2011-09-26
1
Podstawy techniki PCR
Podstawy techniki PCR
dr hab.
Ewa Balcerczak
Le
ż
y w lodówce polimeraza
Le
ż
y w lodówce polimeraza
Stara lecz mocna, enzym z
ż
elaza
Stara lecz mocna, enzym z
ż
elaza
Le
ż
y i sapie, dyszy i dmucha,
Le
ż
y i sapie, dyszy i dmucha,
ś
ar z aktywnego jej centrum bucha.
ś
ar z aktywnego jej centrum bucha.
Le
ż
y zamkni
ę
ta w swej ciemnej celi:
Le
ż
y zamkni
ę
ta w swej ciemnej celi:
„Czy wszyscy o mnie ju
ż
zapomnieli?
„Czy wszyscy o mnie ju
ż
zapomnieli?
Od magistranta a
ż
do docenta
Od magistranta a
ż
do docenta
nikt mnie ju
ż
chyba tu nie pami
ę
ta !!"
nikt mnie ju
ż
chyba tu nie pami
ę
ta !!"
I marzy biedna polimeraza
I marzy biedna polimeraza
ś
e kto
ś
j
ą
bierze, w probówk
ę
wkłada,
ś
e kto
ś
j
ą
bierze, w probówk
ę
wkłada,
A w tej probówce oba startery,
A w tej probówce oba startery,
Jaka
ś
matrycka, zasady cztery
Jaka
ś
matrycka, zasady cztery
I bufor
ś
wie
ż
y, wonny jak wino....
I bufor
ś
wie
ż
y, wonny jak wino....
Ech, by si
ę
enzym wtedy uwin
ą
ł !!
Ech, by si
ę
enzym wtedy uwin
ą
ł !!
Tak by pop
ę
dził wzdłu
ż
nici obu,
Tak by pop
ę
dził wzdłu
ż
nici obu,
Tak z obu ko
ń
ców zadał im bobu,
Tak z obu ko
ń
ców zadał im bobu,
ś
e nim by spostrzegł si
ę
zwierz czy człek
ś
e nim by spostrzegł si
ę
zwierz czy człek
Amplifikacji nadszedłby kres.
Amplifikacji nadszedłby kres.
Metoda
Metoda PCR
PCR (ang
(ang..
PPolymerase
olymerase C
Chain
hain
R
Reaction
eaction
)) jest
jest bardzo
bardzo czułą
czułą ii wydajną
wydajną
techniką
techniką
pozwalającą
pozwalającą
na
na
szybkie,
szybkie,
ekspotencjalne
ekspotencjalne
powielanie
powielanie
wybranej
wybranej
sekwencji
sekwencji kwasu
kwasu nukleinowego
nukleinowego..
Reakcja
Reakcja PCR
PCR jest
jest uważana
uważana obecnie
obecnie za
za
najważniejsze
najważniejsze
narzędzie
narzędzie
biologii
biologii
molekularnej
molekularnej..
PCR umożliwia w czasie kilku godzin uzyskanie 10
6
-10
9
kopii wyjściowego DNA.
Amplifikuje tylko wybrany, krótki fragment DNA
(od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad)
Cykl pierwszy
Cykl drugi
Cykl trzeci
Cykl czwarty
Historia PCR
Historia PCR
1985
1985
Pierwsza publikacja o technologii PCR (Science)
Pierwsza publikacja o technologii PCR (Science)
1986
1986
Oczyszczona polimeraza Taq pierwszy raz użyta w PCR zamiast fragmentów Klenowa
Oczyszczona polimeraza Taq pierwszy raz użyta w PCR zamiast fragmentów Klenowa
Pierwsze zastosowanie w sądzie USA do identyfikacji DNA (HLA
Pierwsze zastosowanie w sądzie USA do identyfikacji DNA (HLA--DQA)
DQA)
1987
1987
Przyznanie podstawowego patentu firmie Cetus
Przyznanie podstawowego patentu firmie Cetus
1988
1988
Wprowadzenie zautomatyzowanej maszyny (termocyklera) przez Perkin Elmer
Wprowadzenie zautomatyzowanej maszyny (termocyklera) przez Perkin Elmer
Publikacja w Science dotycząca pierwszego PCR z Taq
Publikacja w Science dotycząca pierwszego PCR z Taq
1989
1989
Polimeraza Taq ogłoszona przez Science cząsteczką roku
Polimeraza Taq ogłoszona przez Science cząsteczką roku
Wprowadzenie AmpliTaq® DNA Polymerase (pierwsza rekombinacyjna polimeraza
Wprowadzenie AmpliTaq® DNA Polymerase (pierwsza rekombinacyjna polimeraza
Taq)
Taq)
Porozumienie Hoffmann
Porozumienie Hoffmann--La Roche Inc. & Cetus dotyczące rozwoju diagnostyki
La Roche Inc. & Cetus dotyczące rozwoju diagnostyki
opartej na PCR
opartej na PCR
1990
1990
Pierwszy kit PCR dla HLA DQA, polimorficzny locus używany do identyfikacji ludzi,
Pierwszy kit PCR dla HLA DQA, polimorficzny locus używany do identyfikacji ludzi,
dla potrzeb sądu.
dla potrzeb sądu.
