, hamują odwracalnie cyklooksygenazę poprzez współzawodnictwo z substratem czyli kwasem arachidonowym o miejsce aktywne enzymu

• Inhibitory konwertazy angiotensyny

- w leczeniu nadciśnienia tętniczego

- captopril, enalopril - rozszerzają tętnice i zmniejszają opory naczyniowe

• Inhibitory β- laktamaz (enzymy bakteryjne)

- mają zastosowanie jako antybiotyki

- kwas klawulonowy, sulbaktam, tazobaktam

• Inhibitory MAO ( oksydazy monoaminowej)

- leki p/depresyjne

- powodują obniżanie degradacji amin katecholowych oraz indolowych (wpływ noradrenoergiczny i serotoninergiczny

- selegilina (Jumex) - hamuje MAO - ma zastosowanie w leczeniu parkinsinizmu

• Inhibitory reduktazy HMG-CoA

- mewastatyna, tymwastatyna, prowastatyna

- lowastatyna - nieaktywny, trójpierścieniowy laktoz z grzybów Monascus ruber, Aspergillus terrens

• Inhibitor anhydrazy węglanowej

- acetazolamid (Diuramid) - hamuje anhydrazę węglanową w kanaliku bliższym i dalszym nerki

- powoduje utratę HCO
------- kwasica nieoddechowa

- stosowany jest jako lek moczopędny

- powoduje również obniżanie ciśnienia wewnątrzgałkowego

• Inhibitory fosfodiesterazy III (inodylatory)

- zwiększają zawartość cAMP w komórce

- zwiększają kurczliwość mięśnia sercowego

- amrynon, milrynon, enoksymom

- sundonimy: moltyndonima - wzrost aktywności cyklazy guanylowej - wzrost cGMP

= rozszerza naczynia krwionośne żylne i tętnicze

21. ENZYMY MNEMONICZNE

*

22. ZJAWISKO KOOPERACJI ENZYMÓW MONO - i OLIGOMERYCZNYCH

*

23. ALLOSTERIA, CENTRUM ALLOSTERYCZNE - definicje pojęć

• centrum allosteryczne -jest to miejsce do którego przyłączają się efektory, czyli drobnocząsteczkowe związki wpływające na aktywność enzymu.

• Enzymy, których aktywność może być regulowana w taki sposób nazywa się enzymami allosterycznymi

24. MODELE ODDZIAŁYWAŃ ALLOSTERYCZNYCH - jednoprzejściowy i sekwencyjny - charakterystyka mechanizmów

• Oddziaływania allosteryczne - to oddziaływanie miejsc wiązania substratu znajdujących się na różnych podjednostkach oligomerycznego enzymu.

• Dla enzymów allosterycznych wykres zależności szybkości reakcji V os stężenia substratu [S] często przybiera kształt sigmoidalny (enzymów allosterycznych nie obowiązuje kinetyka Michaelisa - Menten)

• W enzymach allosterycznych jedno miejsce aktywne enzymu może oddziaływać na drugie miejsce aktywne tej samej cząsteczki enzymu
  prowadzi to do kooperatywności wiązania cząsteczek substratu

• Aktywność enzymów allosterycznych może być regulowana cząsteczkami, które się wiążą do innych miejsc niż miejsca katalityczne (w podobny sposób jak H₂ lub CO₂) wpływają na wiązanie tlenu przez hemoglobinę).

• MODEL JEDNOPRZEJŚCIOWY - J. Monod, J. Wyman (1965 rok)

1. Enzym allosteryczny zbudowany z dwu identycznych podjednostek, z których każda może występować z jednej z dwu możliwych konformacji:

R - wykazuje duże powinowactwo do substratu

T - wykazuje małe powinowactwo do substratu

Formy R i T mogą przechodzić jedna w drugą

2. Podstawowe założenie tego modelu: - obie podjednostki enzymu muszą występować w tej samej konformacji, tak by była zachowana symetria cząsteczki enzymu.

3. W ten sposób dozwolonymi konformacjami dimeru są RR i TT, natomiast RT jest zakazana

4. Przy braku substratu obie dozwolone formy opisano symbolami T₀ i R₀, a L oznacza stosunek ich stężeń w roztworze

R₀
T₀




5. W jednoprzejściowym modelu oddziaływań allosterycznych efekty:

1. homotropowe są zawsze dodatnie (kooperatywne)

2. heterotropowe mogą być albo dodatnie albo ujemne

6. Forma RT jest niedozwolona

• MODEL SEKWENCYJNY (kolejnych zdarzeń) - D. Koshland jun.

1. każda podjednostka może występować tylko w dwóch formach konformacyjnych R i T

2. związanie substratu z daną podjednostką zmienia jej kształt, jednak nie ma to wielkiego wpływu na konformację innych podjednostek w tej cząsteczce enzymu

3. W modelu sekwencyjnym wiązanie jest kooperatywne wtedy, kiedy powinowactwo RT do substratu jest większe od powinowactwa TT

• Różnice modelu sekwencyjnego w stosunku do jednoprzejściowego:

1. model sekwencyjny nie zakłada równowagi pomiędzy stanami T i R, gdy brak substratu

- przejście konformacyjne od T do R jest wymuszone wiązaniem substratu

2. zmiana konformacyjna od T do R występuje kolejno w różnych podjednostkach, a nie polega na jednym przejściu konformacyjnym całej cząstki enzymu

3. forma RT tu jest zasadnicza, a modelu jednoprzejściowym niedozwolona

4. w modelu jednoprzejściowym zasadniczym warunkiem oddziaływania podjednostek jest symetria cząsteczki enzymu, która musi dlatego być zachowana podczas przejść allosterycznych. W przeciwieństwie do tego model sekwencyjny zakłada możliwość oddziaływania podjednostek znajdujących się w różnych stanach konformacyjnych.

