Podstawy techniki real

Podstawy techniki real--

time PCR

time PCR

dr n. wet. T. Dzieciątkowski

dr n. wet. T. Dzieciątkowski

PCR

PCR

reakcja łańcuchowa polimerazy

reakcja łańcuchowa polimerazy

((

Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction

))

••

metoda powielania fragmentów DNA

metoda powielania fragmentów DNA

••

wynaleziona w 1983 roku przez Kary’ego

wynaleziona w 1983 roku przez Kary’ego
Mullisa,

Mullisa,
1993

1993 -- Nagroda Nobla

Nagroda Nobla

••

skład mieszaniny:

skład mieszaniny:

••

skład mieszaniny:

skład mieszaniny:

••

matrycowy DNA

matrycowy DNA

••

dNTP

dNTP

••

startery

startery

••

termostabilna polimeraza DNA

termostabilna polimeraza DNA

••

Taq (

Taq (

Thermus aquaticus

Thermus aquaticus

))

••

Tth (

Tth (

Thermus thermophilus

Thermus thermophilus

))

••

Pfu (

Pfu (

Pyrococcus furiosis)

Pyrococcus furiosis)

••

Przebieg reakcji:

Przebieg reakcji:

••

denaturacja

denaturacja

–

– rozplecenie dsDNA

rozplecenie dsDNA

••

annealing

annealing

–

– hybrydyzacja starterów

hybrydyzacja starterów

••

elongacja

elongacja

–

– synteza DNA

synteza DNA

elongacja

ds DNA

denaturacja

96º

50º

annealing

72º

Taq

60º

Przebieg reakcji PCR

Przebieg reakcji PCR

elongacja

ds DNA

denaturacja

96º

50º

annealing

72º

Taq

60º

Niedogodności wynikające ze stosowania analizy

Niedogodności wynikające ze stosowania analizy

elektroforetycznej w żelu agarozowym

elektroforetycznej w żelu agarozowym

Mała precyzja

Mała precyzja
Mała czułoś

Mała czułość

ć

Mały zakres dynamiki pomiaru

Mały zakres dynamiki pomiaru
Niska rozdzielczoś

Niska rozdzielczość

ć

Rozróżnianie na podstawie wielkości

Rozróżnianie na podstawie wielkości
fragmentów

fragmentów
Brak wartości liczbowych wyników

Brak wartości liczbowych wyników
Brak wyników ilościowych

Brak wyników ilościowych

R

Real

eal--ttime PCR

ime PCR

Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA

Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA

z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym

z analizą ilości produktu w czasie rzeczywistym

W technice r

W technice real

eal--ttime

ime PCR

PCR ilość produktów amplifikacji jest

ilość produktów amplifikacji jest

oznaczana po każdym cyklu PCR,

oznaczana po każdym cyklu PCR, a nie tylko po ostatnim cyklu.

a nie tylko po ostatnim cyklu.

Wskaźnikiem ilości produktów amplifikacji jest intensywność

Wskaźnikiem ilości produktów amplifikacji jest intensywność

flu

fluorescenc

orescencji emitowanej przez badaną próbkę.

ji emitowanej przez badaną próbkę.

ds DNA

denaturacja

annealing

elongacja

96º

50º

72º

Taq

60º

Przebieg reakcji real

Przebieg reakcji real--time PCR

time PCR

(SYBR Green)

(SYBR Green)

ds DNA

denaturacja

annealing

elongacja

96º

50º

72º

Taq

60º

1,5E+09

2,0E+09

2,5E+09

liczba kopii

∞

0,0E+00

5,0E+08

1,0E+09

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

nr cyklu

Zalety techniki r

Zalety techniki real

eal--time PCR

time PCR

Pełne monitorowanie przebiegu reakcji

Pełne monitorowanie przebiegu reakcji

Krótki czas

Krótki czas przebiegu reakcji

przebiegu reakcji (30 min

(30 min do

do 2

2 godzin

godzin))

