plik


��wykBad 2 BIOCHEMIA 9.X.2000 TEMAT:BIOCHEMIA KWAS�W NUKLEINOWYCH Dzisiaj na temat metodologii badania badania genomu, ograniczymy si do metod stosowanych w sp�Bczesnej diagnostyce. przypominam ,|e ostatnio zakoDczyli[my na etapie transkrypcji a teraz przejdziemy do translacji.Zreplikowali[my DNA i poddali[my go transkrypcji i podali[my go obr�bce posttranskrypcyjnej prowadzocej metod splicingu powstania transkryptu i dzi[ nasz traskrypt opu[ciB jdro znalazB si w cytoplazmie ,wszedB na rybosomy -zaczyna si pierwsza ... tym po[rednikiem jest aminoacylo-tRNA, czyli tRNA z poBczonym z nim aminokwasem.To s czsteczki niewielkie liczce ok. 80 nukleotyd�w, kt�re cechuj si zar�wno wystpowaniem miejsc dwuniciowych z obecnymi sparowaniami, oraz 4 sekwencji jednoniciowych-niewa|ne jest ich funkcja, wa|ne |e wystpuj tutaj zmodyfikowane zasad:dihydrourydyna,w ptli T Psi C wystpuje rybotymidyna,chodz wiadomo, |e tymina nie wystpuje w RNA i modyfikacje o kt�rych wspominaBem wystpuj na drodze modyfikacji posttranskrypcyjnej tRNA.NAjisotniejsze z punktu widzenia procesu, kt�rym si zajmujemy jest ptala antykodonowa,kt�ra asocjuje z odpowiednim kodonem znajdujcym si w mRNA.Na 3' koDcu czsteczki tRNA nastpuje przyBczenie aminokwasu.Aminokwas przyBczony jest do grupy hydroksylowej adeniny swoj grup karboksylow i ta struktura nosi nazw aminoacylo- tRNA.W takiej formie aminokas zd|a na rybosom aby w konsekwencji procesu translacji tworzy BaDcuch polipeptydowy.Ale to nie jedyna funkcja tego tRNA, posiada tych funkcji znacznie wicej opr�cz rybosomalnej produkcji biaBka .U organizm�w, kt�re dysponuj [cian kom�rkow,a wic u ro[lin oaz organizm�w prokariotycznych tRNA bierze udziaB w syntezie [ciany kom�rkowej .U organizm�w, kt�re wytwarzaj chlorofil jest zanga|owany w biosyntez chlorofilu.Dalej bierze udziaB w syntezie fosfoguanozyny.Bierze udziaB w transporcie aminokwas�w .U bakterii gramujemnych bierze udziaB w syntezie glikopolisachoryd�w,kt�re s endotoksynami bakterii. Bierze udziaB w degradacji biaBek oraz ostni funkcj -niezwykle istotn- jest primerem odwrotnej transkryptazy (polimeraza DNA RNA-zale|na, wic musi mie jaki[ primer, tym primerem s czsteczki tRNA) I wreszcie za pomoc zmutowanych czsteczek tRNA spowodowanych mutacjami w genach kodujcych tRNA mo|liwe jest wystpienie mutacji supresorowej tzn.tRNA mimo napotkania kodonu typu non-sens ,kt�ry ma oznacza koniec translacji nie terminuje tylko przyBcza czst bBdny aminokwas.Takie biaBko powstaBe w wyniku przyBczenia do miejsca kodonu nonsensownego zmutowanego tRNA - tzw.tRNA supresorowego -takie biaBko nosi nazw biaBka supresorowego.Mimo, i| sekwencja aminokwasowa mo|e by odmienna to efekt dla kom�rki jest lepszy ni| w momencie gdy to biaBko wog�le by nie powstaBo, czsto to biaBko nawet po zamianie aminokwasu peBni t sam funkcj, albo funkcja jego jest upo[ledzona , ale to lepsze ni| by tego biaBka nie byBo.Dla naszych dalszych rozwa|aD wa|ne s trzy punkty kontaktowe w czsteczce,mianowicie miejsce A,miejsce P oraz miejsce E.Do miejsca oznaczonego jako A przyBcza si aminoacylo-tRNA z wyjtkiem pierwszego.W miejscu P znajduje si peptydylo-tRNA czyli tRNA z przyBczonym narastajcym peptydem.I wreszcie miejsce E to jest miejsce, kt�re zajmuje peptydylo-tRNA przed wyj[ciem z rybosomu. TRANSLACJA Inicjacja procesu translacji rozpoczyna si od zajcia przez pierwszy aminoacylo-tRNA,kt�rym w przypadku organizm�w eukariotycznych jest metionylo-tRNA,czyli tRNA z przyBczon metionin a w przypadku organizm�w prokariotycznych metionina ulega modyfikacji i powstaje formylometionina i formylometionino-tRNA,ale kodon rozpoznawania jest ten sam, poniewa| kodonu dla formylometioniny nie ma.I ten pierwszy inicjujcy proces translacji aminoacylo- tRNA zajmuje miejsce P, a nie miejsce A.Po zajciu miejsca P do miejsca A przyBcza si kolejny aminoacylo-tRNA.Do akcji wkracza enzym-transferaza peptydylowa-jest to enzym, kt�ry syntetyzuje wizanie peptydowe.I wizanie peptydowe -przypominam,|e poBczone s grup karboksylow aminokwasy z tRNA -wizanie jest stworzone pomidzy grup karboksylow tego narastajcego peptydu, a w przypadku pierwszego aminoacylo-tRNA midzy metionylo-tRNA a grup aminow przyBczonego w pozycj A aminoacylo-tRNA.Z tego wynika, |e narastanie peptydu nastpuje od koDca N w kierunku koDca C,czyli zawsze dawc grupy karboksylowej jest peptydylo-tRNA ( a w przypadku pierwszego metionylo-tRNA ) a dawc grupy aminowej aminokwas, kt�ry znajduje si w miejscu A przyBczonego tRNA .Tak wic w naszym konkretnym przypadku po zadziaBaniu transferazy peptydylowej powstaB nam dipeptyd, zbudowany z metioniny i jakiego[ drugiego aminokwasu, kt�ry okupuje miejsce A rybosomu.Do akcji wkracza translokaza .Translokaza przesuwa nasze w tym przypadku dipeptydylo-tRNA w miejsce P, miejsce A ulega zwolnieniu i tu znowu przyBcza si jaki[ aminoacylo-tRNA do miejsca A, no i nastpuje na podobnej zasadzie wygenerowanie trzeciego aminokwasu, czyli drugiego wizania peptydowego i mamy ju| tripeptyd. W tym czasie zwolniony tRNA przechodzi do miejsca P i w miar jak rybosom si przesuwa, nastpuje opuszczenie rybosomu przez tRNA. I tak wszystko trwa dBugo, a| pojawi si kodon nonsensowny i w�wczas czynniki, kt�re