Pierwsza amplifikacja I detekcja DNA przy zastosowaniu sondy fluorescencyjnej
Pierwsza amplifikacja I detekcja DNA przy zastosowaniu sondy fluorescencyjnej
dająca podstawę do rozwoju w przyszłości technologii "real
dająca podstawę do rozwoju w przyszłości technologii "real--time PCR” (TaqMan®)
time PCR” (TaqMan®)
Odczynniki w reakcji PCR
Odczynniki w reakcji PCR
-- matrycowe DNA
matrycowe DNA (powielana sekwencja)
(powielana sekwencja)
-- startery (primery)
startery (primery) komplementarne do
komplementarne do
końców sekwencji do powielenia
końców sekwencji do powielenia
-- polimeraza
polimeraza
-- dNTP
dNTP
-- bufor
bufor
-- odpowiednie oprzyrządowanie
odpowiednie oprzyrządowanie
2011-09-26
2
Warunki reakcji RT
Warunki reakcji RT--PCR
PCR
ilość cząsteczek matrycy: 10
ilość cząsteczek matrycy: 10
11
-- 10
10
6
6
temperatura hybrydyzacji: o 5
temperatura hybrydyzacji: o 5
0
0
C poniżej Tm (55
C poniżej Tm (55
0
0
C
C -- 70
70
0
0
C)
C)
stężenie starterów: 0.1
stężenie starterów: 0.1 -- 0.5 mM
0.5 mM
stężenie MgCl
stężenie MgCl
2
2
: 1
: 1-- 3 mM, ze wzrostem stężenia wzrasta
3 mM, ze wzrostem stężenia wzrasta
wydajność reakcji ale również wzrasta niespecyficzna
wydajność reakcji ale również wzrasta niespecyficzna
amplifikacja i zmniejsza się dokładność syntezy
amplifikacja i zmniejsza się dokładność syntezy
stężenie dNTP: 200 mM
stężenie dNTP: 200 mM
Reakcja PCR składa się z 25
Reakcja PCR składa się z 25--40 cykli
40 cykli
Każdy cykl obejmuje
Każdy cykl obejmuje trzy etapy
trzy etapy
Denaturacja
Denaturacja
Swoista hybrydyzacja = annealing
Swoista hybrydyzacja = annealing
Elongacja
Elongacja
Cykl PCR:
Etapy reakcji PCR
Etapy reakcji PCR
Mieszanina
reakcyjna
Denaturacja Annealing
Elongacja
5’ 3’
5’ 3’
...
...
GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
3’
3’
5’
5’
DENATURACJA temp. około 95 C
DENATURACJA temp. około 95 C
5’
5’
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
5’
5’
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
CACTAC AGCTAT
T G C A
2011-09-26
3
Primery
Primery
Stosunek
Stosunek zasad
zasad C+G
C+G do
do A+T
A+T powinien
powinien być
być jak
jak
najbliższy
najbliższy 50
50%
% ii podobny
podobny dla
dla primerów
primerów F
F ii R
R
zapewniający
zapewniający odpowiednią
odpowiednią temperaturę
temperaturę hybrydyzacji
hybrydyzacji..
Zaprojektowane
Zaprojektowane
primery
primery
nie
nie
powinny
powinny::
być
być
komplementarne
komplementarne
do
do
siebie
siebie
(self
(self--annealing)
annealing);;
ani
ani
tworzyć
tworzyć stabilnych
stabilnych struktur
struktur drugorzędowych
drugorzędowych typu
typu
„spinka
„spinka do
do włosów”
włosów” (hairpin)
(hairpin)..
Powinny
Powinny mięć
mięć urozmaiconą
urozmaiconą sekwencję
sekwencję ii odpowiednią
odpowiednią
długość
długość (zwykle
(zwykle ok
ok.. 20
20 nt
nt..),
), jeżeli
jeżeli mają
mają namnożyć
namnożyć
specyficznie
specyficznie określoną
określoną sekwencję
sekwencję.. Należy
Należy sprawdzić
sprawdzić
homologię
homologię primerów
primerów do
do sekwencji
sekwencji matrycy
matrycy..
