Biotechnologiczne metody

wytwarzania substancji biologicznie

czynnych stosowanych w

kosmetykach

Plan wykładu

1.

Wstęp

2.

Produkcja wybranych substancji w kulturach
bakteryjnych i roślinnych

3.

Podstawy inżynierii bioprocesowej

4.

Pozyskiwanie mikroorganizmów

Czym jest biotechnologia...?

Połączenie wiedzy i umiejętności z zakresu:

biologii

chemii

fizyki

matematyki

informatyki,

umożliwiające wykorzystanie organizmów lub ich
metabolitów do procesów diagnostyczno-produkcyjnych

Biotechnologia przemysłowa

to nowoczesne zastosowanie biotechnologii do
zrównoważonego przetwarzania i produkcji substancji
chemicznych

wykorzystuje mikroorganizmy i enzymy do
wytwarzania surowców farmaceutycznych,
spożywczych, tworzyw sztucznych

Co ma wspólnego biotechnologia
z kosmetologią...?

Niektóre składniki kosmetyków pozyskiwane są z
udziałem komórek organizmów

roślinnych

zwierzęcych

mikroorganizmów (bakterie, wirusy, grzyby)

Najczęściej stosowanymi „producentami” są
komórki bakteryjne oraz roślinne kultury
komórkowe i tkankowe

Co wytwarzają bakterie...

Witaminy

Aminokwasy

Białka

Alkohole

Polisacha-

rydy

Witaminy

...a co rośliny...?

Barwniki

Alkaloidy

Terpenoidy

Związki

fenolowe

Przeciw-

utleniacze

Strategie biosyntezy substancji

z wykorzystaniem roślin

Biosynteza

Biosynteza

de novo

(kultury komórkowe

i tkankowe)

Biotransformacje

Biosynteza w

warunkach

naturalnych

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

są składnikami naturalnych olejków roślinnych

wykazują działanie antyseptyczne, rozgrzewające

zastosowanie: w aromaterapii, składniki kompozycji
zapachowych, perfum

przykłady:

mentol (zapach mięty)

citronelol (różany)

eugenol (goździkowy)

geraniol (bodziszkowy)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

Monoterpeny

Acykliczne

gerniol

nerol

citral

Monocykliczne

mentol

menton

pulegon

Dicykliczne

borneol

Aromatyczne

eugenol

izoeugenol

Najczęściej stosowana strategia:

biotransformacja

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

p-cymen, tymol,

p-cymen

Kultura zawiesinowa

T. vulgaris

(tymianek)

Gamma-terpin

geraniol, citronelal

neral, tlenki terpenowe

(intensywny zapach)

Kultura zawiesinowa

R. centifolia

(róża stulistna)

Citronelol, geraniol,

nerol

(olejek różany)

Produkty

Roślina

metabolizująca

Substraty

Biotransformacja gamma-cymenu w kulturze

in vitro

Thymus vulgaris

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(MONOTERPENY)

Zastosowanie:

uszczelniające naczynia krwionośne (rutyna)

antyoksydacyjne (hydrochuinon, kwas kawowy)

rozjaśniające skórę (arbutyna)

aromatyzujące (wanilina)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

Związki fenolowe

jednopierścieniowe

proste fenole,

pochodne

fenylopropanu

dwupierścieniowe

flawonoidy

wielopierścieniowe

garbniki

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

wanilina

Kultura immobilizowana

C. frutescens

Kwas felurowy

arbutyna

Kultura zawiesinowa

Datura innoxia

Bieluń indiański

Hydrochinon

Produkty

Roślina

metabolizująca

Substraty

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

Stosowana strategia:

biotransformacja

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(ZWIĄZKI FENOLOWE)

Biotransformacja kwasu felurowego i waniliny

Zastosowanie:

jako substancje barwiące preparaty kosmetyczne (szikonina-
barwienie szminek do ust),

antyoksydanty (likopen, karoteny),

regenerujące naskórek (karotenoidy - prekursory wit. A)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