terminuj translacj, odpowiednie grupy biaBek enzymatycznych i nieenzymatycznych, doprowadzaj do odBczenia si powstaBego peptydu od rybosomu . No i teraz wiedzc jak ten proces przebiega przyjrzymy si substancjom, kt�re ten proces moduluj. Inhibitory translacji I- Inhibitory inicjacji -Trimetoprim Pamitajc, |e pierwszym aminoacylo-tRNA jest formylometionylo-tRNA, a on powstaje przez przyBczenie grupy formylowej do metionylo-tRNA. Ostatno ju| z tym zwizkiem si spotkali[my - trimetoprim, jest inhibitorem reduktazy kwasu foliowego, czyli trimetoprim uniemo|liwia powstanie FA4, grupa formylowa jako grupa jednowglowa jest przenoszona przez tetrahydrofo- lian, czyli nie mo|e powsta FA4 , przez to nie mo|e powsta formylometionylo- tRNA i u bakterii, bo tylko u nich ten proces si od tego zwizku zaczyna, nie mo|e rozpocz si translacja. II-Inhibitory elongacji -antybiotyki aminoglikozydowe Jest to bardzo szeroko stosowana grupa antybiotyk�w przeciwbakteryjnych, dobrze znane nazwy: >Streptomycyna >Gentamycyna >Neomycyna >Kanamycyna >Tebramycyna One dziaBaj na rybosom bakteryjny, i maj dwa dziaBania : hamowanie inicjacji translacji ( wprawdzie powstaje formylometionylo-tRNA, ale nie mo|e si przyBczy do rybosomu, bo do miejsca P nie mo|e si przyBczy formylometionylo-tRNA) a druga - hamowanie procesu elongacji ( a to w ten spos�b, |e zaburzaj prawidBowe przyBczanie kolejnych aminoacylo-tRNA do rybosomu lub powoduj bBdny odczyt ). -Tetracykliny >Doxycyklina, czy Vibramycyna ( jak kto woli ) Ona hamuje przyBczanie aminoacylo-tRNA do rybosomu, czyli nie mo|e wydBu|a si BaDcuch polipeptydowy. Natomiast nie zaburza procesu inicjacji translacji. - Chloranfenikol - Cykloheksymid S inhiobitorami transferazy peptydylowej. Przyczym chloranfenikol dziaBa na rybosom bakteryjny, a cykloheksymid dziaBa na rybosom eukariotyczny.Chloranfenikol jest bardzo toksycznym antybiotykiem, rzadko obecnie stosowanym, a je[li si go stosuje to gB�wnie w salmonellozach, czyli durze brzusznym oraz w schigellozach, czyli czerwonce bakteryjnej, rzadko stosowany ze wzgldu na toksyczne dziaBanie w stosunku do szpiku kostnego. Natomiast cykloheksymid nie znalazB zastosowania terapeutycznego, natomiast znalazB on zastosowanie jako pewnego rodzaju narzdzie w biochemii kom�rki. To nie jest cytostatyk. -Antybiotyki makrolitowe >Erytromycyna >Dadercyna -Toksyna bBonicza S inhibitorami translokazy, czyli tego enzymu, kt�ry umo|liwia przesunicie peptydylo-tRNA z miejsca A do miejsca P. Antybiotyki makrolitowe dziaBaj na rybosom bakteryjny, natomiast toksyna bBonicza dziaBa na rybosom eukariotyczny. BBonica to jest choroba bakteryjna, wywoBywana przez maczugowca bBonicy, obecnie choroba nie wystpuje dziki szczepieniom ochronnym, kt�re podaje si ju| bardzo maBym niemowltom, natomiast dawniej, rozwuj maczugowca odbywaB si w gardle dajc objawy anginy, czy zapalenia gardBa, natomiast wydzielana przez niego toksyna uszkadzaBa gB�wnie misieD sercowy, na szcz[cie obecnie nie wystpuje. III-Inhibitory terminacji -Puromycyna Jest analogiem tyrozynylo-tRNA, czyli udaje takie tRNA, do kt�rego przyBczona jest tyrozyna. No i jak si pojawia kodon dla tyrozyny, to podje|d|a sobie puromycyna, w to miejsce si wBcza, ale ona nie jest w stanie utworzy wizania peptydowego, czyli na tym etapie biosynteza biaBka staje. No i zsyntetyzowali[my BaDcuch polipeptydowy, kt�ry nastpnym razem bdziemy modyikowa posttranslacyjnie, aby uzyska w peBni funkcjonalne biaBka. Poza bardzo maBymi peptydami, ka|de inne biaBko ulega modyfikacjom, zar�wno modyfikacjom wewntrzkom�rkowym jak i zewntrzkom�rkowym. Metody badania genomu czBowieka Jak wspominaBem, bdziemy si zajmowa tylko metodami Batwymi do zrozumienia, szeroko stosowanymi w praktyce, takimi, kt�rymi my si r�wnie| w zakBadzie zajmujemy, takimi, kt�re poka|emy w czasie wiczeD laboratoryjnych. Genom czBowieka jest trudny do badania, dlaczego: ze wzgldu na jego wielko[ Escherichia coli 4500 gen�w Dro|d|e 6500 gen�w Muszka owocowa 8000 gen�w CzBowiek 80 000 gen�w Dlatego badania, kt�re maj by ladamoment ukoDczone, na poznanie peBnej sekwencji genomu ludzkiego, trwaBy od wielu, wielu lat i byBy obarczone pewnymi trudno[ciami, ze wzgBdu na jego cech i ze wzgldu na trudno[ w pozyskiwaniu. Cech genomu czBowieka : -gsto[ gen�w ( czyli ilo[ gen�w przypadajca na jednostk dBugo[ci DNA, a t jednostk jest ilo[ par zasad - pz.) - geny w mitochondrium upakowane s do[ gsto , bo sam genom jest stosunkowo niedu|y - 10,45 kb ( tys. zasad ) - natomiast w jdrze geny s stosunkowo rozsiane 140 - 45 kb -wielko[ genu ( dBugo[ genu ) 10 - 15 kb -odstpy midzy genowe, czyli tzw. spacer 25 - 30 kb Geny czBowieka s bardzo zr�|nicowanepod wzgldem ilo[ ekson�w. S geny bardzo proste majce jeden ekson, czsto s to geny kodujce np. tRNA. Natomiast najwikszy gen genomu czBowieka posiada 79 ekson�w i jest to gen, kt�rego nazw warto zapamita, to jest gen, kt�ry koduje biaBko o nazwie dystrofina . Natomiast gen jest oznaczony literami DMD, co znaczy dystrofia mi[niowa Duchanne'a, poniewa| mutacje w obrbie tego genu prowadz do pewnej uwarunkowanej gentycznie choroby mi[ni - dystrofia mi[niowa Duchanne'a. -wielko[ eksonu wynosi okoBo 70 pz. i z reguBy zale|y od wielko[ci