5’
5’
CACTAC
CACTAC
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
ANNEALING temp. około 45 - 60 C
5’
5’
CACTAC
CACTAC
G
G
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA..
.
.
G
G
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
ELONGACJA temp. około 72 C
5’
5’
CACTAC
CACTAC
GA
GA
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
TG
TG
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
ELONGACJA temp. około 72 C
5’
5’
CACTAC
CACTAC
GAGC
GAGC
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
ATTG
ATTG
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
2011-09-26
4
5’
5’
CACTAC
CACTAC
GAGCTA
GAGCTA
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
AAATTG
AAATTG
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
5’
5’
CACTAC
CACTAC
GAGCTAGCGCCATTTAA
GAGCTAGCGCCATTTAA
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
CTCGATCGCGGTAAATTG
CTCGATCGCGGTAAATTG
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
5’
5’
CACTAC
CACTAC
GAGCTAGCGCCATTTAACTCGAT
GAGCTAGCGCCATTTAACTCGAT
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
TGATGCTCGATCGCGGTAAATTG
TGATGCTCGATCGCGGTAAATTG
AGCTAT
AGCTAT
T G C A
5’
5’
CACTAC
CACTAC
GAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA
GAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA
3’
3’
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
...GTGATGCTCGATCGCGGTAAATTGAGCTAT...
3’
3’
5’
5’
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
...CACTACGAGCTAGCGCCATTTAACTCGATA...
G
G
TGATGCTCGATCGCGGTAAATTG
TGATGCTCGATCGCGGTAAATTG
AGCTAT
AGCTAT
72
94
100
Denaturacja
Denaturacja
55
Dołączanie
startera
Wydłużanie
startera
Cykl 1
Cykl 2
°C
Jednostka
czasu
1
2
3
PROFIL TERMICZNY CYKLU
5’
3’
5’
3’
Początkowa matryca (+)
Początkowa matryca (-)
5’
5’
3’
3’
starter1
starter2
PIERWSZY CYKL TERMOREPLIKACJI DNA
2011-09-26
5
5’
3’
Początkowa matryca (+)
5’
3’
Początkowa matryca (-)
5’
3’
starter1
5’
3’
starter2
PRODUKTY PIERWSZEGO CYKLU TERMOREPLIKACJI
5’
3’
Początkowa matryca (+)
5’
3’
starter1
5’
3’
Początkowa matryca (-)
5’
3’
starter2
5’
3’
starter1
5’
3’
starter2
5’
starter2
3’
5’
3’
starter1
DRUGI CYKL TERMOREPLIKACJI DNA
5’
3’
Matryce początkowe
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Fragmenty DNA o niezdefiniowanej długości
Właściwe fragmenty
3’
5’
5’
3’
PRODUKTY DRUGIEGO CYKLU TERMOREPLIKACJI DNA
Zależność liczby cykli od wyjściowej liczby cząsteczek
matrycowego DNA
Liczba cząsteczek matrycy
Liczba cykli
300 000
25 – 30
15 000
30 – 35
1 000
35 – 40
50
40 - 45
Wizualizacja produktu reakcji PCR
Wizualizacja produktu reakcji PCR
Elektroforeza w żelu agarozowym
Elektroforeza w żelu agarozowym
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Barwniki wykorzystywane do uwidocznienia produktu
Barwniki wykorzystywane do uwidocznienia produktu
reakcji PCR:
reakcji PCR:
--bromek etydyny
bromek etydyny
--sole srebra
sole srebra
Schemat elektroforezy
Schemat elektroforezy
2011-09-26
6
Wpływ stężenia jonów magnezu na przebieg PCR
Wpływ stężenia jonów magnezu na przebieg PCR
Optymizacja liczby cykli.
Optymizacja liczby cykli.
19 21 23 25 27
1
2
3
4
19 21 23 25 27
19 21 23 25 27
19 21 23 25 27
Polimerazy DNA i RNA, nukleotydylotransferazy DNA i RNA
Polimerazy DNA i RNA, nukleotydylotransferazy DNA i RNA,
,
enzymy katalizujące syntezę DNA i RNA. Substratami tej reakcji są
enzymy katalizujące syntezę DNA i RNA. Substratami tej reakcji są
trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP i NTP).
trifosforany deoksyrybonukleozydów (dNTP i NTP).
Polimerazy były izolowane i klonowane z wielu organizmów: T4,
Polimerazy były izolowane i klonowane z wielu organizmów: T4,
E. coli,
E. coli,
T7, T5.
