Cezary Cybulski

REAKCJA ŁAŃCUCHOWA

POLIMERAZY CZASU

RZECZYWISTEGO

Real-time PCR



Analiza reakcji PCR w trakcie jej
przebiegu i/lub po jej ukończeniu za
pomocą:



sond molekularnych wyznakowanych
barwnikami fluorescencyjnymi



barwników fluorescencyjnych łączących
się z DNA

Real-time PCR - aparatura



termocykler:



blok grzejno-chłodzący



karuzela z próbkami grzana/chłodzona

powietrzem



wzbudzanie fluorescencji



Lampa halogenowa/xenonowa



Laser argonowy



detekcja



Matryca CCD



Fotopowielacz (PMT)

Real-time PCR - aparatura

Real-time PCR – skąd zmiany

fluorescencji?



wygaszanie fluorescencji gdy cząsteczki są
w bliskim sąsiedztwie (FRET), a narastanie
gdy odległość między nimi wzrasta



Narastanie fluorescencji podczas łączenia
się się niektórych barwników z
dwuniciowym DNA, a wygaszanie podczas
rozdziału DNA na pojedyncze nici

Real-time PCR - barwniki



barwniki fluorescencyjne:



FAM (fluoresceina)



JOE



VIC



HEX



ROX



CY3



CY5



inne



wygaszacze (quenchers):

◦

TAMRA

◦

DABCYL

◦

BHQ 1, 2, 3

◦

NFQ

◦

QSY7

◦

Guanina



barwniki dsDNA:

◦

SYBR Green

◦

LC Green I i Plus

◦

SYTO9

◦

EvaGreen

Real-time PCR – do czego?



Analizy ilościowej - ekspresji genów



Analizy jakościowej – wykrywanie
zaburzeń sekwencji DNA

Wykrywanie zmian DNA – typy sond



Hydrolizujące (hydrolysis probes)



TaqMan Probes – SNP Genotyping Assay



Hybrydyzujące (hybridization probes)



Guanine-quenching probe (SimpleProbes)



BHQProbes



Unlabled-Probes (dsDNA dye)



HybProbes



Molecular Beacons



Molecular Scorpions



LUX primers (Guanine-quenching probe)

TaqMan SNP Wykrywanie zmian DNA



Dwie sondy :



6FAM

5’-NNNNNN

A

NNNNNN-3’ MGB + NFQ



VIC

5’ –NNNNNN

G

NNNNNN-3’ MGB + NFQ



Dwa specyficzne primery



Aktywność exonukleazy 5’->3’
polimerazy

TaqMan SNP Wykrywanie zmian DNA

A mp lifi c a t io n C u r ve s

Cycles

40

39

38

37

36

35

34

33

32

31

30

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

19.155

17.655

16.155

14.655

13.155

11.655

10.155

8.655

7.155

5.655

4.155

2.655

1.155

TaqMan SNP Wykrywanie zmian DNA

TaqMan SNP Genotyping

6FAM

Homozygoty
AA

VIC

Homozygot
y GG

6FAM

VIC

Heterozygoty

A

G

Guanine Quenching probes



Sondy, których barwniki
fluorescencyjne są wygaszane przez
Guaninę

(powtórzenia GG lub GGG lub GGGG)



SimpleProbes (Roche) - Proste sondy

Guanine Quenching - zasada



Badamy polimorfizm

A

/G



Sonda

FAM

- 5’

C

nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho



Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz



Polimeraza bez aktywności exonukleazy 5’-
3’



Asymetryczny PCR

Guanine Quenching - zasada

hybrydyzacja

FAM

- 5’Cnnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx

5’

Guanine Quenching – melting analysis

hybrydyzacja

SONDA-TARGET

niska

fluorescencja

denaturacja

SONDA-TARGET

flurescencja

rośnie

Pełna

denaturacja

SONDA-TARGET

Fluorescencja

na wyższym

poziomie

Tm 63

0

C

Guanine Quenching - zasada

Sonda komplementarna-produkt PCR

Tm=63

0

C

FAM

- 5’Cnnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

A

nnnnnnxxxxxxxxxxxxx 5’

Mismatch sonda-produkt PCR

Tm=56

0

C

FAM

- 5’Cnnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho

3’xxxxxxxxxxxx

GGG

nnnnnn

G

nnnnnnxxxxxxxxxxx

5’

M e lt in g C u r ve s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

40

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

37.677
36.177
34.677
33.177
31.677
30.177
28.677
27.177
25.677
24.177
22.677

Guanine Quenching - zasada

Homo AA

Homo GG

Het AG

M e l t i n g P e a k s

Temperature (°C)

75

70

65

60

55

50

45

-(

d

/d

T

)

F

lu

o

re

sc

en

ce

(

48

3-

53

3)

0.489

0.189

-0.111

-0.411

-0.711

-1.011

-1.311

-1.611

-1.911

-2.211

-2.511

Kontrola zerowa

LUNA Probes –

sondy nieznakowane



Badamy polimorfizm

A

/G



Sonda 5’nnnnnn

T

nnnnnn3’ –Pho



SYTO9, LC GREEN, Eva GREEN



Dwa primery – produkt ~ 50 -100 pz



Polimeraza bez aktywności exonukleazy
5’-3’



Asymetryczny PCR

Co wybrać?



Jeżeli nie lubimy się zastanawiać nad

metodyką, zależy nam na czasie i

mamy fundusze : TaqMan (1,1

zł/próbkę)



Jeżeli lubimy główkować , mamy

trochę więcej czasu i mniej

funduszy:



SimpleProbes – 40 gr/próbke



LUNAProbes - < 40gr/próbkę