Izolacja i oznaczanie kwasów
nukleinowych
Kwasy nukleinowe
polianiony związane z kationowymi białkami
DNA RNA
- dwuniciowe - jednoniciowe,
- związane z białkami - grupa 2'OH,
(histony)
- mało stabilne
- stabilne
- krótkie fragmenty
- długie łańcuchy
Kwasy nukleinowe - lokalizacja
Parametry mające wpływ na wydajność
izolacji DNA/RNA
" Poziom aktywności enzymów nukleotydo- i
nukleozydolitycznych w eksplantach tkanek (najwięcej w
śledzionie i trzustce, najmniej w grasicy)
" Ilościowy stosunek RNA/DNA oraz zawartość DNA w
materiale biologicznym (~4 dla wÄ…troby szczura, ~0,4 w
grasicy cielęcej)
" Zawartość DNA (0,2% w wątrobie szczura, 2,5% w
grasicy cielęcej
Wymagania stawiane procedurze izolacji
kwasów nukleinowych
1. Zniszczenie membran i ściany komórkowej by uwolnić
kwasy nukleinowe.
2. Ochrona przed enzymamy trawiÄ…cymi (DNazami i
RNazami).
3. Oddzielenie kwasów nukleinowych od pozostałych
składników komórki (białka, tłuszcze).
Johann Friedrich Miescher
W 1869 r. wyizolował z leukocytów ludzkich
substancję, którą nazwał  nukleiną . Zauważył, że zawiera
fosfor i azot w stałych proporcjach.
Opracował metodę oczyszczania nukleiny z tkanek.
Metoda izolacji DNA/RNA wg. Schmidta i
Thanhausera (1945r.)
Materiał do izolacji
Komórki bakteryjne i eukariotyczne
" tkanki:
 krew,
 wycinki śródoperacyjne,
 fragmenty roślin,
" hodowle komórek zwierzęcych, roślinnych i bakterii
" żywność,
" z wydzielin i wydalin,
" mikroślady (cebulki włosów, ślady śliny, wyczyszczone ślady
krwi)
" materiału kopalnego,
Cele izolacji
1. Analiza sekwencji  diagnostyka chorób
- wykrywanie mutacji
- badania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP, ang. single
nucleotide polymorphism).
2. Identyfikacja osób, oznaczanie ojcostwa
- analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych.
3. Badania naukowe
- ustalanie klasyfikacji organizmów,
- tworzenie konstruktów genowych,
- klonowanie.
4. Żywność
- tworzenie organizmów transgenicznych (poprawa produktywności,
wartości odżywczej),
- badanie zafałszowania żywności.
5. Leczenie  terapie genowe.
Izolowane kwasy nukleinowe
" DNA genomowy  chlorowodorek guanidyny, kolumienki
" DNA plazmidowy  liza alkaliczna, kolumienki
" RNA całkowite  Trizol, Tri Reagent, kolumienki
" mRNA  na zasadzie powinowactwa do ogonów poliA
Skala izolacji plazmidowego DNA z
hodowli bakteryjnych
" Mini skala  3-5 ml hodowli, do 20ug DNA
" Midi skala  100 ml hodowli, do 100ug DNA
" Maxi skala - 250-500ml hodowli, do 0,5mg DNA
" Mega skala  0,5  2,5l hodowli, do 2,5mg DNA
" Giga skala  2,5l  5l hodowli, aż do 10mg DNA
Zasada wiązania DNA do złoża
krzemionkowego
Etapy izolacji DNA plazmidowego
na małą skalę z hodowli bakteryjnej
Zawieszenie
bakterii w
Liza
Hodowla Wirowanie
roztworze
alkaliczna
bakteryjna 5,5k G
stabilizujÄ…cym
Dalsze  Neutralizacja
Precypitacja Wirowanie
odbiałczanie i wytrącenie
DNA 12k G
próby przez białek
FCI
FCI  fenol-chloroform-alkohol izoamylowy 25:24:1
Odsolenie 70% alkoholem Zawieszenie w wodnym lub
etylowym buforowanym roztworze
RNazy (20ug/ml)
Formy konformacyjne plazmidów
forma kolista
forma kolista superskręcona
forma liniowa
zrelaksowana
(CCC  closed circular
(L  linear)
(OC  open circular)
coiled)
kolista zrelaksowana
liniowa
superskręcona
Izolacja genomowego DNA
" Liza termiczna, enzymatyczna (proteinaza K),
" Denaturacja 5M GuHCl  sól chaotropowa,
" Precypitacja, odsalanie,
" Trawienie RNA RNazÄ… A,
Precypitacja DNA
" Alkohol etylowym 2,5:1
" Alkoholem izopropylowym 1:1
" Alkoholem butylowym 1:1
Przy małych ilościach DNA stosuje się dodatek
" Glikogenu
" Octanu sodu pH 5,5 w stosunku 1:10
Izolacja RNA
metodą Chomczyńskiego
" Liza komórek Trizolem, inkubacja i wirowanie
" Dodanie chloroformu i separacja faz, RNA znajduje siÄ™ w fazie
wodnej
" Precypitacja RNA izopropanolem
" Odsalanie RNA etanolem 75%
" Zawieszenie RNA w wodzie
traktowanej DEPC lub buforze TE
faza wodna
interfaza (DNA, białka)
faza organiczna (białka, lipidy)
Spektrofotometryczne oznaczanie
ilości kwasów nukleinowych
Dla A260=1
50µg/mL dsDNA
40µg/mL ssDNA, RNA
20µg/mL ss oligo (krótkie
fragmenty)
Czysty preparat DNA:
A260/A280= 1,8 ~2,0
G.I.T. Laboratory Journal 05-06/2008, pp 9 11, GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt
Analiza kwasów nukleinowych
oparta na zjawisku fluorescencji
" interkalator
Pomiar fluorescencji fluorochromu: " po wzbudzeniu UV emituje
fluorescencję w świetle
" DAPI
widzialnym
" SYBR@Green
" intensywność fluorescencji jest
" EtBr - bromek etydyny proporcjonalna do ilość DNA
Efekt hiperchromowy
" denaturacja DNA- zniszczenie wiazań
niekowalencyjnych
" wzrost absorbcji promieniowania UV
" temperatura topnienia Tm
Barwne reakcje składników kwasów
nukleinowych
-opierają się na reakcjach charakterystycznych składników kwasów
nukleinowych uwalnianych w wyniku hydrolizy ( kwaśne pH, podwyższona
temperatura)
" Oznaczanie DNA oparte na reakcji deoksyrybozy z difenyloaminÄ… w
środowisku kwaśnym- niebieski produkt =600nm (próba Dishiego)
" Oznaczanie RNA oparte na reakcji rybozy z orcynolem- zielony produkt
=660nm
Próba Dishiego
Wykrywanie RNA metodÄ… orcynowÄ…
Dziękuję za uwagę
W sali  VIII W kolokwium piszÄ… grupy
" 2a
" 2b
" 3b
" 4a