Barwniki

roślinne

Antocyjany

Glukozydy:

cyjanidyny
malwidyny

pelargonidyny

Flawony

apigenina

moreina

daidzeina

Karotenoidy

karoten

ksantofile

likopen

Chinony

alizaryna

szikonina

- kultura zawiesinowa
- bioregulatory zwiększają syntezę 60

razy

Licopersicon

esculentum

(pomidor)

Likopen

- kultura zawiesinowa
- bioreaktor typu air-lift
- logarytmiczna faza wzrostu
- system półciągły-wzrost syntezy 7,5

razy

Daucus carota

(marchew jadalna)

Karotenoidy

Warunki/uwagi

(biosynteza

de novo

)

Roślina

Produkt

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)

- kultura zawiesinowa
- wymagają światła

Perilla frutescens

(pachnotka zwycz.)

Vitis vinifera

(winorośl)

Antocyjany

- I barwnik wytwarzany przemysłowo

in vitro (Japonia 1983 r.)

- system dwuokresowy
- zastąpienie kultury zawiesinowej

korzeniami transformowanymi:
wydzielanie barwnika do pożywki

Lithospermum

erythrorhizon

(nawrot)

Szikonina

Warunki/uwagi

(biosynteza

de novo

)

Roślina

Produkt

Substancje pozyskiwane z udziałem

komórek roślinnych

(BARWNIKI)



biosynteza z udziałem mikroorganizmów jest alternatywą dla
glicerolu pozyskiwanego na drodze syntezy chemicznej,



mikroorganizmy: S. cerevisiae (warunki beztlenowe, wydajność:
30 – 40 g/L),



stosując kontrolowane natlenianie w obecności CO

2

wydajność

dochodzi do 230 g/L,



wady: powstawanie innych metabolitów (etanol, kwas octowy,
aldehyd octowy)

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(GLICEROL)



zastosowanie: jako środek konsystencjotwórczy (np. hydrożele)



mikroorganizm:

Xanthomonas campestris



synteza 2-etapowa:

I biosynteza ksantanu (warunki tlenowe, glukoza lub sacharoza, składniki
mineralne, AA, NH4

+

, 25-34

o

C, mieszanie)

II wydzielanie biopolimeru (zawartość ksantanu: 10-30 g/L, wymaga
sterylizacji cieczy poreakcyjnej, oddzielenie komórek, wytrącenie
biopolimeru alkoholami)

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(Guma ksantanowa)

Podstawowy substrat: karotenoidy

Biosynteza karotenoidów z udziałem:

Rhodotorula gracialis

(20-50 mg/kg s.m.)

Chlorophycea sp.

(420-480 mg/kg s.m.)

Euglenophyceae sp.

(800 mg/kg s.m.)

Blakslea trispora

(3000 mg/L)

pożywka:

skrobia, mąka sojowa, wyciąg kukurydziany, olej

bawełniany, witaminy, sole mineralne
biomasa jest suszona i ekstrahowana

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(WITAMINA A)

Biosynteza z udziałem:

Bacillus sphericus

IFO

Pożywka: glicerol (2%), pepton (1%), sole mineralne

Wydajność: 200 mg/L

Substancje pozyskiwane z udziałem

mikroorganizmów

(BIOTYNA)

Ciecz

pofermentacyjna

Odwirowanie

Adsorpcja

na węglu

aktywnym

Desorpcja

z węgla

EtOH/NH

3 (aq)

Odparowanie

rozpuszczalnika

Oczyszczanie

chromatograficzne

Podstawy inżynierii

bioprocesowej

Biotechnologiczna linia produkcyjna

1

Przygotowanie mediów technicznych (media hodowalne,
powietrze woda, para wodna)

2

Etap hodowli mikroorganizmów w bioreaktorach

3

Procesy separacji (rozdział komórek od pożywki,
produktów od medium hodowlanego itp.)