T7, T5.
Przełomową modyfikacją udoskonalającą oryginalnie opisaną technikę
Przełomową modyfikacją udoskonalającą oryginalnie opisaną technikę
PCR było zastąpienie fragmentu Klenowa polimerazy DNA I z
PCR było zastąpienie fragmentu Klenowa polimerazy DNA I z
E. coli
E. coli
przez termostabilną polimerazę z
przez termostabilną polimerazę z
Thermus aguaticus
Thermus aguaticus
(Taq)
(Taq)
Polimeraza Taq jest obecnie używana do większości reakcji PCR.
Polimeraza Taq jest obecnie używana do większości reakcji PCR.
Wiele jej cech może być zarówno wadą i zaletą. Brak aktywności 3'
Wiele jej cech może być zarówno wadą i zaletą. Brak aktywności 3'
do 5' egzonukloeazy uniemożliwiające korektę błędów. Wykazano
do 5' egzonukloeazy uniemożliwiające korektę błędów. Wykazano
dodatnią korelację między aktywnością egzonukleoityczną 3' to 5'
dodatnią korelację między aktywnością egzonukleoityczną 3' to 5'
oraz wiernością syntezy.
oraz wiernością syntezy.
Taq w jednym cyklu na dołączony nukleotyd myli się z częstością od
Taq w jednym cyklu na dołączony nukleotyd myli się z częstością od
2*10
2*10--4 do 2*10
4 do 2*10--5
5
W związku z opatentowaniem Taq oraz poszukiwaniem
W związku z opatentowaniem Taq oraz poszukiwaniem
enzymów o większej dokładności i termostabilności
enzymów o większej dokładności i termostabilności
rozpoczął się wyścig w izolowaniu i patentowaniu
rozpoczął się wyścig w izolowaniu i patentowaniu
nowych termostabilnych polimeraz z rożnych gatunków.
nowych termostabilnych polimeraz z rożnych gatunków.
Wiele termostabilnych polimeraz o aktywności DNA
Wiele termostabilnych polimeraz o aktywności DNA
polimerazy typu I, izolowanych jest z
polimerazy typu I, izolowanych jest z
ekstremotermofili należących do
ekstremotermofili należących do
Archebacteria
Archebacteria
(temp.
(temp.
optymalna powyżej 80 ˚C) izolowanych z dna oceanów
optymalna powyżej 80 ˚C) izolowanych z dna oceanów
w pobliżu kominów geotermalnych.
w pobliżu kominów geotermalnych.
Wśród
Wśród
Archebacteria
Archebacteria
znajdują się gatunki
znajdują się gatunki
hipertermofilne o optymalnej temp. wzrostu powyżej
hipertermofilne o optymalnej temp. wzrostu powyżej
100 ˚C. Należą one głównie do trzech rodzajów:
100 ˚C. Należą one głównie do trzech rodzajów:
Pyrodictium, Pyrococcus, and Pyrobaculum
Pyrodictium, Pyrococcus, and Pyrobaculum
. .
Charakterystyka DNA polimeraz
Taq
Vent
DeepVen Pfu
Tth
UlTma
Źródło
Thermus Thermococcus Pyrococcus Pyrococcus Thermus Thermotoga
aquaticus litoralis
GB-D
furiosus thermopilus maritima
97.5 10 130 ? 120
T
1/2
95
o
C 40 360 400 180 20 >50
92.5C 130 ? ? ? ? ?
Aktywność + -
-
-
+ -
5’-3’
Aktywność -
+ + + -
+
3’-5’
Szybkość 75 >80 >80 60 >33 ?
Syntezy (pz/s)
Końce
3’A >95% tępe >95% tępe ? 3’A Tępe
Optimum Mg(mM) 1.5 2.0 ? 1.5-2.0 ? ?
Optimum KCl(mM) 50 10 ? 10 ? ?
2011-09-26
7
Materiał do badania
Materiał do badania
krew pełna pobrana na antykoagulant inny niż heparyna
krew pełna pobrana na antykoagulant inny niż heparyna
(zamrożona lub przechowywana w temperaturze
(zamrożona lub przechowywana w temperaturze
lodówki)
lodówki)
komórki jądrzaste krwi ( „kożuszek leukocytarny”)
komórki jądrzaste krwi ( „kożuszek leukocytarny”)
wymazy zawieszone w NaCl lub buforze TRIS
wymazy zawieszone w NaCl lub buforze TRIS
bioptaty
bioptaty
materiał pobrany sródoperacyjnie (zamrożony w
materiał pobrany sródoperacyjnie (zamrożony w
ciekłym azocie)
ciekłym azocie)
zeskrobiny skóry
zeskrobiny skóry
Izolowanie kwasów nukleinowych składa się z 4 etapów:
• dezintegracji próbki
• lizy
• usunięcia białek oraz innych substancji
• wytrącenia kwasów nukleinowych
Matrycą do reakcji PCR jest
DWUNICIOWA CZĄSTECZKA czyli :
DNA lub cDNA otrzymane z mRNA
2011-09-26
8
przechowywanie
przechowywanie
DNA w temp. 4
DNA w temp. 4 C , dłuższe
C , dłuższe --20
20 C
C
RNA
RNA w temp.