5. oddziaływania homotropowe mogą być dodatnie lub ujemne - druga cząsteczka substratu może ulegać silniejszemu albo słabszemu wiązaniu niż pierwsza, w zależności od rodzaju odkształceń strukturalnych, wprowadzonych przez związanie pierwszej cząsteczki substratu. W modelu jednoprzejściowym oddziaływania homotropowe są tylko dodatnie.

• Dla niektórych białek słuszny jest model jednoprzejściowy, a dla innych sekwencyjny

• Dla jeszcze innych białek enzymatycznych żaden z modeli nie jest zadawalający, a założenie, że istnieją tylko dwa stany konformacyjne R i T jest zbyt ograniczone.

25. KINETYKA ENZYMÓW ALLOSTERYCZNYCH

*

26. KLINICZNY (diagnostyczny) PODZIAŁ ENZYMÓW wg. RICHTERICHA i HESSA - przykłady enzymów poszczególnych grup, patogeneza obserwowanych zmian enzymatycznych w surowicy krwi.

• Podział uwzględnia:

1. przydatność enzymów w praktyce klinicznej, (dotyczy tylko tych enzymów)

2. miejsce ich syntezy

3. pełnioną fizjologiczną funkcję

4. zmiany aktywności w przebiegu różnych stanów patologicznych

• GRUPA A - ENZYMY SEKRECYJNE (wydzielnicze)

Pełnią one swą fizjologiczną rolę na terenie osocza.

Ich stężenie w osoczu jest wysokie i obniża się w przypadku uszkodzenia funkcji narządów, w których powstają.

1. esteraza choinowa niespecyficzna (butyrylocholinowa)

2. niektóre czynniki krzepnięcia krwi (proenzymy) - protrombina

3. czynniki fibrynolizy - plazminogen

4. lipaza lipoproteinowa HTGL

5. ceruloplazmina (białko ostrej fazy)

• GRUPA B - ENZYMY INDYKATOROWE (wskaźnikowe)

Enzymy te fizjologicznie występują wewnątrzkomórkowo.

Prawidłowo ich stężenie w osoczu jest niskie. Stężenie to wzrasta w wyniku uszkodzenia komórek.

Ze względów dydaktycznych można je podzielić na narządowo swoiste i narządowo nieswoiste.

1. Narządowo specyficzne

1. dla wątroby

• dehydrogenaza etanolowa

• dehydrogenaza sorbitolowa

• transferaza ornitynokarbamoilowa

• aldolaza fruktozomonofosforanowa

• arginaza

• dla mięśni poprzecznie prążkowanych

• kinaza kreatynowa CK

• aldolaza fruktozodifosforanowa

• Narządowo niespecyficzne

• Enzymy glikolizy

• Enzymy cyklu Krebsa

• Enzymy cyklu pentozowego

• Enzymy przemiany białkowej

- aminotransferaza alaninowa AlAT, GPT

- aminotransferaza asparaginowa AspAT, GOT

• GRUPA C - ENZYMY EKSKRECYJNE (wydalnicze)

Enzymy tej grupy fizjologicznie występują w dużej ilości w wydzielinie narządów wydalniczych.

W warunkach fizjologicznych ich stężenie w osoczu jest nieduże. Wzrost ich stężenia w osoczu jest spowodowany upośledzeniem odpływu wydzieliny.

a) enzymy żółci

• fosfataza zasadowa (AP)

• γ- glutamylotranspeptydaza (GGTP)

• leucyloaminopeptydaza ( LAP)

b) enzymy soku trzustkowego

• α - amylaza

• lipaza

• DNA-aza

• RNA-aza

• trypsyna

• chymotrypsyna

c) enzymy ślinianek

• α - amylaza

d) enzymy płynu sterczowego

• fosfataza kwaśna (AcP)

e) enzymy gruczołów wydzielniczych żołądka

• pepsyna

• AMINOTRANSFERAZY

• Enzymy indykatorowe

• Enzymy przemian białkowych

• Enzymy narządowo nieswoiste

• Katalizują przemianę aminokwasu w α - ketokwas

• Koenzymem jest fosforan pirodyksalu - wit B₆

• Aminotransferaza alaninowa ALAT = GPT - najwięcej w wątrobie

• Aminotransferaza asparaginowa AspAT = GOT - najwięcej w m. sercowym

• ALAT i AspAT oprócz tego występują w mięśniach, nerkach, trzustce, śledzionie, płucach

• Mają 2 postacie izoenzymów:

• cytoplazmatyczny (α-globulina, frakcja szybka, wytrącana riwanolem)

- najwcześniej w przypadku uszkodzenia serca

2. mitochondrialny ( γ i β₂- globuliny, frakcja wolna)

Występowanie:






m. sercowy






izoenzymy cytozolowy mitochondrialny




ALAT 20% 80%




AspAT 80% 20%




wątroba




izoenzymy cytozolowy mitochondrialny




AspAT 20% 80%




ALAT 80% 20%




AspAT jest bardziej charakterystyczny dla zawału m. sercowego - 80% w cytosolu

ALAT - bardziej charakterystyczny dla uszkodzeń wątroby (nie oznacza się tego klinicznie!!!)