4

Procesy oczyszczania produktu (wirowanie, chromato-
grafia, elektroforeza)

5

Koncentracja pozyskanego produktu, pakowanie

Przygotowanie mediów

technicznych

Procesy jednostkowe

w przygotowaniu mediów technicznych

Sterylizacja

pożywki

Sterylizacja

aparatury

Sterylizacja

powietrza

Metody sterylizacji

Sterylizacja

UV

Beta-propiolakton

Formaldehyd

Tlenek etylenu

Sucha (termiczna)

Mikrofiltracja

Radiacyjna

Parowa

Kinetyka zabijania

drobnoustrojów

Sterylizacja jest procesem I-rzędu

N

t

= N

0

exp (-Dt)

N

t

t

t

lnN

t

Sterylizacja pożywek

Zmiany zachodzące podczas
termicznej obróbki pożywki:

• karmelizacja cukrów
• denaturacja białek
• inaktywacja witamin
• reakcje Maillarda
• hydroliza polimerów
• zmiany pH

Sterylizacja pożywek

Czynniki wpływające na
efektywność sterylizacji:

• termooporność

mikroorganizmów

• początkowe „stężenie”

drobnoustrojów

• atenuacja (temp., UV)
• temp. w najzimniejszym

punkcie pożywki

• czynniki środowiskowe

TEMPERATURA a CZAS:

(sterylizacja parowa)
100

o

C

200 min.

120

o

C

19 min.

121

o

C

15 min.

135

o

C

1 min.

pH a CZAS:

(spory

B. subtilis

, 100

o

C)

4,4

2 min.

5,6

7 min.

6,8

11 min.

8,4

9 min.

Sterylizacja powietrza

1.

Filtracja mechaniczna (membrany szklane,
celulozowe, nitrocelulozowe)

2.

Wyjaławianie cieplne

3.

Promieniowanie UV

4.

Ultradźwięki

Sterylizacja powietrza

Filtr włóknisty

głęboki

Filtr z membraną

plisowaną

Filtr porowaty

membranowy

Sterylizacja aparatury

STERYLIZACJA

W bioreaktorze:

•

bezpośredni wtrysk

pary wodnej do cieczy

•

wężownica

•

płaszcz grzejny między

ścianami bioreaktora

Poza bioreaktorem:

•

płytowe (UHT)

•

typu „rura w rurze”

Bioreaktory

•

urządzenia do prowadzenia procesów biosyntezy

•

wykonane najczęściej ze szkła lub stali nierdzewnej

•

najczęściej kształtu cylindrycznego

•

pojemność: od kilku do kilku milionów litrów

•

zapewniają właściwe warunki przebiegu procesu, regulację i
kontrolę wybranych parametrów

Bioreaktory

Wyposażenie techniczne:

•

kadź

•

system mieszania pożywki

•

system napowietrzania

•

system grzania/chłodzenia

•

urządzenia do gaszenia piany

•

urządzenia kontrolno-pomiarowe:

•

Ciśnienie: manometr

•

Obj. pożywki: kryzy pomiarowe

•

pH: elektroda szklana

•

Potencjał redox: elektrody
platynowe

•

Przepływ powietrza: rotametr

•

Stężenie tlenu: polarograf

•

Temperatura: termopara

•

Gęstość komórek: nefelometr,
turbidymetr

•

Ciśnienie osmotyczne: osmometr

•

Stężenie cukrów: elektrody
enzymatyczne

Bioreaktory

(typy mieszania)

Frings, Effigas,

Vogel-Bush

mieszadło-aerator

reaktor zanurzeniowo-

strumieniowy

pompa zewnętrzna

HYDRAULICZNE

bioreaktor fluidalny,

air-lift, reaktor ICI

bełkotka

PNEUMATYCZNE

typowe konstrukcje

mieszadło turbinowe,

łopatkowe, śmigłowe,

kotwicowe

MECHANICZNE

Konstrukcje

Element

mieszający

Sposób

mieszania

Bioreaktory z mieszaniem

mechanicznym

•

konstrukcje praktyczne i
sprawdzone

•

wykorzystywane w przemyśle
mikrobiologicznym

•

modyfikacje: bioreaktor
Vogel-Busha ( z mieszadłem-
aeratorem)