w temp. --70
70 C (cDNA
C (cDNA --20
20 C)
C)
Modyfikacje PCR
Modyfikacje PCR
RT
RT--PCR
PCR
„gniazdowy” PCR
„gniazdowy” PCR
„multiplex” PCR
„multiplex” PCR
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase--PCR
PCR
••
proces
proces
PCR
PCR
poprzedzony
poprzedzony
jest
jest
przepisaniem
przepisaniem informacji
informacji zz mRNA
mRNA na
na
cDNA
cDNA (komplementarny
(komplementarny DNA)
DNA) w
w reakcji
reakcji
odwrotnej
odwrotnej transkrypcji
transkrypcji ((
ReverseTranscriptase
ReverseTranscriptase
),
),
••
w
w obecności
obecności odpowiedniego
odpowiedniego startera
startera
(najczęściej
(najczęściej uniwersalny
uniwersalny oligo
oligo dT
dT lub
lub
oligonukleotyd
oligonukleotyd swoisty
swoisty dla
dla pojedynczego
pojedynczego
matrycowego
matrycowego RNA)
RNA)
Podstawy reakcji RT-PCR
Materiał biologiczny
RNA
AAAAAAAAA
AAAAAAA
AAAAAAA
Synteza cDNA
AAAAAAA
AAAAAAA
Hybrydyzacja ze specyficznym starterem
Hybrydyzacja z oligo (dT
)
Hybrydyzacja z heksamerami
AAAAAAA
TTTTTTT
cDNA
PCR
Zanieczyszczenie RNA genomowym DNA
Genomowe DNA
mRNA
2011-09-26
9
„Gniazdowy”(nested) PCR
„Gniazdowy”(nested) PCR
••
obejmuje
obejmuje dwie
dwie następujące
następujące po
po sobie
sobie reakcje
reakcje PCR
PCR
••
po
po pierwszej
pierwszej reakcji
reakcji PCR
PCR zz użyciem
użyciem jednej
jednej pary
pary
starterów
starterów następuje
następuje druga
druga reakcja
reakcja PCR
PCR (matrycą
(matrycą jest
jest
produkt
produkt pierwszej
pierwszej reakcji),
reakcji), w
w której
której stosuje
stosuje się
się inne
inne
startery
startery zlokalizowane
zlokalizowane
bliżej
bliżej środka
środka powielanego
powielanego
fragmentu
fragmentu DNA
DNA..
••
ostateczny
ostateczny wynik
wynik tak
tak przeprowadzonego
przeprowadzonego procesu
procesu jest
jest
wielokrotnie
wielokrotnie
bardziej
bardziej wiarygodny
wiarygodny
od
od uzyskanego
uzyskanego
metodą
metodą zwykłego
zwykłego PCR
PCR (wzrost
(wzrost czułości
czułości ii swositości
swositości
diagnostycznej)
diagnostycznej)
„Multiplex”PCR
„Multiplex”PCR
w
w jednej
jednej mieszaninie
mieszaninie reakcyjnej
reakcyjnej wykorzystuje
wykorzystuje się
się
więcej
więcej niż
niż jedną
jedną parę
parę starterów
starterów
można
można namnażać
namnażać kilka
kilka genów
genów w
w jednej
jednej probówce
probówce
można
można wykonać
wykonać porównawczą
porównawczą analizę
analizę półilościową
półilościową --
namnożeniu,
namnożeniu, obok
obok analizowanego
analizowanego
fragmentu
fragmentu
DNA,
DNA,
poddaje
poddaje się
się matrycę
matrycę standardową
standardową (gen
(gen metabolizmu
metabolizmu
podstawowego),
podstawowego), uzyskując
uzyskując jej
jej ściśle
ściśle mierzalne
mierzalne ilości
ilości..
Pozwala
Pozwala to
to
również
również kontrolować
kontrolować
poprawność
poprawność
przebiegu
przebiegu prowadzonego
prowadzonego procesu
procesu
Schemat multiplex PCR
Schemat multiplex PCR