genu, czyli maBe geny maj maBe eksony, du|e geny maj du|e eksony. Najwikszym znanym eksonem u czBowieka jest ekson 26-sty, wystpujcy w genie kodujcym biaBko ApoB . ApoB, to jest apolipoproteina, czyli biaB- ko wchodzce w skBad lipoprotein osocza i wielko[ tego eksonu wynosi 7,6kb. R�wnie| wielko[ intronu zale|y od wielko[ci genu. Najwikszy intron stwierdza si w genie kodujcym dystrofine. Jego dBugo[ wynosi 30kb, a skoro ju| jeste[my ju| przy genie DMD, jego dBugo[ wynosi 2,5 mln par zasad, czyli jest genem ogromnym.Tutaj mamy pokazany gen insuliny, wielko[ genu 1400 pz.zaledwie 3 egzony. Na przeciwstawnym biegunie mamy gen dystrofii,czyli ten DMD, kt�rego wielko[ wynosi 2,5 mln.pz i kt�ry posiada 79 egzon�w,czyli to pokazuje jak ogromn r�|norodno[ posiada genom czBowieka. Jak zorganizowany jest genom czBowieka? Genom czBowieka mo|na podzieli na dwi gB�wne frakcje,najwa|niejsza to jest genom jdrowy,kt�rym si za chwil szczeg�Bowo zajmiemy ,a druga frakcja to jest genom mitochondrialny-o kt�rym m�wiBem ostatnio.Spo[r�d 80 000 gen�w zaledwie 37-przypominam- wystpuje w genomie mitochondrialnym. Organizacja genomu w kom�rce Genom jdrowy Geny ( 30% ) Pozageny ( 70% ) Eksony ( 10% ) Introny ( 90% ) Unikatowe ( 80% ) Powtarzalne ( 20% ) Zgrupowane Rozproszone Genom pozajdrowy ( mitochondrium ) Patrzc na genom jdrowy to znacznie mniejsz cz[ stanowi fragmenty DNA, kt�re koduj ( szacuje si, |e ok 30% to jest DNA kodujce a ok. 70% materiaBu genetycznego tworzy tzw. pozagenowy DNA ).Teraz przyjrzyjmy si najpierw genom .Sekwencje kodujce zaledwie 10% z tych 30%, natomiast w wikszo[ci s to sekwencje niekodujce, kt�re przez nasz u|ytek mo|my je og�lnie nazwa intronami.Natomiast pozagenowy DNA tworzy dwie zasadnicze frakcje a mianowicie tzw. sekwencje unikatowe, kt�rych jest ok. 80% a 20% stanowi tzw. sekwencje powt�rzone.Zkolei sekwencje powt�rzone dziel si jeszcze na dwie frakcje mianowicie sekwencje zgrupowane i sekwencje rozproszone.Warto pamieta o tym przypomniaBem poprzednio, |e geny czBowieka maj charakter nieciagBy,sekwencje egzonowe s poprzedzielane sekwencjami intronowymi poza kilkoma wyjtkowymi mianowicie geny cigBe spotykamy w mitochondrium ,geny cigBe koduj histony.Wiekszo[ maBych gen�w kodujacych czsteczki tRNA r�wnie| maj charakter cigBy, dalej geny niekt�rych receptor�w hormonalnych. Wymienia si , |e nale|y do nich receptor dopaminergiczny typu I ,receptor dopaminergiczny typu V -o nich ju| wicej na biochemi paDstwo ode mnie nie usBysz, natomiast trzeci tu wymieniony receptor dla bradykininy typu II bdzie jak zBy sen si czsto pojawiaB. No i np. takim genem jest gen produkujcy intrferon alfa,o kt�rym wicej powiem przy omawianiu cytokin ukB. immunologicznego.Teraz zajmiemy si sekwencjami, kt�re maj charakter sekwencji powt�rzonych .Pierwsza grupa s to du|e bloki nale|ce do sekwencji zgrupowanych, s to tzw. satelity, czyli satelitarny DNA .Taka jednostka, kt�ra ulega powt�rzeniu liczy od 200- 5 000 pz i one praktycznie nie maj znaczenia w diagnostyce molekularnej, kt�r si zajmujemy i do nich nie bdziemy wraca ,sBu| m.in. do identyfikacji chromosom�w.Natomiast nas interesuj powt�rzenia rozproszone, kt�rymi zainteresowanie datuje si na ok. ostatnie 10 lat , s to tzw. mini- i mikro-satelity.Co to s minisatelity? One pojawiaja si z czsto[ci 2-400 , jenostka, kt�ra si powtarza to jest od 7 do 100 pz. i one maj znaczenie w diagnostyce molekularnej,natomiast najbardziej ciekaw struktur s mikrosatelity, kt�re obejmuj jednostki powtarzajce si od 1-6 pz ,najintensywniej zgBbiane jest wystpowanie powt�rzeD 3 i 4 nukleotydowych .Jaka jest funkcja mikrosatelit to nikt naprawd nie wie.One wystpuj poza genami , czyli nie koduj biaBka, natomiast razem z genem mog ulec transkrypcji i przypuszcza si, |e jedn z ich funkcji mo|e by stabilizacja transkryptu przed dziaBaniem enzym�w nukleolitycznych, kt�re mogBy by ten transkrypt zdegradowa podczas jego drogi do rybosomu. Metodologi sBu|c do badania mikrosatelit�w jest technika zwana STR ( short tandem repeat) co znaczy kr�tki powt�rzenia tandemowe.W skutek wystpienia jakie[ mutacji w wyniku analizy pojawiajcych si mikrosatelit wzorzec wystpujacy u danego czBowieka mo|e ulec zmianie i badajc dzidziczenie genu razem z ukBadem sprz|eD z tymi mikrosatelitami mo|na wnosi o defekcie genu bez bezpo[redniego badania tego genu-wyBcznie na podstawie rozkBadu sekwencji mikrosatelitarnych,kt�re u pewnych os�b w wyniku mutacji mog zanikn.Poprostu w wyniku mutacji nie pojawi si ta jednostka powt�rzona -to jest oczywiste.Szczeg�lnie jednostk chorobow,w ktorej bada si polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych jest rak jelita grubego rzwijajcy si na podBo|u rodzinnej polipowato[ci.S osoby, kt�re maj pecha i kt�re w wyniku pewnego genu maj caBe jelito grube usiane tysicami polip�w i jest to stan przed rakowy, poniewa| polipy ulegaj transformacji nowotworowej i ryzyko wystpienia takiego nowotworu mo|na oceni na podstawie analizy genotypu a konkretnie wystpowania kr�tkich powt�rzeD tandemowych. Teraz przejdziemy do badania tego DNA, kt�ry koduje.Od zawsze wielkk trudno[ci w badaniu DNA byBo to, |e byBo go w kom�rce maBo-zbyt maBo aby u|y typowe metody chemiczne do