Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne sk³adniki, b¹dŸ oddzielenia

tylko wybranych substancji od innych, jest najczêœciej ich iloœciowe oznaczenie, tj. ustalenie

zwartoœci lub masy analitu w bardzo du¿ej próbce.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest wykorzystywana do oznaczenia

zawartoœci sk³adników g³ównych, t.j. wystêpuj¹cych w próbce na poziomie stê¿eñ w zakresie od

1 do 100 %, sk³adników poœrednich - od 0.001 do 1% oraz substancji obecnych w analizowanej

próbce poni¿ej 0.001%, tj. sk³adników œladowych.

Oznaczenie iloœciowe w HPLC polega na ustaleniu zale¿noœci pomiêdzy sygna³em detek-

tora, czyli powierzchni¹ pod pikiem lub ewentualnie wysokoœci¹ piku, a stê¿eniem lub mas¹

sk³adnika, którego zawartoœæ zamierzamy oznaczyæ. W praktyce mamy do dyspozycji cztery

metody oznaczania: metodê wzorca zewnêtrznego (metodê krzywej kalibracyjnej), metodê wzor-

ca wewnêtrznego, metodê dodatku wzorca (metodê fortyfikacji) oraz metodê prostej normaliza-

cji lub normalizacji ze wspó³czynnikami korekcyjnymi.

11.1.

METODA WZORCA ZEWNÊTRZNEGO

(METODA KRZYWEJ KALIBRACYJNEJ, EXTERNAL STANDARD)

Istot¹ metody wzorca zewnêtrznego jest wyznaczenie zale¿noœci pomiêdzy powierzchni¹

(wysokoœci¹) piku dla ka¿dej z oznaczanych substancji i ich stê¿eniem lub mas¹.

W tym celu przygotowuje siê roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji oznaczanej

albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku ró¿nych stê¿eniach (np. 1.0, 2,0, 3.0, 4.0

mg/mL). Ka¿dy z przygotowanych roztworów dozowany jest do kolumny chromatograficznej.

Na podstawie powierzchni lub wysokoœci pików, na uzyskanych chromatogramach wyznacza siê

przebieg krzywej kalibracyjnej b¹dŸ oblicza siê wartoœci wspó³czynników w równaniu kalibra-

cyjnym dla ka¿dej z oznaczanych substancji. Nastêpnie dozowane do kolumny i rozdzielane s¹

próbki, w których oznaczona ma byæ zawartoœæ substancji. Uzyskane powierzchnie pików sub-

stancji oznaczanych w nieznanej próbce umo¿liwi¹ oznaczenie ich zawartoœci, tj. stê¿enia

(masy). W praktyce wykonuje siê to metod¹ graficznej interpolacji na wykresie krzywej kalibra-

cyjnej, w oparciu o równanie krzywej kalibracyjnej lub z wykorzystaniem równania (1).

(1)

gdzie: C

x

- oznaczona zawartoϾ, A

x

- powierzchnia piku, R

f

- wspó³czynnik odpowiedzi, tj. ilo-

raz powierzchni piku i stê¿enia substancji o znanym stê¿eniu w roztworze wzorcowym. Gdy

równanie kalibracyjne wyra¿one jest funkcj¹ typy f(x) = a

1

x, to wspó³czynnik odpowiedzi jest

wspó³czynnikiem kierunkowym a

1

tej prostej, dla których wykonano kalibracjê.

171

11. OZNACZANIE ILOŒCIOWE W HPLC

Rafa³ Kartanowicz

f

x

x

R

A

C

=

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:44 Page 171

Na rysunku 1 i 2 przedstawiono odpowiednio: typow¹ krzyw¹ kalibracyjn¹ uzyskan¹ metod¹

wzorca zewnêtrznego oraz chromatogramy roztworów wzorcowych.

172

Rys. 11.1. Wykres krzywej kalibracyjne otrzymanej metod¹ wzorca zewnêtrznego.

Rys. 11.2. Chromatogramy roztworów wzorcowych substancji A, B, C o stê¿eniach 1.0, 2.0 i 4.0

mg/mL.