• Wzrost ALAT i AspAT

- zawał m. serca

- zawał mózgu, płuca, nerki, śledziony, jelit

- wirusowe zapalenie wątroby

- toksyczne uszkodzenie wątroby, marskość, nowotwory wątroby

- choroby mięśni (urazy, zapalenia, dystrofie)

- ostre zapalenie pęcherzyka żółciowego i trzustki

- zatrucie ciążowe

- oparzenia

- długotrwałe stosowanie leków: kortykosterydów, erytromycyny, środków antykoncepcyjnych, morfiny, kodeiny, salicylatów, glikozydów nasercowych

• Wskaźnik de Ritisa: AspAT/ALAT > 1

- spadek
uszkodzenie hepatocytów

- wzrost po uprzednim spadku
zaawansowane uszkodzenie hepatocytów

- bezwzględne wartości tego wskaźnika słabo korelują ze stopniem uszkodzenia

- AspAT/ALAT > 2
alkoholowe uszkodzenie wątroby (niedobór fosforanu pirodyksalu)

- < 1
miąższowe zapalenie wątroby

- martwica i wirusowe zapalenie wątroby > 1

- prawidłowo 1,5 - 2

• FOSFATAZA ALKALICZNA

• Optimum pH 7-8

• Kofaktor - Zn

* aktywowany przez Mn, Mg, Co

* hamowany przez Be

• Udział w osteogenezie (osteoblasty)

• Transport fosforanów z jelita

• Regulacja stężenia NAD i NADP

• Struktura heterogenna (izoenzymy)

• Izoenzym wątrobowy

- termostabilny w temperaturze 56⁰ C przez 15 minut

- sekrecja w hepatocytach, nabłonku kanalików żółciowych (enzym wydalniczy)

- marker cholestazy

- barrdziej

2. Izoenzym kostny

3. Izoenzym jelitowy

4. Izoenzym łożyskowy

5. Izoenzym nerkowy

6. Izoenzymy nowotworowe (izoenzym Regana, Nagaro)

• Norma - 90 IU/l = 140 nkat/l

27. KLASYFIKACJA i NOMENKLATURA ENZYMÓW wg. MIĘDZYNARODOWEJ UNII BIOCHEMICZNEJ

• Klasy enzymów wg klasyfikacji międzynarodowej:

Klasa 1: oksydoreduktazy

- przenoszą ładunki (elektrony i jony H₃O⁺ - protony) z cząsteczki substratu na cząsteczkę akceptora:

AH₂ + B → A + BH₂;

np. dehydrogenazy, oksydazy

Klasa 2: transferazy

- przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji:

AB + C → A + BC;

np. aminotransferazy, acetylkotransferazy, kinazy

Klasa 3: hydrolazy

- powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza); do grupy tej należy wiele enzymów trawiennych:

AB + H₂O → A + B;

np. proteazy, celulazy, inwertazy

Klasa 4: liazy

- powodują rozpad substratu bez hydrolizy:

AB → A + B;

np. dekarboksylany aminokwasów

Klasa 5: izomerazy

- zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku:

AB → BA;

np. fofsogliceromutazy

Klasa 6: ligazy

- powodują syntezę różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne:

A + B → AB;

np. reakcja syntezy- synteza CoA

• Nazwa systematyczna składa się z dwóch części:

1. pierwsza typ katalizowanej reakcji + Aza

2. druga wskazuje na substraty biorące udział w katalizowanej reakcji

- w przypadku oksyreduktaz i transferaz uwzględnia się regułę donor-akceptor

- przy transferazach jako przedrostek grupa przenoszona

- ligazy - nazwy cząsteczek ulegają syntezie oraz produkt powstały z rozpadu nukleotydu wysokoenergetycznego (w nawiasie)

- nazwy substratów ulegających dysocjacji elektrolitycznej w dopełniaczu z końcówką -an; gdy dwa substraty - w mianowniku l.poj. i oddziela się dwukropkiem

Np. oligonukleotydylohydrolaza dezoksyrybo-nukleinianu ale N-metylotransferaza S-adenozyna:guanidynooctan, oksydoreduktaza UDPglukoza:NAD

- gdy reakcja obejmuje 2 różne przekształcenia np. deaminację oksydacyjną albo dekarboksylację i równocześnie dehydratację lub przenoszenie nukleotydów połączone z cyklizacją, to drugie przekształcenie jest w nawiasie.

