PCR w czasie

PCR w czasie

rzeczywistym

rzeczywistym

real-time

real-time

PCR

PCR

Real-time PCR

Real-time PCR

bazuje na

bazuje na

konwencjonalnej

konwencjonalnej

metodzie

metodzie

PCR

PCR



Problemy metody PCR:

Problemy metody PCR:

1

1

-brak możliwości określenia

-brak możliwości określenia

początkowej liczby kopii badanego

początkowej liczby kopii badanego

fragmentu DNA, mierząc ilość

fragmentu DNA, mierząc ilość

produktu na końcu reakcji PCR

produktu na końcu reakcji PCR

2

2

-czasochłonny etap detekcji

-czasochłonny etap detekcji

produktu reakcji i jego ilości

produktu reakcji i jego ilości

(

(

elektroforeza

elektroforeza

w

w

żelu

żelu

agarozowym

agarozowym

,

,

Southern

Southern

blot

blot

czy

czy

ELISA

ELISA

)

)

Real-time PCR

Real-time PCR



bardzo szybka analiza ilości produktu

bardzo szybka analiza ilości produktu

w każdym cyklu reakcji PCR (stąd

w każdym cyklu reakcji PCR (stąd

często mówi się o

często mówi się o

„rapid-cycle real-time PCR”)

„rapid-cycle real-time PCR”)



pomija uciążliwe etapy obróbki

pomija uciążliwe etapy obróbki

amplifikowanego materiału po reakcji

amplifikowanego materiału po reakcji



pozwala na wgląd w kinetykę reakcji

pozwala na wgląd w kinetykę reakcji

PCR (inna nazwa real-time PCR to

PCR (inna nazwa real-time PCR to

„kinetic PCR”)

„kinetic PCR”)



oszacowania początkowej ilości

oszacowania początkowej ilości

badanego DNA

badanego DNA

„quantitative PCR”

„quantitative PCR”



pozwala do minimum ograniczyć

pozwala do minimum ograniczyć

ryzyko zanieczyszczenia próby

ryzyko zanieczyszczenia próby

Zasady real-time PCR

Zasady real-time PCR



znakowanie

znakowanie

starterów

starterów

sond

sond

oligonukleotydowych

oligonukleotydowych

lub

lub

amplikonów

amplikonów

cząsteczkami zdolnymi do

cząsteczkami zdolnymi do

fluorescencji

fluorescencji

(

(

fluorochromami

fluorochromami

)

)



Fluorochromy

Fluorochromy

muszą zostać wzbudzone

muszą zostać wzbudzone

światłem o określonej długości fali,

światłem o określonej długości fali,

a wyemitowana przez nie energia

a wyemitowana przez nie energia

musi być wykryta i zmierzona

musi być wykryta i zmierzona



Do obliczenia ilości badanych

Do obliczenia ilości badanych

cząsteczek obecnych w mieszaninie

cząsteczek obecnych w mieszaninie

na początku reakcji wykorzystuje się

na początku reakcji wykorzystuje się

moment, w którym poziom

moment, w którym poziom

fluorescencji

fluorescencji

barwnika przekroczy

barwnika przekroczy

zdefiniowany próg (CT).

zdefiniowany próg (CT).



Poszczególne

Poszczególne

kolorowe linie

kolorowe linie

obrazują różne

obrazują różne

reakcje (próby

reakcje (próby

badane oraz

badane oraz

standardy), gdy

standardy), gdy

poziom

poziom

fluorescencji dla

fluorescencji dla

danej reakcji

danej reakcji

przekroczy próg

przekroczy próg

(30,0 jednostek

(30,0 jednostek

umownych;

umownych;

pozioma linia

pozioma linia

czerwona)

czerwona)

kalkulowana jest

kalkulowana jest

ilość cykli po

ilość cykli po

których to nastąpiło

których to nastąpiło

(CT; pionowe

(CT; pionowe

czerwone linie; nie

czerwone linie; nie

muszą to być liczby

muszą to być liczby

całkowite!).

całkowite!).



lość cykli po

lość cykli po

których kinetyka

których kinetyka

reakcji wchodzi w

reakcji wchodzi w

fazę logarytmiczną

fazę logarytmiczną

(FAM Ct) - poziom

(FAM Ct) - poziom

fluorescencji

fluorescencji

fluorochromu FAM

fluorochromu FAM

przekroczył próg

przekroczył próg

30 jednostek -

30 jednostek -

odnotowana

odnotowana

zostaje dla próbek

zostaje dla próbek

badanych (UNKN,

badanych (UNKN,

ang. unknown)

ang. unknown)

oraz standardów

oraz standardów

(STD, ang.

(STD, ang.

standard).

standard).