analizy .I najbardziej starymi historycznie metodami, chocia| dalej u|ywanymi jest badanie DNA nieamplifikowanego, czyli tyle ile uzyskali[my w kom�rce tyle badamy.Skoro rutynowe techniki badawcze tutaj zawodz to musimy znale[ wzmacniacz,ktory wykrywa dan czsteczke DNA i tutaj musimy uciec si do hybrydyzacji i do struktury zwan sond molekularn .Sonda molekularna jest znakowana,zjwisko kt�re pokazaBem nosi nazw hybrydyzacji , czyli sonda molekularna kiedy napotka komplementarny fragment DNA to na takiej samej zasadzie jak tu wystpuje chocia| by w procesie replikacji nastpuje komplementarne poBczenie z danym naszym DNA.Dawniej znacznikiem byBy gB�wnie izotopy promieniotw�rcze i metod radioautografii nale|aBo przyBo|y klisz fotograficzn i sprawdzi czy dany gen czy fragment genu zostaB wykryty czy te nie. Obecie u|ywane znaczniki s to znaczniki fluorescencyjne , tak|e mo|na bez u|ywania pr.jonizujcego identyfikowa proces hybrydyzacji Znaczny postp rozwoju biologii molekularnej byB mo|liwy dziki zastosowaniu technik, kt�re amplifikuj DNA.Ampllfikowa DNA mo|emy in vivo i taka metoda nosi nazw klonowania ,do tego celu naszymi niewolnikami s bakterie, kt�re tresujemy w taki spos�b,|eby z wBasnym chromosomem bakteryjnym replikowaBy w kolejnych cyklach podziaBowych wprowadzony przez nas DNA w formie wektora plazmidowego.Metoda ta znalazBa zastosowanie gB�wnie w biotechnologii i w produkowaniu enzym�w czy hormon�w.Oszukujemy bakteri i ona poprostu odtwarza nasze DNA.Natomiast calkowity przeBom nastpiB w wyniku wprowadzenia do badaD techniki amplifikacji genu in vitro ,kt�ra powszechnie znana jest metod PCR-reakcja BaDcuchowa polimerazy ( polimerase chain reaction )Ale najpierw zajmiemy si tymi metodami, kt�re dotyczyBy materiaBu niezamplifikowanego.Pierwszy etap,gdzie nastpuje hybrydyzacja z sond molekularn. Dawniej stosowane byBy metody hybrydyzacji w roztworach , ale byBy uci|liwe,wic opracowano metod przenoszenia kwas�w nukleinowych na no[niki staBe.Tym staBym nosnikiem jest nitroceluloza lub nylon .Mo|liwe byBo immobilizowanie materiaBu genetycznego i dziaBanie sond molekularn w fazie staBej i obecnie te metody maj najwiksze zastosowanie.No i wreszcie pie[D ostatnich lat to jest technika FISH ( fluorencens insitu hybrydysation ) czyli hybrydyzacja fluorescencyjna in situ,oznacza to, |e celem przeprowadzenia reakcji hybrydyzacji, nie musimy wog�le izolowa materiaBu genetycznego z kom�rki, tylko majc preparat cytologiczny na szkieBku podstawowym, dziaBamy sond molekularn, ktora na poziomie choromosomu wykrywa nam istniejcy allel lub sekwencj poszukiwan, informuje nas o tym m�wic trywialnie [wiecc Ale teraz szczeg�Bowo zajmiemy si hybrydyzacj immobilizowanego DNA. Technika nosi nazw blottingu.Blotting jest to trasfer DNA na filtr ( nitrocelulozowy albo nylonowy ) i tu nie mog by paDstwu obce trzy pojcia .Mianowicie pierwsze to jest Northern blotting - materialem przez nas poszukiwanym,diagnozowanym jest RNA i RNA jest przenoszone na odpowiedni filtr i nastpuje hybrydyzacja z sond maolekularn kt�r jest DNA znakowany. Skoro mamy mRNA to Batwo zgadn, |e mamy transkrypt a chcemy si dowiedzie czego to jest transkrypt? DoszBo do ekspresji genu zadajmy sobie pytanie jakiego genu ?Takie jest zastosowanie techniki Northern blotting.Technika Southern blotting to jest technika,w kt�rej immobilizujemy na filtrze nitrocelulozowym lub nylonowym DNA i hybrydyzujemy go r�wnie| sond DNA , czyli to badanie nie prowadzimy nie na transkrypcie tylko na genie DNA.Jest to technika szeroko stosowana w identyfikacji osobniczej .No i wreszcie z tymi dwoma pojciami trudno pomin Western blotting, Western blotting nie dotyczy DNA, jest to technika polegajca na przeniesieniu na podBo|e staBe rozdzielonych elektroforetycznie biaBek .Ale na podstawie masy czsteczkowej trudno nam odpowiedzie na pytanie co to za biaBko? Takim jedynym faktycznym sposobem powiedzenia to jest to biaBko to jest zadziaBanie przeciwciaBem monoklonalnym wykrywajcym dan sekwencj aminokwasow dan determinant antygenow i wtedy biaBko nasze jest wykrywane przeciwciaBem przeciwko biaBku ( nie ma tu |adnej hybrydyzacji z sond molekularn ani kwas�w nukleinowych ) I tu mamy nasz technik Southern blotting , mamy wysoko czsteczkowy DNA, kt�ry wyizowali[my np. z krwi obwodowej , nastpnie trawimy je endonukleazami i dokonujemy rozdziaBu elektroforetycznego, nastpnie przenosimy przy u|yciu specjalnego urzdzenia do trasferu na nitroceluloze albo na nylon i dziaBamy sond molekularn w takim piecu hybrydyzacyjnym -tak nazywa si to urzdzenie, ulega to mieleniu przez kilka do kilkunastu godzin i nastpnie uzyskujemy wz�r autoradiograficzny.Pr|ki powstaBe s to pr|ki gdzie nastpiBa hybrydyzacja,czyli je[li mamy jaki[ marker ,kt�ry wykrywamy i mamy dla nigo komplementarn sond molekularn tylko wtedy kiedy on wystpuje sonda go rozpoznaje.Je[li nastpiBa mutacja to sekwencja nukleotydowa jest inna ,w�wczas sonda molekularna z takim fragmentem si nie Bczy i pr|ka radiograficznego tu nie widzimy.Do dzi[ technika Southern blotting u|ywana jest bardzo czsto w analizie osobniczej jako tzw.DNA fingerprinting ,czyli badanie typu odciskpalca.DNA ulega trawieniu enzymami czsto tncymi, a