Np. oksyreduktaza L-aminokwas:NAD(deaminująca)

karboksy-liaza ATP: 5-pirofosfomewalonian (dehydrująca)

nukleotydo-2-transferaza rybonukleinianu (cyklinizująca)

- podstawniki w substratach - kolejne liczby arabskie począwszy od atomu węgla przy grupie funkcyjnej

Np. aminotransferaza L-alanina: 2-oksoglutaran

- litery alfabetu greckiego zarezerwowane są dla określania konfiguracji oraz wyjątkowo dla β-alaniny lub δ-laktonu

• W klasyfikacji systematycznej oznacza się enzymy wg. kodu cyfrowego:

I-sza cyfra - przynależność do jednej z 6 grup:

1. oksyreduktazy

2. transferazy

3. hydrolazy

4. liazy

5. izomerazy

6. ligazy czyli syntetazy

II-ga liczba - określa podklasę w danej grupie systematycznej

III-cia - określa przynależność danego enzymu do podpodklasy

IV-ta - konkretnie dany enzym w ramach podpodklasy

28. CHARAKTERYSTYKA KLASY OKSYDOREDUKTAZ - katalizowane reakcje, koenzymy, przydatność diagnostyczna, przykłady enzymów

* oksyreduktazy - reakcje redox

oddziaływanie na wiązanie = CH-OH

= CH-O

= CH=CH-

= CH-NH₂

• reakcje oksydo-redukcji - przenoszenie elektronów i protonów (atomów wodoru) lub bezpośrednie włączenie tlenu do substratu

• potocznie: dehydrogenaza

reduktaza

transhydrogenaza

oksydaza

peroksydaza

• Dehydrogenaza - donor (dawca) atomów wodoru

Reduktaza - akceptor (biorca) wodoru



Bezpośrednimi biorcami wodoru - koenzymy nikotynamidowe NAD

Ostatecznym akceptorem wodoru (poprzez układ ox-red) - tlen

Donorami wodoru - zredukowane koenzymy nikotynamidowe (z reguły NADP)


enzym nie ulega zmianie, a koenzym jest dawcą lub biorcą.

Przenoszą wodór z jednego substratu na drugi.

• Transdehydrogenazy - jony wodorowe przenoszone z jednego układu nikotynamidowego na drugi np.


NADP NAD

• Oksydazy - akceptorem wodoru ze zredukowanego substratu jest bezpośrednio tlen





½ H₂ ½ O₂

A H₂O

Produktem jest woda lub H₂O₂

• Peroksydazy - akceptorem wodoru jest nadtlenek wodoru


H₂O₂ + AH₂ 2H₂O + A

• Oksygenazy - katalizują włączanie tlenu cząsteczkowego do jednego substratu


A + O₂ AO₂

• Hydroksylazy - w obecności tlenu cząsteczkowego równoczesne utlenianie dwóch odrębnych substratów - jeden atom tlenu włączany jest do substratu, a drugi z atomami wodoru drugiego substratu tworzy wodę




O₂ + A AO + 1/2O₂


H-B + ½ O₂ B + H₂O

1. OKSYDOREDUKTAZY

• Działające na grupę CH-OH donora

• Oksydoreduktaza alkohol : NAD

dehydrogenaza alkoholowa

- przekształca alkohol w aldehyd


Koenzym: NAD⁺ NADH + H⁺


R-CH₂OH R-C-O

1.1.1.8. Oksydoreduktaza L-glicero-3-fosforan : NAD

dehydrogenaza glicero-3-fosforanowa


Koenzym NAD⁺ NADH + H⁺


L-glicero-3-fosforan fosfodihydroksyaceton

1. Oksydoreduktaza L-mleczan : NAD

dehydrogenaza mleczanowa (LDH)


Koenzym : NAD⁺ NADH + H⁺


Kwas mlekowy kwas pirogronowy

1. Oksydoreduktaza L- jabłczan : NAD

dehydrogenaza jabłczanowa


Koenzym: NAD⁺ NADH + H⁺


Kwas L-jabłkowy kwas szczawiooctowy

2. Oksyreduktaza L- jabłczan : NAD (dekarboksylująca)

dehydrogenaza jabłczanowa (dekarboksylująca)