Szybkie zmiany temperatury w całej objętości

Szybkie zmiany temperatury w całej objętości

Mała objętoś

Mała objętość

ć reakcji

reakcji

Bardzo duża czułoś

Bardzo duża czułość

ć

Bardzo duża czułoś

Bardzo duża czułość

ć

Analiza temperatury topnienia produktów zapewnia

Analiza temperatury topnienia produktów zapewnia
potwierdzenie specyficzności reakcji

potwierdzenie specyficzności reakcji

Bardzo wysoka powtarzalność wyników

Bardzo wysoka powtarzalność wyników

Szeroki zakres oznaczanych stężeń (od 10

Szeroki zakres oznaczanych stężeń (od 10

0

0

do 10

do 10

10

10

))

Możliwość stosowania gotowych zestawów odczynników,

Możliwość stosowania gotowych zestawów odczynników,
szeregu barwników lub sond molekularnych

szeregu barwników lub sond molekularnych

quantitative real

quantitative real--time polymerase chain reaction

time polymerase chain reaction

Q

Q--PCR , qPCR ,

PCR , qPCR , RTQ

RTQ--PCR

PCR

real

real--time PCR

time PCR

terminologia

terminologia

rreal

eal--time reverse

time reverse--transcription PCR

transcription PCR

qRT

qRT--PCR

PCR ,

, RT

RT--qPCR ,

qPCR , RRT

RRT--PCR

PCR , RT

, RT--rt PCR

rt PCR

!!!

!!!

RT

RT--PCR

PCR –

–

reverse

reverse--transcription

transcription

PCR

PCR

Rodzaje sond i metod detekcji kwasów

Rodzaje sond i metod detekcji kwasów

nukleinowych

nukleinowych

stosowanych w urządzeniach real

stosowanych w urządzeniach real--time

time

stosowanych w urządzeniach real

stosowanych w urządzeniach real--time

time

PCR

PCR

••

najprostsza sonda w technice real

najprostsza sonda w technice real--time

time

PCR

PCR

••

bardzo silne i specyficzne wiązanie do

bardzo silne i specyficzne wiązanie do
dsDNA

dsDNA

••

silny sygnał, wprost proporcjonalny do

silny sygnał, wprost proporcjonalny do
ilości DNA w próbie

ilości DNA w próbie

SYBR Green I

SYBR Green I

••

możliwość wiązania z niespecyficznymi

możliwość wiązania z niespecyficznymi
produktami reakcji

produktami reakcji

Fluorescence Resonance Energy Transfer

Fluorescence Resonance Energy Transfer

(FRET)

(FRET)

Hydrolysis Probes

Hydrolysis Probes

(TaqMan)

(TaqMan)

Molecular Beacons

Molecular Beacons

Przegląd głównych grup zastosowań techniki real

Przegląd głównych grup zastosowań techniki real--time PCR

time PCR

Absolute Quantification

Absolute Quantification

••

detekcja specyficznego DNA/RNA (np. w

detekcja specyficznego DNA/RNA (np. w

badaniach onkologicznych)

badaniach onkologicznych)

••

detekcja patogenów (np.

detekcja patogenów (np.

Legionella

Legionella

,

,

Bacillus

Bacillus

anthracis

anthracis

))

anthracis

anthracis

))

••

identyfikacja gatunków, szczepów (np.

identyfikacja gatunków, szczepów (np.

bakterii, wirusów)

bakterii, wirusów)

••

badanie lekooporności (np. MRSA, VRE)

badanie lekooporności (np. MRSA, VRE)

••

monitoring jakości wody

monitoring jakości wody

••

…

…

threshold

Cp

Cp

Cp

Cp –

–

Crossing Point

Crossing Point

(Ct

(Ct –

–

Cycle Threshold

Cycle Threshold

)

) –

– cykl, w którym

cykl, w którym

fluorescencja próby przekracza poziom fluorescencji tła (

fluorescencja próby przekracza poziom fluorescencji tła (

threshold

threshold

))