poniewa| ka|dy z nas r�|ni si od drugiej osoby sekwencjami genotypu to ka|dy ma bardzo charakterystyczny ukBad pr|k�w.A tutaj mamy technik FISH,mamy preparat cytologiczny to nic innego jak chromosomy,podajemy sond znakowan fluorescencyjnym barwnikiem,pozwalamy na hybrydyzacj z chromosomem,nie doprowadzmy do izolowania materiaBu genetycznego,czyli jaka szybko[ pot|na tego typu badania, a nastpnie w mikroskopie fluorescencyjnym patrzymy czy gdzie[ nam [wieci, no i widzimy |e tutaj [wieci to jaki[ marker genetyczny zostaB wykryty. AMPLIFIKACJA DNA Pierwsz metod klonowaniem si nie zajmujemy, celem klonowania jest uzyskanie zamplifikownego caBego fragmentu genu, poniewa| w przeciwieDstwie do techniki PCR fragmenty, kt�re amplifikujemy mag by znacznie wiksze ,mog by nawet do 2 000 000 pz,czyli caBy gen mo|e ulec amplifikowaniu .Natomiast ograniczeniem techniki PCR jest wielko[ amplifikowanego fragmentu DNA, kt�ra nie przekracza 5 000 pz.( 5 kb) No i jest tu pokazane |e musimy nasz DNA wstwi w plzmid, nastpnie plazmid wstawi w bakteri, bakteria podczas kolejnych podziaB�w odtwarza nasz plazmid z zawartym tam genem i nastpnie wycigamy to z bakterii u[miercajc j, ale on jest takim swoistym perpetum mobile i po oczyszczeniu wyprodukowanego biaBka mamy gotow insulin, albo hormon wzrostu.Natomiast w laboratorium i to dzisiaj zobaczycie wykonujemy badanie zwane amplifikacj genu in vitro , czyli technik PCR. Do PCR-u nie potrzebujemy |adnych wielkich skomplikowanych urzdzeD, caBe urzdzenie jest wielko[ci tego rzutnika i nosi nazw termocyklera albo termoblocku i w tym naszym ukBadzie in vitro odtwarzamy dokBadnie to co zachodzi podczas replikacji DNA w kom�rce, czyli sprawa jest genialnie prosta ,a poniewa| jest genialnie prosta w 19993 k.Bullis otrzymaB nagrod Nobla.Technika PCR: najpierw musimy wyizolowa DNA ( wystarczy DNA z jednej kom�rki ) w przeciwieDstwie do technik hybrydyzacyjnych mo|emy miec od 50-100 razy mniej DNA |eby to badanie wykona...i dokBadnie sam tylko za po[rednictwem enzym�w.Natomiast my do tego celu wykorzystujemy temperatur.Nastpnie do naszego wyizolowanego DNA -musimy wiedzie co chcemy amplifikowa, czyli musimy zna sekwencj nukleotyd�w w analizowanym fragmencie -mianowicie je[li mamy dwie nici DNA odpowiednio spolaryzowane -tak bdzie powstawaBa nowa ni od koDca 5'-to ona musi od kt�rego[ miejsca zacz i my musimy wprowadzi rodzj primera , to s kawaBki skBadajce si z kilkunastu kawaBk�w no do 30 nukleotyd�w, ale po to aby si one nam w tym miejscu przyBczyBy do matrycy ...czyli ograniczajc amplifikowany DNA . Ona musi mie jak Batwo zgadn woln grup 3' , bo inaczej nie mogBa by tu dziaBa polimeraza DNA ,czyli powoli znajdujemy co do tej zupy musimy wrzuci .Musimy wrzuci matrycowy DNA ktory ulegB denaturacji, nastpnie wrzucamy startery,jak Batwo zgadn musimy mie dwa, bo zr�wno sekwencja na jednej flance jak i na drugiej jest odmienna,czyli mamy dwa startery. Nastpnie musimy mie enzym, kt�ry to wszystko bdzie robiB, czyli polimeraz DNA no i wresz-cie musimy mie cegieBki, z kt�rych to wszystko jest zbudowane, czyli musimy mie tr�jfoforany dezoksyrybonukleotyd�w ( dNTP ); Odpowiedni bufor; polimeraza; startery; matryca; -to jest przepis na nasz zup, a naszym garnkiem s prob�wki. No i w kolejnych etapach po zwizaniu starter�w nastpuje zwielokronienie naszego analizowanego DNA, kt�ry mo|emy technik elektrofortyczn wykry no a bardziej wyrafinowanym sposobem jest stosowanie u|dzenia, kt�re nam mierzy ile zamplifikowali[my DNA. Reakcja przebiega w nastpujcych etapach: -denaturacja, kt�ra zachodzi w 95oC, dla konkretnej reakcji jest ona konkretnie dobierana,ale z reguBy jest to ta temperatura, kiedy nici si od siebie oddzielaj -nastpnie temperatur obni|amy, do jakiej za chwil powiem, aby doBcza startery, i to Bczenie starter�w nosi nazw annealing (czytaj aniling). Ka|dy DNA ma okre[lon temperatur topnienia, kt�r oznaczamy Tm i temperatura annealingu jest dobierana dla ka|dego ukBadu eksperymentalnie lub na podstawie pewnych kalkulacji i wynosi o 50 mniej w stosunku doTm. Je[li temperatura jest zbyt niska nastpuje nieswoiste przyBczanie r�|nych nukleotyd�w, a nie tych, na kt�rych by nam zale|aBo. -po przyBczeniu starter�w nastpuje podwy|szenie temperatury i w tej temperaturze zaczyna dziaBa polimeraza DNA, kt�ra wydBu|a BaDcuch. No i reakcja zaczyna przebiega od pocztku, podwy|szenie tem. , denaturacja, itd ok. 25-35 razy co zajmuje ok. 3 h . Nastpnie urzdzenie mo|na zostawi na noc , schBadza nasz preparat do tem. 40C. Ta temperatura denaturacji ( Tm ) zale|y od : -dBugo[ci BaDcucha, im BaDcuch dBu|szy, tym trzeba przyBo|y wicej energii |eby go zdenaturowa -skBad zasad, czyli odsetkowego % par G-C, kt�re s zBczone 3 wizaniami wodorowymi, a para A-T dwoma, czyli trzeba wicej energii do denaturacji -[rodowiska chemicznego. GB�wnym czynnikiem stabilizujcym s jony sodu, natomiast gB�wnym czynnikiem destabilizujcym s czynniki denaturujce, czyli najcz[ciej u|ywany jest mocznik Jakie jest gB�wne ograniczenie tej metody: -no opr�cz trgo, |e musimy zna sekwencje genu, a wBa[ciwie flankujce, a tego w klonowaniu nie potrzebujemy zna -drugim ograniczeniem jest wielko[, jak powiedziaBem nie mo|e przekracza 5 