Koenzym: NAD⁺ NADH + H⁺




Kwas jabłkowy kwas pirogronowy + CO₂

1. Działające na grupę aldehydową lub ketonową donora

1. z NAD lub NADP jako akceptorem

1. Oksydoreduktaza aldehyd 3-fosfoglicerynowy : NAD (fosforylująca)

dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego

dehydrogenaza triozofosforanowa


NAD⁺ NADH + H⁺




Aldehyd 3-fosfoglicerynowy kwas 1,3-difosfoglicerynowy + H₃PO₄

1.2.3 z tlenem jako akceptorem

1. Oksydoreduktaza ksantyna : tlen

Oksydaza ksantynowa - białko flawinowe zawierające molibden

- utlenia też hipoksantynę


H₂O, O₂


Ksantyna kwas moczowy

1. z liponianem jako akceptorem

1. Oksydoreduktaza bursztynian : liponian (acetylująca akceptor)

Dehydrogenaza pirogronianowa


wit. B₁, wit. PP, - CO₂


kwas pirogronowy + kwas liponowy kwas 6-S-acetyloliponowy

1.3. Działające na grupę CH-CH donora

1. z tlenem jako akceptorem

1. z innymi akceptorami

1.3.99.1 Oksyreduktaza bursztynian : (akceptor)

Dehydrogenaza bursztynianowa - białko flawinowe


Akceptor zredukowany akceptor


Kwas bursztynowy kwas fumarowy

1.4 Działające na grupę CH-NH₂ donora

1.4.1 z NAD lub NADP jako akceptorem

1. Oksydoreduktaza L-glutamina : NAD(P) (deaminująca)

Dehydrogenaza glutaminowa


NAD(P) NAD(P)H


Kwas glutaminowy kwas 2-oksyglutarowy

1.4.3 z tlenem jako akceptorem

1.4.3.4 Oksyreduktaza monoamina : tlen (deaminująca)

Oksydaza monoaminowa MAO

- białko zawierające miedź Cu




+ H₂O + O₂




Amina I-rzędowa aldehyd

1.5 Działające na grupę C-NH donora

1.5.1 z NAD lub NADP jako akceptorem

1.6 Działające na zredukowany NAD lub zredukowany NADP jako donor

1.6.1 z NAD lub NADP jako akceptorem

1.6.1.1 Oksydoreduktaza zredukowany NADP : NAD

Transdehydrogenaza NAD(P)




NAD NADH




NADPH NADP

1. Działające na inne związki azotowe jako donory

2. Działające na grupy siarkowe donorów

1. z chinonem lub związkiem pokrewnym jako akceptorem

1.8.5.1. Oksydoreduktaza glutation :dehedroaskorbinian

Dehydrogenaza glutationowa




Kwas dehydro-askorbinowy kwas askorbinowy


2 glutation glutation


Forma zredukowana formy utlenionej

1. Działające na grupy hemowe jako donory

1. z tlenem jako akceptorem

1.9.3.1 Oksydoreduktaza ferrocytochrom c : tlen

Oksydaza cytochromowi


4 ferrocytochrom c + O₂ 4 ferricytochrom c + 2 H₂O

1.11 Działające na nadtlenek wodoru jako akceptor

1.11.1.6 Oksydoreduktaza nadtlenek wodoru : nadtlenek wodoru

Katalaza

- białko hemowe

1. Oksydoreduktaza donor : nadtlenek wodoru

Peroksydaza

- białko hemowe




Donor + H₂O₂ utleniony donor + 2H₂O

1.13 Działające na jeden donor z włączeniem tlenu (oksygenazy)

1.13.1.12 Oksydoreduktaza tryptofan : tlen

Oksygenaza tryptofanowa

- białko żelazowe

29. CHARAKTERYSTYKA KLASY TRANSFERAZ - katalizowane reakcje, koenzymy, przydatność diagnostyczna, przykłady enzymów

* transferazy - przeniesienie:

grupy Cl

grupy aldehydowej lub ketonowej

grup arylowych

grup glikosylowych

• przenoszenie rodnika lub grupy z jednego związku na drugi lub wymiana rodnika lub grupy z atomem wodoru albo innego związku

• W zależności od rodzaju przenoszonych grup dzielimy je na:

1. metylotransferazy = transmetylazy

2. hydroksymetylotransferazy = transhydroksymetylazy

3. formylotransferazy = transformylazy

4. karbamoilotransferazy = transkarbamoilazy

5. formininotransferazy

6. karboksylotransferazy = transkarboksylazy

7. amidynotransferazy = transaminazy

8. transketolazy

9. transaldolazy

10. acylotransferazy np. acetylotransferazy

11. aminoacylotransferazy

12. glikozylotransferazy np. glukozylotransferazy, galaktozylotransferazy

13. transferazy przenoszące grupy alkilowe np. dwumetyloallilotransferazy

14. aminotransferazy = transaminazy

15. kinazy = fosfotransferazy

16. nukleotydylotransferazy

17. sulftransferazy

• Koenzymy transferaz:

- koenzym A

- tetrahydrofolian

- fosforan pirydoksalu

- biotyna

- nukleozydotrójfosforan

- dwufosfotiamina

- pirofosforan tiaminy

2. Transferazy

2.1 przenoszące grupy jednowęglowe

2.1.1 metylotransferazy

1. hydroksymetylotransferazy, formylotransferazy oraz transferazy podobnych grup

2. karboksylotransferazy i karbomolilotransferazy

1. karbamolilotransferaza karbamolilofosforan : L-asparaginian

karbamoilotransferaza asparaginowa

karbamoilofosforan + kwas asparaginowy
kwas karbamoiloasparaginowy




3. amidynotransferazy (transamidynazy)