T

T

n

n

= T

= T

0

0

×

× 2

2

n

n

T

T

n

n

= T

= T

0

0

×

× E

E

n

n

standardy

Krzywa standardowa (Absolute Quantification)

Krzywa standardowa (Absolute Quantification)

Relative Quantification

Relative Quantification

••

oznaczanie poziomu ekspresji genów

oznaczanie poziomu ekspresji genów

••

monitorowanie choroby resztkowej (MRD)

monitorowanie choroby resztkowej (MRD)

(u pacjentów z ostrą białaczką

(u pacjentów z ostrą białaczką

(u pacjentów z ostrą białaczką

(u pacjentów z ostrą białaczką
limfoblastyczną)

limfoblastyczną)

••

oznaczanie dawki genu (

oznaczanie dawki genu (

gene dosage

gene dosage

) (np.

) (np.

w aberracjach chromosomowych)

w aberracjach chromosomowych)

••

oznaczanie zawartości GMO w produktach

oznaczanie zawartości GMO w produktach

spożywczych

spożywczych

••

…

…

Cel: określenie wpływy substancji X na ekspresję genu badanego

Cel: określenie wpływy substancji X na ekspresję genu badanego

K

X

X

X

X

K

X

X

X

X

K

X

X

X

X

K

X

K K K

X X X

Amp lific at io n Cu rve s

Amplific a tion Cu r ves

krzywa standardowa

krzywa standardowa

gen referencyjny

gen referencyjny

krzywa standardowa

krzywa standardowa

gen badany

gen badany

Amp lific at io n Cu rve s

Cycles

44

42

40

38

36

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

F

lu

o

re

s

c

e

n

c

e

(

5

3

0

)

9,6

8,7

7,8

6,9

6

5,1

4,2

3,3

2,4

1,5

0,6

Amplific a tion Cu r ves

Cycle s

44

42

40

38

36

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

F

lu

o

re

s

c

e

n

c

e

(

5

3

0

)

9,6

8,7

7,8

6,9

6

5,1

4,2

3,3

2,4

1,5

0,6

Amp lific at io n Cu rve s

Cycles

40

38

36

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

F

lu

o

re

s

c

e

n

c

e

(

5

3

0

)

8,9

8,1
7,3

6,5

5,7
4,9

4,1

3,3
2,5

1,7

0,9

0,1

Amplific a tion Cu r ves

Cycle s

40

38

36

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

F

lu

o

re

s

c

e

n

c

e

(

5

3

0

)

7,2

6,5

5,8

5,1

4,4

3,7

3

2,3

1,6

0,9

0,2

0

2

4

6

8

10

12

14

K

X

K

X

Krzywa standardowa (

Krzywa standardowa (

Relative Quantification

Relative Quantification

))

Analiza temperatury

Analiza temperatury

topnienia produktu PCR

topnienia produktu PCR

Sonda hydrolizująca

Sonda hydrolizująca –

– TaqMan

TaqMan

AAGCACG

G

ATTCCA

AAGCACG

A

ATTCCA

Genotypowanie

Genotypowanie

SNP

SNP --

Single Nucleotide Polymorphism

Single Nucleotide Polymorphism

NAJLICZNIEJSZY TYP ZMIENNOŚCI

NAJLICZNIEJSZY TYP ZMIENNOŚCI
GENETYCZNEJ

GENETYCZNEJ
SNP stanowią ok. 90% całej zmienności

SNP stanowią ok. 90% całej zmienności
występującej w ludzkim genomie i występują co

występującej w ludzkim genomie i występują co
100

100--300 nukleotydów

300 nukleotydów

Stabilne, dziedziczne

Stabilne, dziedziczne
Pojawia się w populacji z częstością co najmniej

Pojawia się w populacji z częstością co najmniej
1%

1%

Analiza krzywej topnienia

Analiza krzywej topnienia

SYBR Green I

SYBR Green I

High Resolution Melting Dye

High Resolution Melting Dye

ii Gene Scanning

Gene Scanning

Znakowane sondy

Znakowane sondy
do genotypowania

do genotypowania

Real

Real--time PCR z użyciem fluorochromów

time PCR z użyciem fluorochromów

niespecyficznych (SYBR Green I):