tys. zasad -trzecim ograniczeniem jest to, |e ta polimeraza popeBnia bBdy. Po 20 obrotach reakcji PCR, w 40% zawartych tam zamplifikowanych odcink�w DNA s bBdy. Dlaczego tam s bBdy. Ot�rz polimerazy DNA poza dwoma tu wymienionymi, kt�re u|ywane s w PCR, nie posiadaj aktywno[ci 3' - 5' nukleazy, czyli nie maj tego fragmentu, kt�ry w polimerazie bakteryjnej, czy w somatycznych kom�rkach eukariota, sprawdza, czy nukleotyd zostaB wbudowany w spos�b prawidBowy. Ale poniewa| w pozostaBych czsteczka DNA wbudowanie nieprawidBowego nukleotydu nastpuje w spos�b losowy, a nie zawsze w tym samym miejscu - nieprawidBowego, dlatego w dalszej analizie sekwencyjnej nie ma to wikszego znaczenia. Ale prosz o tych pomyBkach pamita.Najbardziej historyczn polimeraz w reakcji PCR byB fragment Klenova poli- merazy DNA I , ale ten enzym ma to ograniczenie, |e jest enzymem termolabilnym. A poniewa| reakcje przeprowadzamy w zmiennej temperaturze, dochodzcej do 950C, to z czasem dochodziBo do denaturacji enzymu i nale|aBo wlewa kolejne jego porcje, co znacznie podra|aBo jego badanie. Wic przypomniano sobie, |e s organizmy, kt�re lubi wysok temperatur, |yjce w ciepBych zr�dBach, geizerach. I wykryto Thermus aquaticus, kt�ra cechuje si wystpowaniem polimerazy termicznie stabilnej i std u|ywanie w PCR polimerazy Taq . Inne polimeraza u|ywane s rzadko, ze wzgldu na to, |e s kosztowne, np. Vent i Pfu, kt�re maj aktywno[ 3' 5' nukleazow, czyli spraw- dzaj, czy prawidBowo wBczyBy nukleotyd do wydBu|anej nici. Natomiast korzy[ci ze stosowania polimerazy Bst jest mo|liwo[ amplifikacji bardzo dBugich fragment�w dochodzcych do 7 tys. par zasad. Czyli je[li wybieramy jaki[ fragment genu, kt�ry musi ulec amplifikacji i jest dBugi, wtedy uciekamy si do takiej polimerazy. A co robimy, je[li nie mamy pienidzy na polimeraz Bst, a materiaB, kt�ry mamy analizowa dalej jest dBugi, to wtedy amplifikujemy poszczeg�lne fragmenty genu, ale tak wybieramy , |eby poszczeg�lne fragmenty zachodziBy na siebie, je[li mamy amplifikowa bardzo du|y gen do badaD, oczywi[cie nie do techniki in|ynierii genetycznej, bo do tego u|ywamy klonowania.Jakie jest zastosowanie techniki PCR: - wykrywanie mutacji i tym si zajmiemy przedewszystkim. Metody u|ywane w wykrywaniu mutacji dzielimy na : > metody Screening-owe, kt�re maj odpowiedzie na pytanie : czy w analizowanym genie wystpiBa mutacja ?. W przypadku pozytywnej odpowiedzi na to pytanie zadajemy drugie : Na czym ta mutacja polega ? Czyli j identifikujemy, a je[li ju| j zidentyfikujemy i okazuje si , |e ona czsto wsp�Bistnieje, ta konkretna mutacja, ze znan chorob genetyczn to ustalamy dalsz metodologie dla wyszukiwania taniego i szybkiego tej konkretnej mutacji w caBej populacji. Wtedy jak ju| wiemy na czym polega, nie rozpoznajemy u ka|dego pacjenta, czyli nie rozpoczynamy od screeningu, tylko wprost wykonujemy metod na wykrywanie tej konkretnej mutacji. Metody, kt�re maj zastosowanie w diagnostyce mutacji : 1.PCR - HD 2.PCR - SSCP 3.PCR - DGGE To s metody, kt�re paDstwa obowizuj i jeszcze dwie, na temat kt�rych nic nie powiem, bo to jest dla ultra zainteresowanych. I wreszcie obowizuje paDstwa metodologia Sekwencjonowania DNA. 1. PCR - HD czyli PCR heterodupleks Po reakcji PCR, doprowadzamy do denaturacji produktu PCR. A nastpnie doprowadzamy do renaturacji. Nici Bcz si ze sob na chybiB - trafiB w spos�b losowy. Co si dzieje, je|eli osoba jest heterozygot, czyli w jednym genie wystpiBa mutacja, to w�wczas mo|emy mie takie mo|liwo[ci -albo poBcz si dwie nici prawidBowe -albo poBcz si dwie nici zmutowane -albo poBczy nam si jedna ni prawidBowa i jedna ni zmutowana - to nazywamy hetrodupleksem Nastpnie poddajemy nasz mieszanine kombinacji - elektroforezie. W elektroforezie obserwuje- my, |e heterodupleksy s najbardziej leniwe i najwolniej migruj w polu elektrycznym. Ograniczenia metody : -je[li fragmenty maj poni|ej 200pz to skuteczno[ metody ulega obni|eniu, przy dBugo[ci fragment�w do 200pz skuteczno[ metody wynosi 95 % -wykrywa mutacje punktowe, dlaczego jest to takie wa|ne. Gdyby[my w przypadku mutacji punktowych wyizolowali DNA i badali wyBcznie technik elektroforezy, to zmiany w masie czsteczkowej analizowanego preparatu s tak maBe, |e nie jeste[my wykry zmian w ruchliwo[ci elektroforetycznej. -nie okre[la nam, w kt�rym miejscu wystpiBa mutacja, bo odpowiada na pytanie czy wystpiBa . 2.PCR - SSCP czyli single strended comformation polimorfism. Polimorfizm fragment�w jedno- niciowych.To samo mamy zamplifikowany produkt, poddajemy go denaturacji, czyli uzyskujemy fragmenty jednoniciowe a nastpnie fragmenty jednoniciowe rozdzielamy elektroforetycznie, w warunkach |elu niedenaturujcego. Dlaczego jest to takie istotne ? Nasze fragmenty jednoniciwe w warunkach niedenaturujcych mog wykazywa pewne wewntrzne sparowania. Przyjm tak ciekaw konformacj. Je|eli nastpi tu w kt�rym[ miejscu mutacja, ten konformer przyjmie inny ksztaBt ni| wszystkie pozostaBe, w zwizku z czym w warunkach |elu niedenaturujcego jego ruch-liwo[ elektroforetyczna bdzie zale|aBa od dwuch czynnik�w : jego masy czsteczkowej i od jego konformacji przestrzennej. Je|eli zastosowaliby[my |el denaturujcy np. z dodatkiem mocznika to w�wczas nastpi