•

stosowane typy mieszadeł:

kotwicowe, śmigłowe,
turbinowe, łopatkowe,
kotwicowo-ramowe, śrubowe,
śrubowo-wstęgowe

Bioreaktory z mieszaniem

pneumatycznym

•

prosta konstrukcja

•

możliwe duże rozmiary

•

brak występowania dużych
sił ścinających

•

stosowane na skalę
laboratoryjną, pilotażową,
przemysłową

•

zastosowanie: produkcja
biomasy, metabolitów
wtórnych (np. produkcja
ajmalicyny przez

Catharantus roseus

)

Bioreaktory z mieszaniem

dyfuzyjnym

•

przeznaczony do hodowli kultur
protoplastów lub sferoplastów
roślinnych, komórek zwierzęcych

•

bezpęcherzykowy system
napowietrzający

•

specjalna geotkanina umożliwia
bezpośrednią dyfuzję tlenu do
medium hodowlanego

•

geotkanina jest odporna na adhezję
komórek

Sposoby prowadzenia hodowli

w bioreaktorach

Sposoby prowadzenia kultur

Okresowa

Okresowo-dolewowa

Ciągła

Kultura okresowa

•

jednorazowa inokulacja,
wprowadzenie pożywki

•

proces biegnie do
wyczerpania substratów

•

4 fazy wzrostu mikrobów:
lag, log, plateau, zamierania

•

stosowane w skali
laboratoryjnej i
przemysłowej

•

nie wymagają dodatkowego
oprzyrządowania

•

wada: zmienność warunków
hodowli (ciśn. osmotyczne)

Kultura okresowo-dolewowa

•

w trakcie procesu następuje
stopniowe uzupełnianie składników
odżywczych

•

początkowo bioreaktor jest
wypełniony w 50 %

•

możliwość prowadzenia hodowli
półciągłej

•

przez zdecydowaną większość
czasu kultura wzrasta w jednej z
preferowanych faz wzrostu np.
logarytmicznej przy prod. biomasy,
stacjonarnej-podczas produkcji
metabolitów wtórnych

•

jest stosowana głównie do
produkcji metabolitów wtórnych

Kultura ciągła

•

rozwój komórek
połączony z ciągłą
wymianą pożywki

•

komórki są w stanie
nieograniczonego
wzrostu

•

zużyta pożywka jest
odbierana

•

umożliwia uzyskanie
kultury o dużej
gęstości

Powiększanie skali procesu

hodowli

•

problemy przenoszenia z małej na dużą skalę,

•

powiększanie skali znacznie zmienia parametry hodowli,

•

im większy reaktor, tym większe: ciśnienie, procesy
energetyczne, mieszanie,

•

badania i pomiary dokonuje się w taki sposób, aby
ekstrapolacja i porównania doprowadziły do wnioskowania
matematycznego

Teoria podobieństwa

TEORIA PODOBIEŃSTWA:

•

układy uznaje się za podobne, jeżeli kryteria charakteryzujące te
układy są równe

•

aby powiększyć skalę procesu hodowli, niezbędne jest zachowanie
podobieństw między poszczególnymi etapami wzrastającej skali

•

najważniejsze podobieństwa:

- podobieństwo geometryczne bioreaktorów
- podobieństwo warunków mieszania cieczy
- podobieństwo warunków wymiany masy
- podobieństwo biologiczne

Wzrost

trudności

realizacji

Liczby kryterialne

Są to bezwymiarowe wielkości, które określają charakterystyczny

dla danego procesu związek między wielkościami fizycznymi. Jako
minimum przyjmuje się określenie podobieństwa dla tych liczb
kryterialnych, które określają dominujące siły i zjawiska zachodzące
podczas procesu prowadzonego w reaktorze.

Za pomocą liczb kryterialnych można opisać układ hydromechaniczny
bioreaktora...