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:44 Page 172

Stosowanie tej metody kalibracji wymaga, aby zarówno roztwory wzorcowe jak i anali-

zowane próbki by³y rozdzielane ("chromatografowane") w tych samych warunkach temperatury,

objêtoœciowego natê¿enie przep³ywu eluentu, typu i wymiarów kolumny chromatograficznej, z

regu³y tej samej kolumny, sk³adu eluentu oraz takiego samego programu elucji. Ponadto trzeba

braæ te¿ pod uwagê nastêpuj¹ce czynniki:

z

Równanie kalibracyjne jest najczêœciej zale¿noœci¹ prostoliniow¹ typu y = a

1

x + a

2

, ale

niekiedy do opisu przebiegu krzywej kalibracyjnej wykorzystuje siê inne funkcje:

gdzie: y - powierzchnia piku(wysokoœæ), x - stê¿enie (masa) substancji,

a

1,2,3,4

- wspó³czynniki.

z

Dozowanie do kolumny chromatograficznej powinno byæ powtarzalne.

z

Oznaczanie zawartoœci substancji w próbkach nieznanych mo¿e byæ wykonywane tylko

w zakresie stê¿eñ, w jakim zosta³a wykona kalibracja, dotyczy to tak¿e innych metod tj.

metody wzorca wewnêtrznego czy fortyfikacji. Ekstrapolacja przebiegu krzywej kali-

bracyjnej poza zakres wykonanej kalibracji, mo¿e byæ Ÿród³em niedok³adnych wyników

oznaczeñ ze wzglêdu na nieliniowy przebieg odpowiedzi detektora.

11.2.

METODA WZORCA WEWNÊTRZNEGO

Jest to metoda polegaj¹ca na dodaniu do próbki znanej iloœci sk³adnika, tzw. wzorca

wewnêtrznego (IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie mo¿e byæ obecny w

analizowanych próbkach przed jego dodaniem.

W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów wzorcowych o ró¿nych stê¿e-

niach substancji oznaczanej dodaje siê najczêœciej sta³¹ i znan¹ iloœæ wzorca wewnêtrznego. Na

podstawie uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykreœla siê zale¿noœæ stê¿e-

173

2

1

4

3

2

2

3

1

3

2

2

1

1

,

a

x

a

y

a

xa

x

a

x

a

y

a

xa

x

a

y

x

a

y

=

+

+

+

=

+

+

=

=

Rys. 11.3. Wykres krzywej kalibracyjnej otrzymanej przy zastosowaniu techniki wzorca

wewnêtrznego.

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 173

nia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnêtrznego. Na rysunku 11.3

przedstawiono krzyw¹ kalibracyjn¹ dla substancji oznaczanej metod¹ wzorca wewnêtrznego.

W celu oznaczenia zawartoœci substancji metod¹ wzorca wewnêtrznego w próbce badanej

(o znanej masie lub objêtoœci), dodaje siê do niej znan¹ iloœæ wzorca wewnêtrznego. Nastêpnie

z zarejestrowanego chromatogramu oblicza siê stosunek powierzchni piku analitu i wzorca

wewnêtrznego. Zawartoœæ substancji wyznacza siê metod¹ graficznej interpolacji, oblicza z rów-

nania krzywej kalibracyjnej lub z wykorzystaniem zale¿noœci (2) i (3) w sytuacji, kiedy krzywa

kalibracyjna jest zale¿noœci¹ liniow¹ typu f(x) = a

1

x:

(2)

(3)

gdzie: C

x

- oznaczona zawartoϾ, A

x

- powierzchnia piku analitu, A

ist

- powierzchnia piku wzor-

ca wewnêtrznego, R

f

- wspó³czynnik odpowiedzi, A

i

, A

ist(i)

- powierzchnia piku analitu i wzorca

wewnêtrznego w roztworze kalibracyjnym, c

i

- stê¿enie analitu w roztworze kalibracyjnym.

Na rysunku 11.4 przedstawiono chromatogram mieszaniny wzorcowej substancji

oznaczanych oraz wzorca wewnetrznego.

Wzorzec wewnêtrzny powinien spe³niaæ nastêpuj¹ce wymagania:

z

musi byæ rozdzielony od innych sk³adników wystêpuj¹cych w próbce

z

czas retencji powinien byæ zbli¿ony do czasu retencji analitu(ów)

z

nie wystêpuje w próbkach pierwotnych

z

w³aœciwoœci fizyko-chemiczne s¹ podobne do analitu. Jest to szczególnie istotne na

etapie przygotowania próbek (oczyszczania, wzbogacania czy derywatyzacji)

z

powinien byæ mo¿liwie wysokiej czystoœci

z

stabilny chemicznie

z

odpowiedŸ detektora dla wzorca wewnêtrznego powinna byæ zbli¿ona do odpowiedzi

substancji oznaczanych

i

i

ist

i

f

c

A

A

R

)

(

/

=

f

ist

x

x

R

A

A

C

/

=

174

Rys. 4. Chromatogram mieszaniny substancji oznaczanych A, B, C, D oraz wzorca

wewnêtrznego (IST).

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 174

Metoda ta ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod analitycznych wymagaj¹cych

z³o¿onej, wieloetapowej procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie, derywatyzac-

ja itp.), co mo¿e powodowaæ straty analitów. Dodanie wzorca wewnêtrznego do badanej próbki

jeszcze przed przyst¹pieniem do przegotowania próbki do analizy chromatograficznej pozwala

na skorygowanie tych strat.