zarwanie tych wizaD wewntrznych i jedynie ruchliwo[ elektroforetyczna bdzie zale|aBa od masy czsteczkowej, a ta w przypadku mutacji punktowych ulega bardzo niewielkim zmianom. Je[li ulega wypadniciu du|a cz[ naszego genu to wpBywa znacznie na zmian masy czsteczkowej, to do |adnej z tych metod nie musimy si ucieka tylko dokonujemy zwykBej elektroforezy, bo wtedy r�|nica w ruchliwo[ci jest widoczna "goBym okiem" i z tak najprostsz technik r�wnie| si na wiczeniach zapoznacie : jest to badanie polimorfizmu genu konwertujcego, czyli AC. Mniejwicej wBa[ciwo[ci podobne do HD: -analiza fragmentu do 200pz -wykrywa mutacje punktowe -nie wykrywa miejsca mutacji 3. PCR - DGGE czyli Denaturating gradient gel elktroforesis, czyli elektroforeza w gradiencie czynnika denaturujcego. Fragmenty dwuniciowe rozdzielamy elektroforetycznie, a w |elu wytwarzamy gradient albo chemiczny albo temperaturowy. Nasz fragment dwuniciowy wdruje tak dBugo dopuki nie trafi na takie st|enie czynnika denaturujcego, kt�ry sprawia, |e nici denaturuj, czyli si oddzielaj i wtedy fragment dalej ju| nie wdruje. Je[li nastpiBa mutacja punktowa powoduje to, |e miejsce wdrowania nastpuje do innego punktu, ni| si to dzieje w przypadku gdy mutacji nie ma .Jest trudniejsza do wykonania, ale ma tak sam warto[ jak wcze[niej opisane. I tu jeszcze nasze pozostaBe dwie metody 4.PCR - CCM, czyli chemical cleaning of mishmashes, czyli chemiczne trawienie miejsc zmuto- wanych. kosztowna i nie powszechnie u|ywana, a jej zalet s dwie rzeczy, po pierwsze mo|na analizowa znacznie wiksze fragmenty do 1000pz, i mo|na si zorientowa, w kt�rym miejscu nastpiBa mutacja. Je|eli nastpiBa w jakim[ miejscu mutacja, chemicznie mo|na to miejsce odpowiednio modyfikowa, i albo chemicznie, albo enzymatycznie, w tym miejscu nasz powstaBy DNA strawi . I lokalizujc w elektroforezie, wiedzc jaka jest ruchliwo[ elektroforetyczna frag-ment�w mo|na dowie[, w kt�rym miejscu nastpiBa mutacja, w nastpstwie kt�rej doszBo do strawienia DNA w tym miejscu naszego analizowanego genu. 5.PTT, czyli Protein truncation test . Niezbyt popularna ze wzgldu na cen i to, |e jest jeszcze w fazie eksperymentu. Jest to metoda, kt�ra wykrywa biaBka niekompletnie zsyntetyzowane, w skutek wystpienia w DNA mutacji nonsensownej. Metoda jest intelektualnie interesujca, bowiem nasz wyizolowany DNA, przepuszcza si w kom�rce w ukBadzie in vitro przez syntetyczny ukBad transkrypcyjno-translacyjny. W wyniku tego uzyskujemy w ukBadzie in vitro - biaBko . I analizujc to biaBko pod wzgldem jego masy czsteczkowej, determinant antygenowych mo|emy stwierdzi, czy zaburzenia w produkcji biaBka s wynikiem oddziaBywaD supresorowych ( mutacja nonsen-sowna ) czy te| nie. Metoda kosztowna maBo stosowana No i wreszcie jak ju| odkryjemy, |e gdzie[ nastpiBa mutacja tylko jeszcze nie wiemy jaka, to kolejn rzecz jak musimy ustali to jest, w kt�rym miejscu nastpiBa.Czyli DNA musimy podda sekwencjonowaniu . Isniej dwie metody : 1.Metoda chemiczna Maxama - Gilberta - rzadko stosowana, 2.Metoda Sangera zwana inaczej Dideoxy . Dlaczego si tak nazywa. Do naszego ukBadu reagu-jcego wprowadzamy takie oszukaDcze nukleotydy. To s nukleotydy, z kt�rych usuwamy grup hydroksylow z 3 atomu dezoksyrybozy , a wiemy, |e polimeraza musi mie woln grup 3' OH dla wytworzenia wizania fosfodiestrowego. Czyli po wprowadzeniu takiego faBszywego nukleotydu, nastpuje terminacja replikacji. Proces prowadzimy w sekwenatorach, urzdzenia do sekwencjonowania DNA wBa[nie tak si nazywaj. I z reguBy aparaty te pracuj w takim systemie, |e na 4 [cie|kach, mamy cztery niezale|ne elektroforezy. A przedtem zanim do tych [cie|ek dojdzie, mamy cztery niezale|ne PCR robione. W ka|dym z tych czterech PCR-�w inny nukleo-tyd jest zmodyfikowany. W reakcji zwanej A - wprowadzona jest adenina dideoxy (ddA ) na inn [cie|k ddC i dalej tymina ( ddT ) i guanina ( ddG) . W momenci, w kt�rym polimeraza chce wbudowa taki nukleotyd nastpny nie jest ju| wbudowywany, poniewa| nie ma grupy 3' i repli-kacja staje. W wyniku elektroforetycznego rozdziaBu te znakowane, zmodyfikowane nukleotydy mog by znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i tak najcz[ciej jest, detektor laserowy ustawia nam sekwencje pokolei doBczanych nukleotyd�w, kt�r odczytujemy za pomoc software-u np. wydrukowane na drukarce. I teraz mo|emy nasz odczyt por�wna z tzw. bibliote- k gen�w, czyli z genami prawidBowymi szczepu dzikiego. No i teraz tak . Wiemy na czym polega mutacja i mamy 1000 os�b do przebadania na obecno[ tej mutacji i tu u|ywamy ju| innych technik. I znowu kilka metod: 1.PCR-RFLP, czyli PCR sprz|ony z polimorfizmem dBugo[ci frament�w restrykcyjnych 2.PCR-ASO 3.PCR-ARMS 4.OLA 1 i 2 maj najwiksze znaczenie 1.PCR-RFLP. Ko|ysta z enzym�w restrykcyjnych tzw. endonukleaz restrykcyjnych, kt�re pozyskiwane s z kom�rek bakteryjnych i one wystpuj u bakterii. W chwili obecnej znanych jest kilka tysicy endonukleaz, ale u|ywanych jest zaledwie kilkaset. Dlaczego ? Poniewa| niekt�re, rzadko wystpujce sekwencje, s trawione przez tak unikalne enzymy, |e koszt ich zastosowania, wychodowania odpowiedniego szczepu bakterii, wielokrotnie przekracza sens analizy genetycznej. I to jest jedyne, aczkolwiek