Reakcj

Reakcj

a

a

Typ

Typ

FAM

FAM

Std/R

Std/R

es

es

FAM

FAM

Ct

Ct

A1

A1

UNKN

UNKN

0,59

0,59

4

4

28,0

28,0

3

3

A2

A2

UNKN

UNKN

1,90

1,90

1

1

26,2

26,2

A3

A3

UNKN

UNKN

0,81

0,81

27,5

27,5

4

4

A4

A4

UNKN

UNKN

0,66

0,66

6

6

27,8

27,8

5

5

A5

A5

UNKN

UNKN

0,45

0,45

9

9

28,4

28,4

3

3

A6

A6

UNKN

UNKN

0,30

0,30

4

4

29,0

29,0

8

8

A7

A7

UNKN

UNKN

0,49

0,49

6

6

28,3

28,3

1

1

B1

B1

STD

STD

0,53

0,53

6

6

28,1

28,1

9

9

B2

B2

STD

STD

ND

ND

39,0

39,0

4

4

B3

B3

STD

STD

3,25

3,25

25,4

25,4

1

1

B4

B4

STD

STD

1,62

1,62

7

7

26,3

26,3

8

8

B5

B5

STD

STD

0,41

0,41

2

2

28,5

28,5

5

5

B6

B6

STD

STD

0,20

0,20

3

3

29,8

29,8

3

3

B7

B7

STD

STD

0,10

0,10

1

1

30,7

30,7

6

6

B8

B8

STD

STD

0

0

0

0

A8

A8

UNKN

UNKN

0,25

0,25

8

8

29,3

29,3

4

4



Dysponując takimi

Dysponując takimi

danymi komputer

danymi komputer

wykreśla krzywą

wykreśla krzywą

standardową, z

standardową, z

której odczytuje

której odczytuje

wartości ilości kopii

wartości ilości kopii

(FAM Std/Res) dla

(FAM Std/Res) dla

próbek badanych

próbek badanych

(UNKN).

(UNKN).

Barwniki i sondy używane w real-

Barwniki i sondy używane w real-

time PCR

time PCR



1-cząsteczki fluorochromu

1-cząsteczki fluorochromu

emitujące

emitujące

światło o określonej długości po

światło o określonej długości po

związaniu się z dwuniciowym

związaniu się z dwuniciowym

DNA,

DNA,

takie jak

takie jak

bromek

bromek

etydyny

etydyny

,

,

jodek

jodek

propidyny

propidyny

,

,

czy

czy

SYBR

SYBR

Green

Green

I

I



Kompleks

Kompleks

SYBR-DNA ma maksimum

SYBR-DNA ma maksimum

absorpcji

absorpcji

przypadające na

przypadające na

długość fali

długość fali

świetlnej

świetlnej

równą

równą

498nm (

498nm (

kolor niebieski

kolor niebieski

), a maksimum emisji przy

), a maksimum emisji przy

522nm (

522nm (

kolor zielony

kolor zielony

). SYBR bardzo silnie i

). SYBR bardzo silnie i

specyficznie wiążę się do DNA, dając silny sygnał

specyficznie wiążę się do DNA, dając silny sygnał

wprost proporcjonalny do ilości DNA w próbie

wprost proporcjonalny do ilości DNA w próbie



2-Sondy TaqMan

2-Sondy TaqMan

-

-

krótkie

krótkie

oligonukleotydy

oligonukleotydy

zawierające na

zawierające na

końcu 5’ reporter

końcu 5’ reporter

fluorescencji

fluorescencji

(np.

(np.

FAM, NED

FAM, NED

),

),

a na końcu

a na końcu

3’ cząsteczkę

3’ cząsteczkę

wygaszającą

wygaszającą

fluorescencję

fluorescencję

(np.

(np.

TAMRA, DABCYL

TAMRA, DABCYL

).

).



Wielkość sondy umożliwia

Wielkość sondy umożliwia

przekazywanie energii

przekazywanie energii

między fluorochromami.

między fluorochromami.

Sonda taka po związaniu

Sonda taka po związaniu

się z komplementarną

się z komplementarną

sekwencją na etapie

sekwencją na etapie

wydłużania jest

wydłużania jest

degradowana przez

degradowana przez

polimerazę Taq

polimerazę Taq

posiadającą aktywność 5`-

posiadającą aktywność 5`-

egzonukleazową, przez co

egzonukleazową, przez co

fluorochrom ulega

fluorochrom ulega

oddzieleniu od

oddzieleniu od

wygaszacza. Rozdział obu

wygaszacza. Rozdział obu

cząsteczek umożliwia

cząsteczek umożliwia

emisję światła

emisję światła

fluorescencyjnego

fluorescencyjnego



http://www.youtube.com/watch?

http://www.youtube.com/watch?

v=ZfnJXCr4NVA

v=ZfnJXCr4NVA