1. przenoszące ugrupowania aldehydowe lub ketonowe

1. glikoaldehydotransferaza sedoheptulozo-7-fosforan : aldehyd-D-3-

fosfoglicerynowy

transketolaza = transferaza glikoaldehydowa

- wymaga pirofosforanu tiaminy

Sedoheptulozo-7-P + aldehyd 3-P-glicerynowy
rybozo -5-P + ksylulozo -5-P

2. acylotransferazy

3. glikozylotransferazy

2.4.1.1 glukozylotransferaza α - 1,4-glukan : ortofosforan

Fosforylaza glikogenowa

1. 1-galaktozylotransferaza UDP galaktoza : D glukoza

Galaktozylotransferaza UDP galaktoza-glukoza

UDP-galaktoza + glukoza
laktoza + UDP

4. przenoszące grupy alkilowe lub pokrewne

5. przenoszące grupy zawierające azot

2.6.1 aminotrasferazy - transaminazy

2.6.1.1. Aminotransferaza L-asparaginian : 2-oksoglutaran

Aminotransferaza asparaginowa AspAT

- zawiera fosforan pirydoksalu

Kwas asparaginowy + kwas 2-oksyglutarowy
kwas szczawiooctowy +

kwas glutaminowy

2.7. przenoszące grupy zawierające fosfor

1. fosfotransferazy z grupą alkoholową jako akceptorem

1. 6-fosfotransferaza ATP : D-glukoza

Glukokinaza

Glukoza + ATP
glukozo-6-P + ADP

1. Fosfotransferaza ATP : białko

Kinaza białkowa

ATP + białko
ADP + białko ufosforylowane

1. Fosfotransferaza ATP : pirogronian

Kinaza pirogronianowa

- jako donory mogą także działać: UTP, GTP, CTP, ITP. I dezoksyATP

Kwas pirogronowy + ATP
ADP + kwas fosfoenolopirogronowy

2. fosfotransferazy z grupą karboksylową jako akceptorem

3. fosfotransferazy z grupą zawierającą azot jako akceptor

1. Fosfotransferaza ATP : kreatyna

Kinaza kreatynowa CPK

ATP + kreatyna
ADP + fosfokreatyna

4. fosfotransferazy z grupą fosforanową jako akceptorem

1. pirofosfotransferazy

1. Pirofosfotransferaza ATP : tiamina

Pirofosfokinaza tiaminowa

Tiamina + ATP
AMP + pirofosforan tiaminy (DPT)

2. nukleotydulotransferazy

3. transferazy innych podstawionych grup fosforowych

1. Przenoszące grupy zawierające siarkę

1. sulfotransferazy

2.8.3 CoA-transferazy

30. CHARAKTERYSTYKA KLASY HYDROLAZ - katalizowane reakcje, koenzymy, przydatność diagnostyczna, podział proteaz, naturalne inhibitory, enzymy hydrolityczne przewodu pokarmowego, przykłady enzymów

* hydroksylazy - reakcje hydrolizy

* rozbijają związki złożone na proste na drodze hydrolizy

* brak koenzymów!!!!!!!!!

3. Hydrolazy

3.1 Działające na wiązania estrowe

1. Hydrolaza estrów glicerolowych

Lipaza

triacyloglicerol + H₂O
2,3-diacyloglicerol + R-COOH

1. Fosfohydrolaza monoestrów fosforanowych

Fosfataza alkaliczna

- odłącza grupę P

2. Fosfohydrolaza monoestrów fosforanowych

Fosfataza kwaśna

- ma małą specyficzność

R-CH₂-O-P + H₂O
R-CH₂-OH + H₃PO₄

1. Fosfohydrolaza D-glukozo-6-fosforanu

Glukozo-6-fosfataza

Glukozo-6-P + H₂O
D-glukoza + H₃PO₄

1. Cholinofosfohydrolaza fosfatydylocholiny

Fosfolipaza C

Fosfatydylocholina + H₂O
2,2-diacyloglicerol + cholinofosforan

• Działające na związki glikozydowi

3.2.1.1 4-glukanohydrolaza α -1,4-glukanu

α - amylaza

• Działające na wiązania eterowe

• Działające na wiązania peptydowe

1. Hydrolazy peptydylopeptydów

1. Pepsyna

- wiązania peptydowe między resztami aminokwasów

aromatycznych lub dwukarboksylowych z innymi aminokwasami

1. Trypsyna

- peptydy, amidy, estry w miejscu wiązań grup karboksylowych

aminokwasów aromatycznych

1. Trombina

- peptydy, amidy, estry L-argininy

- przekształca fibrynogen w fibrynę

1. Renina

- przekształca angiotensynogen w angiotensynę

• Działające na wiązania C-N różne od peptydowych

1. Aminohydrolaza L-glutaminy

Glutaminaza

Glutamina + H₂O
kwas glutaminowy + NH₃

1. Aminohydrolaza mocznika

Ureaza

Mocznik + H₂O
CO₂ + 2 NH₃

1. Aminohydrolaza L-argininy

Arginaza

Arginina + H₂O
ornityna + mocznik

• Działające na wiązania bezwodników kwasowych

• Działające na wiązania C-C

• Działające na wiązania halogenków

• Działające na wiązania P-N

31. CHARAKTERYSTYKA KLASY LIAZ - katalizowane reakcje, koenzymy, przydatność diagnostyczna, przykłady enzymów

• liazy - addycja do podwójnego wiązania

• Enzymy katalizujące reakcję eliminacji podwójnego wiązania. Rozbijają one niehydrolityczne wiązania C-C, C-O, C-N, C-S, usuwając substrat lub dołączając pewne grupy.