niespecyficznych (SYBR Green I):

brak zastosowania w komercyjnych testach

brak zastosowania w komercyjnych testach
mikrobiologicznych

mikrobiologicznych

wyniki nieswoiste przy małej ilości matrycowego DNA

wyniki nieswoiste przy małej ilości matrycowego DNA

Zastosowanie w mikrobiologii

Zastosowanie w mikrobiologii

wyniki nieswoiste przy małej ilości matrycowego DNA

wyniki nieswoiste przy małej ilości matrycowego DNA

Real

Real--time PCR z użyciem specyficznych sond

time PCR z użyciem specyficznych sond

fluorescencyjnych (TaqMan, Scorpions, HybProbes):

fluorescencyjnych (TaqMan, Scorpions, HybProbes):

stosowane przy konstrukcji testów komercyjnych

stosowane przy konstrukcji testów komercyjnych –

– system

system

znakowania zależy od producenta i dedykowanego sprzętu

znakowania zależy od producenta i dedykowanego sprzętu

Real

Real--time PCR z użyciem fluorochromów

time PCR z użyciem fluorochromów

niespecyficznych:

niespecyficznych:

emitują one światło o określonej długości fali po związaniu się z

emitują one światło o określonej długości fali po związaniu się z

dwuniciowym DNA

dwuniciowym DNA

stosowane są: SYBR Green I, bromek etydyny, jodek propidyny

stosowane są: SYBR Green I, bromek etydyny, jodek propidyny

Oznaczenie ilościowe

Oznaczenie ilościowe real

real--time PCR

time PCR

stosowane są: SYBR Green I, bromek etydyny, jodek propidyny

stosowane są: SYBR Green I, bromek etydyny, jodek propidyny
jest to najprostsza i najtańsza metoda, jednak podatna na błędy

jest to najprostsza i najtańsza metoda, jednak podatna na błędy
wynikają one zazwyczaj z wiązania się fluorochromu ze strukturą

wynikają one zazwyczaj z wiązania się fluorochromu ze strukturą

primer

primer--

dimer

dimer

lub z innymi niespecyficznymi produktami reakcji

lub z innymi niespecyficznymi produktami reakcji

celem zwiększenia specyficzności należy przeprowadzić analizę krzywej

celem zwiększenia specyficzności należy przeprowadzić analizę krzywej

topnienia w celu określenia temperatury topnienia (Tm). W momencie

topnienia w celu określenia temperatury topnienia (Tm). W momencie
osiągnięcia temperatury topnienia produktu następuje bardzo gwałtowna

osiągnięcia temperatury topnienia produktu następuje bardzo gwałtowna
denaturacja i ostry spadek fluorescencji

denaturacja i ostry spadek fluorescencji

Real

Real--time PCR z użyciem specyficznych sond

time PCR z użyciem specyficznych sond

fluorescencyjnych:

fluorescencyjnych:

Najczęściej używane metody detekcji sekwencji kwasów nukleinowych

Najczęściej używane metody detekcji sekwencji kwasów nukleinowych

wykorzystują zjawisko transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). W

wykorzystują zjawisko transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). W
mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie.

mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie.

Oznaczenie ilościowe

Oznaczenie ilościowe real

real--time PCR

time PCR

mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie.

mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie.

Podczas reakcji dochodzi do przeniesienia energii zaabsorbowanej przez

Podczas reakcji dochodzi do przeniesienia energii zaabsorbowanej przez

jeden fluorochrom (

jeden fluorochrom (

reporter

reporter

) na drugi, który emituje światło o innej długości

) na drugi, który emituje światło o innej długości

lub dochodzi do wygaszenia emisji fluorochromu przez związek wygaszający

lub dochodzi do wygaszenia emisji fluorochromu przez związek wygaszający
((

quencher

quencher

).

).