Stosowanie metody wzorca wewnêtrznego pozwala równie¿ na uniezale¿nienie otrzymy-

wanych wyników od wahañ iloœci dozowanej próbki. Ograniczaniem w stosowaniu tej metody

mo¿e byæ bardzo bogata matryca, w której znajduj¹ siê anality. Trudne mo¿e byæ dobranie

odpowiedniej substancji jako wzorca wewnêtrznego. W praktyce metoda ta jest te¿ bardziej pra-

coch³onna ni¿ metoda krzywej kalibracyjnej.

11.3.

METODA DODATKU WZORCA

Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych iloœci substancji oznaczanych (analitów)

np. 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 i 0.5 mg/mL, zwykle jest to od 50 do 150% oczekiwanej zawartoœci

oznaczanej substancji. Po zanalizowaniu tych roztworów, na podstawie uzyskanych chro-

matogramów, wykreœla siê krzyw¹ kalibracyjn¹, tj. zale¿noœæ powierzchni piku analitu w funkcji

iloœci analitu dodanej do próbki (Rysunek 11.5).

Nastêpnie przeprowadza siê graficzn¹ ekstrapolacjê krzywej kalibracyjnej do punkt prze-

ciêcia z osi¹ odciêtych i odczytuje siê wartoœæ Cx. Innym sposobem okreœlenia zawartoœci sub-

stancji oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest graficzne wyznaczenie przebiegu nowej

linii kalibracyjnej typu f(x) = a

1

x, o tym samym wspó³czynniku nachylenia prostej, co krzywa

kalibracyjna. Przeprowadza siê wówczas graficzn¹ interpolacjê, b¹dŸ oblicza siê stê¿enie anali-

tu w próbce bez dodatku substancji oznaczanej z równania (4), na przyk³ad: Cx=22.5/120=0.19.

(4)

gdzie: a

1

- wspó³czynnik kierunkowy prostej, a

2

- wartoœæ w punkcie przeciêcia siê prostej z osi¹

rzêdnych.

175

Rys. 11.5. Wykres krzywej kalibracyjnej otrzymanej przy zastosowaniu metody dodatku wzorca.

1

2

)

0

(

a

x

a

c

x

=

=

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 175

Zalet¹ metody dodatku wzorca jest wykonanie kalibracji w takich warunkach, ¿e anality

znajduj¹ siê w rzeczywistej matrycy. Szczególnie, kiedy jest bardzo trudne b¹dŸ niemo¿liwe

otrzymanie matrycy (placebo), w której nie znajdowa³aby siê substancja oznaczana, np. w przy-

padku próbek klinicznych i œrodowiskowych. Szczególn¹ cecha tej metody jest jej wysoka

"odpornoœæ" na sytuacjê niepe³nego rozdzielenia analitu oraz gdy pik substancji oznaczanej nie

jest rozdzielony do linii podstawowej od innych substancji, których piki s¹ jednak znacznie

mniejsze w stosunku do substancji oznaczanej. Na rysunku 11.6 przedstawiono przyk³ad takiego

chromatogramu, na którym pik substancji oznaczanej zaznaczono symbolem "1". W wy¿ej

wymienionych sytuacjach tylko metoda dodatku wzorca pozawala na oznaczenie zawartoœci sub-

stancji w próbce. Wykonanie oznaczenia zawartoœci substancji metod¹ dodatku wzorca jest jed-

nak pracoch³onne.

11.4.

METODA PROSTEJ NORMALIZACJI

Metoda prostej normalizacji nie jest metod¹ kalibracji. Nie stosuje siê w niej odniesienia

do znanej iloœci wzorca. Jednak¿e metoda ta umo¿liwia oszacowanie wzglêdnych iloœci sub-

stancji np. zawartoœci zanieczyszczeñ w badanej próbce.

Na podstawie chromatogramu oblicza siê sumaryczn¹ powierzchniê pików, któr¹ traktuje

siê jak 100%. Nastêpnie oblicza siê udzia³ powierzchni okreœlonego piku wzglêdem sumy

powierzchni wszystkich lub tylko wybranych pików na chromatogramie. Otrzymanej wartoœci

dla danej substancji przypisuje siê procentow¹ zawartoœci wzglêdem innych substancji obecnych

w mieszaninie. Obliczenia wykonuje siê zgodnie z poni¿szym równaniem (5).

(5)

gdzie: c

i

- udzia³ % substancji i wzglêdem innych pików na chromatogramie, A

i

- powierzchnia

piku,

ΣA

i

- suma powierzchni wszystkich lub wybranych pików na chromatogramie

Na rysunku 11.7 chromatogram mieszaniny substancji oznaczanych oraz ich udzia³y pro-

centowe w próbce uzyskanê metod¹ prostej normalizacji.