• Reakcje mogą także przebiegać w kierunku odwrotnym (przyłączenia reagentów do podwójnego wiązania) i wtedy liazy działają jako syntazy

• Koenzymy: wit B₁₂, fosforan pirydoksalu, dwufosfotiamina, nukleozydotrójfosforan (NTP)

4. Liazy

4.1 Liazy wiązania C-C

1. Liazy wiązania C-O

1. hydro-liaza L-jabłczanu

hydrataza fumarowa

kwas jabłkowy
kwas fumarowy + H₂O

1. Hydro-liaza L-seryny (deaminująca)

Dehydrataza serynowa

- białko zawierające fosforan pirydoksalu

seryna - H₂O
kwas aminoakrylowy
kwas iminopropionowy + H₂O
kwas pirogronowy + NH₃

1. Liazy wiązania C-N

4.4 Liazy wiazania C-S

4.4.1.1 Siarkowodoro-liaza L-cysteiny (deaminująca)

Desulfhydrataza cysteinowa

Cysteina - H₂S + H₂)
kwas pirogronowy + NH₃

32. CHARAKTERYSTYKA KLASY IZOMERAZ - katalizowane reakcje, koenzymy, przydatność diagnostyczna, przykłady enzymów

* izomerazy - przegrupowanie wewnątrzcząsteczkowe

5. Izomerazy

5.1 Racemazy i epimerazy

1. 4-epimeraza UDPglukozy

Epimeraza UDP glukozowa

UDPglukoza
UDPgalaktoza

• Izomerazy cis-trans

• Oksydoreduktazy wewnątrzcząsteczkowe ( redukcja jednej grupy, a utlenienie innej)

5.3.1.1 Ketolo-izomeraza D-gliceroaldehydo-3-fosforanu

Izomeraza triozofosforanowa

Aldehyd 3-fosfo-glicerynowy
fosfodihydroksyaceton

1. Ketoizomeraza D-glukozo-6-fosforanu

Izomeraza glukozofosforanowa

Glukozo-6-P
fruktozo-6-P

• Transferazy wewnątrzcząsteczkowe

5.4.2.1 2,3-fosfomutaza D-fosfoglicerynianu

Fosfomutaza fosfoglicerynowa

kwas 3-P-glicerynowy
kwas 2-P-glicerynowy

33. CHARAKTERYSTYKA KLASY LIGAZ - katalizowane reakcje, koenzymy, przydatność diagnostyczna, przykłady enzymów

• katalizują syntezę wiązań związaną z rozbiciem wiązania pirofosforanowego w ATP lub innych nukleotydach wysokoenergetycznych ( aby uzyskać energię)

6. Ligazy (Syntetazy)

6.1 Wytwarzające wiązanie C-O

6.1.1.9 - 12 Ligazy L-aminokwas : tRNA (AMP)

Syntetazy aminoacylo-tRNA

aminokwas + tRNA + ATP
aminoacylo-tRNA + AMP + PP

1. Wytwarzające wiązanie C-S

6.2.1.2 Ligaza kwas : CoA (AMP)

Syntetaza acylo-CoA

R-COOH + HS-CoA + ATP
acylo-CoA + AMP + PP

2. Wytwarzające wiązanie C-N

6.3.1.2 Ligaza L-glutaminian : amoniak (ADP)

Syntetaza glutaminowa

kwas glutaminowy + NH₃ + ATP
glutamina + ADP + P

3. Wytwarzające wiązanie C-C

6.4.1.1 Ligaza pirogronian : dwutlenek węgla (ADP)

Karboksylaza pirogronianowa

kwas pirogronowy + CO₂ + H₂O + ATP
kwas szczawiooctowy + ADP + P

6.4.1.2 Ligaza acetylo-CoA : dwutlenek węgla (ADP)

Karboksylaza acetylo-CoA

acetylo-CoA + CO₂ + H₂O + ATP
malonylo-CoA + ADP + P

34. Wyjaśnić różnice w pojęciach - syntaza a syntetaza, hydrolaza a hydroksylaza

• Syntaza ATP - (EC 3.6.3.14) - enzym fosforylacji oksydacyjnej, katalizujący reakcję powstawania związku wysokoenergetycznego ATP.

35. METODY INSTRUMENTALNE OZNACZANIA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW - wady, zalety, zastosowanie

*

36. SPOSOBY OCENY ILOŚCI ENZYMÓW - metody dwupunktowe i kinetyczne

• Badając aktywność enzymów oznaczamy ilość zużytego substratu lub wytworzonego produktu, w ściśle określonych standardowych warunkach, w czasie inkubacji.

• Czas zero - to zmieszanie substratu z enzymem

• METODY DWUPUNKTOWE (czyli metody punktu końcowego)

Po zmieszaniu substratu z enzymem po określonym czasie (zależnym od metody) przerywa się reakcję i oznacza się stężenie substratu lub produktu.

W metodach dwupunktowych tak ustala się warunki reakcji, aby zapewnić stałą szybkość reakcji podczas całego czasu trwania inkubacji.

W czasie trwania reakcji zachodzą zmiany - zmniejsza się stężenie substratu a zwiększa stężenie produktu.

Tylko tzw. szybkość początkowa reakcji (szybkość liniowa) jest proporcjonalna do ilości enzymu.

Ilość przereagowanego substratu zależy od ilości enzymu.

Ale należy bezwzględnie przestrzegać warunków danej metody!!!

• METODY KINETYCZNE

Oparte są na stałym pomiarze (co 15,30 lub 60 sekund) ubytku substratu lub przyroście produktu.

Najczęściej wykorzystywane są właściwości optyczne dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych (NAD i NADP).

W postaci utlenionej związki te mają pasmo absorpcji przy długości fali 260 nm (obecność adeniny), a w postaci zredukowanej powstaje dodatkowe maksimum absorpcji przy długości fali 340 nm.

