REAL TIME – PCR

Każdy biolog molekularny musi znać tę technologię (przynajmniej w teorii). Tradycyjny PCR zrewolucjonizował badanie jakościowe DNA, a PCR w czasie rzeczywistym stał się podstawą ilościowania kwasów nukleinowych. Rozpoczynamy publikację cyklu artykułów poświęconych Real Time PCR.

Słowo wstępne

Metoda ma wiele nazw i akronimów: ilościowy PCR, PCR w czasie rzeczywistym, Real-Time PCR, Real-Time Quantitative PCR,  qPCR, RQ-PCR, RTQ-PCR i inne (nie powinno się go jednak nazywać RT-PCR, gdyż skrót ten zarezerwowany jest dla reakcji odwrotnej transkrypcji!). Wszystkie te nazwy to synonimy, określające zmodyfikowaną łańcuchową reakcję polimerazy, która pozwala na monitoring przyrostu ilości produktu w czasie jej trwania. Osiągnięto to poprzez dodatek związków fluorescencyjnych do mieszaniny reakcyjnej. Emisja fluorescencji związana jest z kinetyką przyrostu liczby cząsteczek DNA (o rodzajach znaczników fluorescencyjnych piszemy w drugiej części niniejszego cyklu).

Trochę historii

Początki metody były skromne: Russell Higuchi i jego współpracownicy w roku 1992 opublikowali pracę, w której opisali system swojego pomysłu służący do detekcji przyrostu ilości DNA w czasie amplifikacji. Wykorzystali bromek etydyny i  odczytywali luminescencję po wzbudzeniu przez światło UV.  Bromek etydyny interkalował pomiędzy nici DNA, więc na etapie elongacji lub bezpośrednio po niej można było odczytać względny poziom ilości zamplifikowanego DNA. Reakcja nie cechowała się duża wydajnością i precyzją, gdyż bromek istotnie zakłócał działanie polimerazy,  stanowiąc dla niej zawadę steryczną, zaś światło UV niszczyło stopniowo strukturę enzymu. Pomysł jednak doczekał się szybko ulepszeń i został skomercjalizowany. Pojawiły się rekombinowane polimerazy o większej stabilności termicznej (HotStart), barwniki nie zmieniające kinetyki reakcji, a niedługo później także sondy molekularne, które umożliwiały precyzję pomiaru niespotykaną nigdy wcześniej. W drodze za odczynnikami ewoluowały także systemy amplifikacji i detekcji sygnału- początkowo korzystały z tylko jednego kanału emisji i detekcji, wkrótce jednak  już z kilku, pozwalając prawie dowolnie łączyć barwniki w reakcjach typu multiplex.

Jak to działa?

Do przygotowania najprostszej reakcji qPCR potrzebujemy tych samych składników, co do konwencjonalnego PCR-u, a zatem pary starterów, buforu, MgCl2, dNTP, wody i polimerazy. Dodatkowym składnikiem mieszaniny będzie bądź znakowana fluorescencyjnie sonda specyficzna dla amplifikowanej sekwencji, bądź niespecyficzny barwnik interkalujący pomiędzy zasady w DNA. Gotową reakcję wstawiamy do odpowiedniego termocyklera i przyglądamy się, co będzie się działo na ekranie podczas zachodzenia reakcji.

W teorii z każdym cyklem przybywa nam zamplifikowanego DNA w sposób wykładniczy, a więc 2^n (gdzie n to liczba cykli). W przyrodzie jednak taki idealny układ nie istnieje- kinetyka naszej reakcji enzymatycznej przebiega zgodnie z założeniami Michaelisa-Menten,a więc istnieje pewne plateau, związane z wyczerpywaniem składników reakcji, zaś na początku jej trwania amplikony są w zbyt małym stężeniu, by być namnażane z maksymalną wydajnością. Tak więc tylko pewien etap reakcji zachodzi liniowo i tylko na podstawie tego etapu będzięmy mogli obliczyć ilość matrycy. Liczba cykli, która  umożliwia osiągnięcie maksymalnej wydajności reakcji nazywana jest Ct (threshold cycle), cyklem granicznym, który zależy od początkowej liczby cząsteczek matrycy i od kinetyki danej reakcji. Tą wartością i innymi parametrami kinetycznymi reakcji zajmiemy się w IV części cyklu.

Po zakończeniu reakcji możemy w niektórych przypadkach (barwniki niespecyficzne i sondy niehydrolizujace) wykonać analizę krzywej topnienia, która informuje nas o specyficzności reakcji czy też o obecności różnych alleli danego amplikonu w mieszaninie reakcyjnej, co zostało wykorzystane w metodzie HRM do poszukiwania mutacji  i polimorfizmów.

 

Zastosowania metody

Obecnie ilościowy PCR znalazł zastosowanie w niemal każdej gałęzi branży biotechnologicznej. Pozwala m.in. na detekcję GMO i ocenę jego ilości w żywności. W diagnostyce laboratoryjnej używa się go do stwierdzania obecności patogenów u chorego i do monitoringu poziomu wiremii/bakteriemii. W onkologii i hematologii qPCR daje możliwość oceny odpowiedzi na leczenie celowane. W przemyśle metodami ilościowymi monitoruje się właściwości szczepów, a w badaniach podstawowych używa się ich chyba w każdym możliwym eksperymencie z udziałem DNA i RNA: monitoruje się hodowle komórkowe, poszukuje mutacji (moduł HRM), zmian w profilu metylacji, potwierdza wyniki mikromacierzowe i wiele innych. O części z zastosowań w diagnostyce laboratoryjnej będzie mowa w części V naszego cyklu.