100

×

Σ

=

i

i

i

A

A

c

176

Rys. 11.6. Chromatogram mieszaniny substancji, w której analit (1) nie jest w rozdzielony do linii

bazowej od innych substancji.

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 176

Metoda prostej normalizacji opiera siê na za³o¿eniu, ¿e wspó³czynniki odpowiedzi dla

ka¿dego sk³adnika próbki s¹ takie same, tzn. takie same stê¿enia ró¿nych substancji odpowiada-

j¹ takim samym powierzchniom ich pików chromatograficznych. Tak¹ charakterystyk¹ cechuje

siê detektor FID (p³omieniowo-jonizacyjny) stosowany w chromatografii gazowej do oznacza-

nia wêglowodorów. W chromatografii cieczowej metoda uproszczonej normalizacji jest

stosowana bardzo rzadko. Wynika to st¹d, ¿e detektory stosowane w HPLC charakteryzuj¹ siê

zró¿nicowan¹ czu³oœci¹ wzglêdem substancji. Stosowanie detektora typu UV-VIS i metody

prostej normalizacji jest nie celowe, poniewa¿ nawet substancje nale¿¹ce do tego samego szeregu

homologicznego charakteryzuj¹ siê zró¿nicowanymi molowymi wspó³czynnikami absorbancji

(

ε). Zatem odpowiedŸ detektora UV-VIS zale¿y od stê¿enia substancji jak i molowego

wspó³czynnika absorbancji

Korzystne mo¿e byæ stosowanie metody prostej normalizacji, gdy wykorzystywany jest

detektor refraktometryczny lub detektor œwiat³a rozproszonego. Detektory te wykazuj¹ zbli¿on¹

odpowiedŸ dla ró¿nych substancji o zbli¿onej strukturze i masie cz¹steczkowej.

11.5.

METODA NORMALIZACJI ZE WSPÓ£CZYNNIKAMI

KOREKCYJNYMI

Metoda ta, podobnie jak metoda prostej normalizacji, polega na okreœleniu wzglêdnej

powierzchni piku substancji badanej wzglêdem wybranych b¹dŸ wszystkich pików na chro-

matogramie z uwzglêdnieniem wspó³czynników korekcyjnych, uwzglêdniaj¹cych zró¿nicowan¹

odpowiedŸ detektora dla ró¿nych sk³adników próbki.

Wspó³czynniki korekcyjne wykorzystuje siê w celu oznaczenia rzeczywistego udzia³u

procentowego poszczególnych substancji w próbce analizowanej zgodnie z równaniem (6).

(6)

gdzie: c

i

- udzia³ % substancji i, A

i

- powierzchnia piku,

ΣA

i

- suma powierzchni wszystkich lub

wybranych pików na chromatogramie, R

f,i

- wspó³czynnik odpowiedzi (wspó³czynnik korek-

cyjny) dla substancji i

177

Rys. 11.7. Chromatogram mieszaniny substancji, na którym podano udzia³y procentowe sk³adników

otrzymane metod¹ prostej normalizacji.

100

)

(

×

×

Σ

×

=

fi

i

fi

i

i

R

A

R

A

c

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 177

W celu wyznaczenia wspó³czynników korekcyjnych postêpuje siê w sposób nastêpuj¹cy.

Na chromatogramie mieszaniny o znanych zawartoœciach substancji badanych oblicza siê pola

powierzchni pików, a nastêpnie oblicza siê wzglêdny udzia³ procentowy poszczególnych sub-

stancji metod¹ prostej normalizacji. W dalszej kolejnoœci oblicza siê wartoœæ wspó³czynnika

korekcyjnego dla danej substancji korzystaj¹c z równania (7).

(7)

gdzie: c

i

(znane) - zawartoœæ sk³adnika i w roztworze wzorcowym, c

i

(obliczone) - udzia³ sk³ad-

nika i w rozworze wzorcowym obliczony metod¹ prostej normalizacji.

W praktyce, czêsto zak³ada siê, ¿e dla wybranej substancji w mieszaninie wspó³czynnik

korekcyjny przyjmuje wartoϾ 1.

Na przyk³ad, dla substancji A, B, C, D przedstawionych na chromatogramie na rysunku 7

wyznaczone wspó³czynniki korekcyjne wynosz¹: R

fA

= 1, R

fB

= 1.1, R

fC

= 1.1, R

fD

= 1.2, st¹d

uzyskane zawartoœci po uwzglêdnieniu wspó³czynników korekcyjnych poszczególnych sk³ad-

ników wynosz¹: A - 20.1, B - 20.0, C - 43.5, D - 16.4 [%].

178

)

(

)

(

obliczone

c

znane

c

R

i

i

fi

=

Oznaczanie ilo ciowe w HPLC.qxp 2004-06-04 00:45 Page 178