Przy długości fali 340 nm można mierzyć przyrost formy zredukowanej (absorbancja rośnie) lub powstawanie formy utlenionej (absorbancja maleje)

Innym przykładem jest oznaczanie aktywności γ - glutamylotranspeptydazy (GGTP), gdzie substratem jest γ - glutamylo-4-nitroanilid. Z substratu powstaje 4-nitroanilina o żółtym zabarwieniu, którą możemy mierzyć.

Ilość uwolnionej 4-nitroaniliny jest ~ do ilości enzymu.

37. SPOSOBY WYRAŻANIA AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

*

38. JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ - definicje i ich przeliczanie: katal, jednostka międzynarodowa

• Miarą aktywności enzymu jest szybkość reakcji enzymatycznej, wyrażona jako ubytek substratu lub przyrost produktu w jednostce czasu.

• U lub IU - międzynarodowa jednostka standardowa enzymu (unit) - jest to ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mikromola substratu (lub 1 μmola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30⁰ C, w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu

* Mianem jednostki standardowej enzymu jest μmol/min.

* Gdy substratem jest związek (białko, wielocukier), w którym więcej niż jedno wiązanie podlega reakcji - określenie „1 mol substratu” zastępuje się wyrażeniem „1 mol odpowiednich grup chemicznych”. Wówczas za miarę szybkości reakcji przyjmuje się liczbę rozłożonych wiązań, a nie liczbę całkowicie rozłożonych cząsteczek

• Katal - jednostka aktywności enzymatycznej - jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratów w czasie 1 sekundy w optymalnych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym pełne wysycenie enzymu Mianem katala jest mol/s

μkat = 10^-6 kat

nkat (nanokat) = 10^-9 kat

pkat (pikokat) = 10^-12 kat

1 kat = 1mol/s = 60 mol/min = 60
IU

1 IU =


• W metodzie Bodańsky'ego oznaczania aktywności fosfataz jednostką aktywności fosfataz jest tzw. J. Bodańsky'ego - jest to ilość uwolnionego fosforu z β - glicerofosforanu sodu, przez fosfatazę znajdującą się w 100 ml surowicy w ciągu 1 godziny inkubacji w temp. 37⁰ C w pH 8,6 dla fosfatazy zasadowej i pH 5,0 dla fosfatazy kwaśnej.

J Bodańsky'ego =


• W metodzie Kinga-Amstronga oznaczania aktywności fosfataz jednostką aktywności fosfataz jest tzw. J. K-A - jest to ilość mg fenolu uwolnionego z fenylofosforanu dwusodowego przez fosfatazę znajdującą się w 100 ml surowicy w temperaturze 37⁰ C w ciągu 15 min inkubacji w pH 8,6 dla fosfatazy zasadowej oraz w ciągu 60 min inkubacji w pH 4,9 dla fosfatazy kwaśniej

Fosfataza zasadowa : J.K-A =


Fosfataza kwaśna: J.K-A =


• Definicja jednostki umownej np. dla oznaczania aktywności amylazy metodą Caraway'a

Jednostka aktywności amylaza w metodzie Caraway'a - to taka aktywność enzymu, która hydrolizuje 10 mg skrobi w ciągu 30 min do stopnia, w którym zanika reakcja z jodem.

Aktywność wyraża się w jednostkach w odniesieniu do 100 ml materiału badanego.

Aktywność amylazy w danym materiale wynosi 1j/100 ml, jeżeli enzym zawarty w 100 ml zhydrolizuje 10 mg skrobi w ciągu 30 min.

Przyjęto zasadę (w celu ujednolicenia warunków reakcji), że absorbancja próby badanej nie może być mniejsza niż 50% absorbancji próby kontrolnej ( mierzymy ubytek substratu).

39. STĘŻENIE AKTYWNOŚCI, AKTYWNOŚĆ WŁAŚCIWA, AKTYWNOŚĆ MOLEKULARNA (molarna) - definicje pojęć

• Stężenie aktywności enzymatycznej - jest to oznaczona aktywność enzymu w płynach biologicznych przeliczona na 1000 cm³ roztworu

• Aktywność właściwa - jest to liczba jednostek standartowych przypadająca na 1 miligram białka (IU/mg) lub jest to liczba mikrokatali przypadajaca na 1 kg białka (μkat/kg) Określa stopień czystości preparatów enzymatycznych.

• Aktywność molekularna - jest to liczba cząsteczek substratu przekształconych w produkty, w czasie 1 minuty przez 1 cząsteczkę enzymu, w optymalnych warunkach. Określa reaktywność enzymu

• Aktywność molarna (odpowiednik aktywności molekularnej) - katal na mol enzymu (kat/mol)

• Aktywność centrum katalitycznego k_cat - używana jest w przypadku enzymów zawierających kilka centrów katalitycznych - odpowiada ona aktywności molekularnej podzielonej przez liczbę centrów aktywnych w enzymie.

40. METODY IZOLOWANIA i OCZYSZCZANIA ENZYMÓW z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

*

41. ZASTOSOWANIE ENZYMÓW w BIOTECHNOLOGII

*

42. ENZYMY JAKO LEKI

*

43. UKŁAD KRZEPNIĘCIA KRWI i FIBRYNOLIZY

*

44. UKŁAD DOPEŁNIACZA

*




34

---