PCR - Z MAŁEJ ILOŚCI DUŻA ILOŚĆ W KRÓTKIM CZASIE.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na
przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących
określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to
metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet
bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomość sekwencji
otaczającej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cząsteczka
matrycy.

Typowa reakcja PCR polega na powtarzających się cyklach :

1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90°C. Syntetyczne
oligonukleotydy długości mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3`
końców kawałka DNA , którego powieleniem jesteśmy zainteresowani , dodane są w
dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.

2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C. DNA pozostaje zdenaturowany
ponieważ komplementarne łańcuchy są w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z
ilością starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z
komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służą jako startery do
syntezy DNA , którą prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza
izolowana z bakterii Thermus aqaticus.

3. Synteza odbywa się w temperaturze 72°C.

PCR

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html

1 z 5

2010-04-04 13:25

Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95°C aby rozdysocjować
nowo powstałe dupleksy DNA. Później temperatura jest obniżana i zachodzi następna
runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej
długości. Stopniowo zaczynają przeważać fragmenty ograniczone straterami a
końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii

sekwencji pomiędzy primerami rośnie wykładniczo jak 2

n

gdzie n jest liczbą cykli.

Amplifikacja fragmentu D)A metodą PCR.

)umer

cyklu

Liczba dwuniciowych ,

zamplifikowanych cząsteczek D)A

1

0

2

0

PCR

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html

2 z 5

2010-04-04 13:25

3

2

4

4

5

8

6

16

7

32

8

64

9

128

10

256

11

512

12

1024

13

2048

14

4096

15

8192

16

16 384

17

32 768

18

65 536

19

131 072

PCR

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html

3 z 5

2010-04-04 13:25

20

262 144

21

524 288

22

1 048 576

23

2 097 152

24

4 194 304

25

8 388 608

26

16 777 216

27

33 544 432

28

67 108 864

29

134 217 728

30

268 435 456

31

536 870 912

32

1 073 741 824

Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy
sekwencjonowaniu.

ZASTOSOWA)IE :

PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA
izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych

- diagnostyce chorób dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie

- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce

PCR

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html

4 z 5

2010-04-04 13:25

- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów

- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.

RODZAJE PCR :

RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu
dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej
sekwencji.

Na pewno zwiążą się one z DNA w jakimś miejscu a ponieważ jednorazowo do
każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie
sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległości od siebie w genomie ,
która pozwoli na wydajną amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad.
Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj
PCR znalazł zastosowanie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami
a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.

RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do
namnażania jest

mRNA

a nie jak zazwyczaj DNA.

ZAZĘBIO)A PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w
większym uprzednio namnożonym fragmencie.

PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez
naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.

PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy
w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to
szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach.
Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko
mierząc ilość

mRNA

.

SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY

WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO

(c) 1997, 1998 Biologia Molek ularna w Internecie

Webmaster

PCR

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab8.html

5 z 5

2010-04-04 13:25