Immobilizacja komórek

Komórki

Wiązanie komórek

niemodyfikowanych

Techniki immobilizacji

kom. modyfikowanych

Wiązanie

Uwięzienie

Sedymentacja

Flokulacja

Wiązanie do

nośnika

kowalencyjne

chelatowanie

adsorpcja

kapsułki

włókna

żele

Wiązanie

poprzeczne

Separacja komórek od podłoża

hodowlanego

Między płynem hodowlanym a komórkami istnieje niewielka
różnica gęstości

sedymentacja zachodzi powoli

Faza

Różnica gęstości między fazą stałą

stała

a płynem hodowlanym [kg/m

3

]

Cytoplazma kom.

0-120

Bakterie

70

Drożdże

90

Komórki zwierzęce

70

Komórki roślinne

50

Strzępki grzybni

10

Separacja komórek od podłoża

hodowlanego

Flokulacja

Wirowanie

Filtracja

Oddzielenie

komórek

od roztworu

Jak przyspieszyć proces

sedymentacji?

SEDYMENTACJA

V=d

2

(

ρρρρ

s

-

ρρρρ

c

)g/18

ηηηη

Flokulacja

Pole grawitacyjne

Al

3+

Fe

3+

Polikationy

chitozan

Wirówki

V=d

2

(

ρρρρ

s

-

ρρρρ

c

)2

Π

Π

Π

Π

2

rn

2

/9

ηηηη

Jak przyspieszyć proces

sedymentacji?

V=

d

2

(

ρρρρ

s

-

ρρρρ

c

)

g

/

18

ηηηη

Wirówki

W wirówkach

g

zastąpione jest przez

a

(przyspieszenie

odśrodkowe)

a = 4

Π

Π

Π

Π

2

r n

2

Wzór Stockes’a przyjmuje postać:

V=d

2

(

ρρρρ

s

-

ρρρρ

c

) 2

Π

Π

Π

Π

2

r n

2

/9

ηηηη

Typ wirówki

wartość g

Kliniczne i laboratoryjne

500-1500

Koszowe i filtracyjne

300-1500

Dekantacyjne

1500-4500

Talerzowe

4000-13000

Rurowe

10000-17000

Ultrawirówki

>100000

Wirówka filtracyjna

•

bęben wymoszczony tkaniną
o różnym stopniu porowatości,

•

3000-5000 obr./min

•

wydajność: 50-300 L/min.

•

efektywność maleje bo r maleje

•

działanie okresowe

•

zawiesiny: 2-5%

Wirówka dekantacyjna

ślimakowa

•

zawiesina jest podawana wałem
centralnym na ślimak

•

ślimak obraca się przeciwnie do
bębna

•

komora bębna zwęża się a
ślimak przesuwa osad

•

praca ciągła

•

wydajność: 20000 L/h

•

osad: 4 t/h

•

długość bębna do 10m

•

zawiesiny: 2-50%

Wirówka talerzowa (dyskowa)

•

samooczyszczająca

•

napierający osad otwiera „klapkę”

•

podstawowa wirówka w
przemyśle biotechnologicznym

•

12000 obr./min

•

średnica rotora 0,1-1m

•

wydajność: 100000 L/h

•

system ciągły

•

zawiesiny 15%

Wirówka wielokomorowa

•

zawiesina przepływa
szeregowo przez komory

•

następuje frakcjonowanie
cząsteczek pod względem
rozmiaru

•

kłopotliwe usuwanie osadu

•

4500-8500 obr./min.

