PODSTAWY BIOTECHNOLOGII

NADPRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO W KULTURACH Aspergillus niger

(2 h)

1.

Przygotowanie podłoża

a)

Podłoże melasowe (hodowla powierzchniowa)

Przygotować 200 cm

3

20% roztworu melasy z dodatkiem 0,5 cm

3

roztworu K

4

Fe(CN)

6 ,

0,1 cm

3

kwasu fosforowego oraz 1% węgla aktywowanego. Pożywkę melasową podzielić

na dwie porcje po 100cm

3

. Jedną z nich zakwasić do pH 3,0 za pomocą kwasu siarkowego i

przelać do kolby Erlenmayera. Niezakwaszoną część (100 cm

3

) podłoża (o pH ok. 7,0)

również przenieść do kolby Erlenmayera .
Otrzymujemy w ten sposób 2 próby fermentacyjne zawierające po 100 cm

3

20%

brzeczki melasowej. Kolby zakorkować i wyjałowić.

b)

Podłoże syntetyczne A (hodowla powierzchniowa)

Przygotować 200 cm

3

pożywki syntetycznej o składzie:

• Sacharoza (20%)
• NH

4

NO

3

(0,3%)

• KH

2

PO

4

(0,15%)

• MgSO

4

(0,1%)

w wodzie destylowanej. Rozlać po 100 cm

3

do dwóch kolb stożkowych, jedną kolbę z

podłożem zakwasić do pH 2,5.
Kolby zakorkować i wyjałowić.

c) Podłoże syntetyczne B (hodowla wgłębna)

Przygotować 200 cm

3

pożywki syntetycznej B o składzie:

•

20% roztwór syropu maltozowego z dodatkiem:

•

(NH

4

)

2

SO

4

(0,2%)

•

MgSO

4

(0,02%)

•

KH

2

PO

4

(0,02%)

Rozlać po 100 cm

3

do dwóch kolb stożkowych, jedną kolbę z podłożem zakwasić do pH 2,5.

Kolby zakorkować i wyjałowić.

Wymienione podłoża po ostudzeniu zaszczepić konidiami kwasotwórczego szczepu
Aspergillus niger w ilości 1 cm

3

gęstej zawiesiny na 100 cm

3

podłoża. Hodowle z punktów a

i b inkubować w cieplarce, z punktu c w wytrząsarce w temp. 30

0

C przez 7 dni.

2.

Po okresie inkubacji ocenić wygląd makro- i mikroskopowy grzybni w

poszczególnych próbach.

3.

Oznaczenie kwasowości ogólnej.

Kwasowość ogólna jest to suma wszystkich kwasów organicznych, jakie

tworzą się podczas fermentacji cytrynowej, wśród których najwięcej powstaje

kwasu cytrynowego (ponad 90%), reszta to głównie kwas szczawiowy i

glukonowy.

• W celu oznaczenia kwasowości ogólnej należy pobrać 2 cm

3

płynu pofermentacyjnego i

przenieść do kolby stożkowej na 200 cm

3

.

• Dodać 20 cm

3

wody destylowanej i miareczkować 0,1 N NaOH wobec fenoloftaleiny do

pierwszej trwałej zmiany zabarwienia.

• Wynik podać w cm

3

0,1 N NaOH /100 cm

3

pożywki. Aktywna kultura powinna

wykazywać kwasowość ogólną odpowiadającą 30 – 40 cm

3

0,1 N NaOH na 100 cm

3

roztworu

Obserwacje, wyniki i wnioski należy przedstawić w formie sprawozdania

Literatura:

1.

Gołębiowska J., Kaszubiak H., Pędziwilk Z., Kaczmarek W.: Ćwiczenia z

mikrobiologii, Poznań 2001.

2.

Ilczuk Z.: Ćwiczenia z mikrobiologii przemysłowej, UMCS, Lublin, 1997.

3.

Sobczak E.: Teoria i ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i technicznej, skrypt SGGW,

Warszawa, 1993.

4.

Szostak – Kotowa J.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej i przemysłowej, Wyd.

Akademii Ekonomicznej w Krakowie, Kraków 2002.