•

wydajność: do 10000 L/h

•

działanie okresowe

•

dla zawiesin 4-5%

Wirówka rurowa

•

długość jest 4-8 krotnością
średnicy

•

mała wydajność: 100 L/h

•

do 50000 obr./min

•

średnica do 1 m

•

dla zawiesin do 1%

Filtracja

Siłą motoryczną filtracji jest różnica ciśnień po obu
stronach przegrody

Różnicę ciśnień może być wywołana przez:

•

pompę tłoczącą zawiesinę na filtr

(filtracja ciśnieniowa)

•

pompę próżniową zasysającą supernantant

(filtracja

próżniowa)

•

słup cieczy nad filtrem

(filtracja grawitacyjna)

•

siłę odśrodkową wytworzoną w wirówce

Filtracja

Typy filtracji

(w zależności od

rodzaju przegrody)

F. WGŁĘBNA

Filtracja zachodzi wewnątrz

przegrody

Przegrody:

warstwy ziarniste

masy porowate

F. POWIERZCHNIOWA

Separowane cząstki tworzą

warstwę „placek” na

powierzchni przegrody

Przegrody:

cząstki zawieszone

F. MEMBRANOWA

W wyniku przepływu wzdłuż

przegrody filtracyjnej nie

tworzy się warstwa osadu

Przegrody:

membrany z polipropylenu,
estrów celulozy, poliamidu,

ceramiczne

Filtracja

Typy filtracji

(mechanizm działania

przegrody)

SZLAMOWA

Warstwa osadu tworzy

właściwą przegrodę

filtracyjną

(kadź filtracyjna w browarze,

filtracja w drożdżowniach)

Wskazania: mała lepkość,

gęsta zawiesina

Z BLOKOWANIEM

PRZEGRODY

Wielkość filtrowanych cząstek

jest większa od otworów w

przegrodzie, następuje

blokada kapilar przegrody

(klarowanie soków owocowych)

Wskazania: duża lepkość,

rzadka zawiesina

MIESZANA

Jest kombinacją obu typów

filtracji

Filtracja styczna

(mikrofiltracja)

•

membrana charakteryzuje się dużym oporem przepływu,

•

mała przepuszczalność rekompensowana przez rozwiniętą
powierzchnię,

•

brak „placka” filtracyjnego podczas filtracji

•

konieczność stosowania nadciśnienia po stronie nadawa-permeat

•

średnica porów przegrody: 0,05-10

µ

m

•

zastosowanie: wstępne oczyszczanie cieczy w przemyśle
botechnologicznym, farmaceutycznym, spożywczym

•

retencja bakterii i grzybów

Nadawa

Retentat

Permeat

Oddzielanie i oczyszczanie

produktów

Produkty:

•

witaminy

•

antybiotyki

•

białka i polipeptydy

•

metabolity mikroorganizmów

•

polisacharydy bakteryjne

•

alkohole

Odznaczają się różnymi właściwościami fozykochemicznymi oraz mogą być
wydzielane wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowo wymaga to odrębnego,
specyficznego postępowania podczas oczyszczania produktu

Oddzielanie i oczyszczanie

produktów

Gdzie jest produkt?

Roztwór pohodowlany

Komórki bakteryjne

Procesy:

- ekstrakcji

- nano/ultrafiltracja

- precypitacja

- ultrawirowanie

Dezintegracja komórek

Odwirowanie ścian

komórkowych

Dezintegracja komórek

Dezintegracja komórek

Homogenizator ciśnieniowy

Pozyskiwanie drobnoustrojów

I.

Środowisko naturalne

– jako niewyczerpany rezerwuar szczepów

przydatnych do bioprodukcji metabolitów. Izolacja interesującego
nas szczepu wymaga przeprowadzenia odpowiednich procedur

screeningowych

II.

Kolekcje placówek naukowych, firm biotechnologicznych, kolekcje
centralne np.:

1)

A

ctinomycetes

C

ulture

C

ollection

, ACC, UK

2)

A

merican

T

ype

C

ulture

C

ollection

(ATCC) Rockwill, USA

3)

W

orld

D

ata

C

enter of

M

icroorganism

(WDCM), 566 kolekcji,

obejmuje:

- kolekcje międzynarodowe
- kolekcje narodowe
- kolekcje uniwersyteckie
- kolekcje przemysłowe

4)

Collection Nationale des Cultures de Microorganismes

, Instytut

Pasteura

5)

Instytut Biotechnologii i Przemysłu Spożywczego w Warszawie