istotne ograniczenie. Praktycznie ka|da sekwencja DNA ma swoj endonukleaz, kt�ra j trawi. Dlaczego one nie trawi wBasnego DNA. Poniewa| ich DNA jest zmodyfikowane przy u|yciu enzym�w zwanych metylazami . A normalna funkcja, bo kto[ zapyta po co one wBa[ciwie s w tych kom�rkach bakteryjnych, no przecie| nie po to, |eby[my si nimi bawili w zakresie biologii molekularnej. One chroni DNA kom�rki bakteryjnej przed atakiem bakteriofag�w. Dany bakteriofag, kt�ry ma szczeg�ln predylekcj do infekowania kom�rki bakteryjnej, kom�rka bakteryjna ma na niego or| w postaci endonukleazy restrykcyjnej, jak tam si pojawia to w Beb dostaje tak endonukleaz, bo jego DNA zostaje obrucone w niwecz. One nie trawi DNA jakkolwiek. One trawi w tzw. miejscach palindromowych, czyli o podw�jnej odwr�conej symetrii i co wa|ne trawi obydwie nici . Nazwa ka|dej z nich utworzona jest od nazwy gatunku bakterii, w kt�rym dana endonukleaza zostaBa znaleziona Eco R1 - Escherichia coli szczep R enzym pierwszy. Obok s zawsze podawane sekwencje, kt�re s rozpoznawane i trawione, i jak wiemy, w kt�rym miejscu nastpiBa mutacja, nastpnie bierzemy katalog, patrzymy za ile pienidzy mo|na tak endonukleaz przysBa. Endonukleazy albo s w roztworze albo w formie liofilizowanej. No i ka|da ma swoj specyfikacj : w jakiej tem. trawii, itp. W wyniku tra-wienia endonukleazami powstaj tzw. fragmenty restrykcyjne , kt�re rozdzielane elektrofore-tycznie daj obraz charakterystyczny dla danego genu. Inny obraz da DNA zmutowany a inny zdrowy, bo w wyniku dziaBania mutagenu jedne miejsca restrykcyjne mog zanikn a inne si pojawi. Je[li wiemy na czym mutacja polega to mo|emy wybra tak endonukleaz, kt�ra wBa[nie miejsce zmutowane bdzie nam cieBa. A w innym przypadku wybieramy tak, kt�ra w wyniku mutacji straci swoj sekwencj palindromow. Miejsce cicia endonukleaz mo|e przechodzi albo przez o[ symetrii takiej sekwencji palindromowej i powstaj w�wczas koDce tpe no i wreszcie kiedy to jest w pewnym oddaleniu od tej osi symetrii to powstaj koDce lepkie , czyli kohezyjne. Zar�wno do rearan|acji gen�w mo|emy u|ywa koDc�w tpych jak i lepkich. Te tpe najpierw musimy specjalnie zmodyfikowa, ale najBatwiej postpi jest z koDcami lepkimi, bo wtedy z innym genem mo|na to przylepi i zmontowa. ATCTGCAT TAGACGTA Stara prawidBowa ni DNA ( pozbawiona palindromu - restryktaza j mija ) Sekwencja po mutacji punktowej ( powstaB palindrom, kt�ry restryktaza rozpoznaje ) ATCGGCAT TAGCCGTA No i sprawa jest bardzo prosta wyizolowany allel po amplifikacji ( PCR-RFLP) poddajemy trawieniu endonukleaz, je[li endo. miejsca nierozpoznaB to znaczy, |e jest wszystko w porzdku uzyskujemy jednolity obraz pr|k�w . Elektroforeza 200 zasad 200 200 zasad 1. Sytuacja, w kt�rej restryktaza nie przcieBa nici 1.Sytuacja prawidBowa 70 zasad 130 zasad 130 zasad 70 zasad 70 130 200 cieDcie w sekwencji palindromowej 2.NastpiBo przecicie nici. 2.Sytuacja patologiczna 2.PCR-ASO - allel specyfic oligonukleotyde. Mamy dwa allele, jeden dziki i drugi zmutowany. Nasze podej[cie mo|e by dwojakie mo|emy hybrydyzowa: nasz zamplifikowany materiaB albo sond molekularn, czyli oligonukleotydem specyficznym dla allelu albo dzikiego, albo allelu zmutowanego. Tak dobieramy dBugo[ allelu, |e w przypadku gdy trafi na miejsce o niekomple- mentarnej sekwencji w�wczas nie hybrydyzuje. Szczeg�lnie dobre s takie miejsca, kt�re wypadaj w [rodku naszego oligonukleotydu, bo wywoBuj sytuacj w kt�rej nastpuje szypkie oddysocjowanie naszego oligonukleotydu i on nie wykrywa naszego miejsca zmutowanego. No je[li miejsce zostanie rozpoznane prawidBow to jest jaki[ marker radioaktywny lub fluororescen- cyjny i w ten spos�b stwierdzamy, czy miejsce zmutowane wystpuje czy nie. 3.ARMS- amplification refractory mutation system, czyli mutacja prowadzi do niemo|no[ci wy- konania PCR-u.Wobrazmy sobie, |e tu mamy miejsce prawidBowe i nastpuje prawidBowy przebieg PCR-u. Natomiast je[li nastpiBa mutacja, to w�wczas stosowany dla danego allelu specyficzny starter tego miejsca nie rozpoznaje, zwizjku z tym nie ma amplifikacji. Czyli wybieramy miejsce znajdujce si w miejscu wizania starteru, czyli w sekwencjach flankujcych. Czyli tak dobieramy startery by wykrywaBy tylko jeden z alleli. Wic w tej sytuacji naszym oligonukleotydem jest primer . I rozpoznaje tylko jeden z dw�ch alleli. RozpoznaB prawidBowy zachodzi reakcja PCR, nie rozpoznaB prawidBowego PCR nie zachodzi . 4.OLA- czyli oligonukleotyde ligation assay , czyli ligacja oligonukleotyd�w. Wybieramy dwa fragmenty DNA i nazwijmy je umownie sondami, kt�re musz idealnie komplementowa poszu- kiwane przez nas miejsce - punktow mutacj. One s sprz|one z odpowiednim markerem, np. enzymatycznym i w tym ukBadzie musimy mie enzym ligaz, je[li wszystko nastpuje jak trzeba, nastpuje poBczenie, czyli ligacja tych dw�ch fragment�w oligonukleotydowych i nastpuje sygnaB enzymatyczny i generacja jakiego[ produktu i sygnaB - reakcja zaszBa - wszystko jest OK. Je[li jest mutacja punktowa nie nastpuje ligacja p�Bfragment�w i sygnaBu nie ma. Cele: - wykorzystanie technik identyfikacji pozwala np. na postawienie pacjentowi szybko diagnozy w cigu kilku godzin, a normalnie by wychodowa szczep bakterii z tej pobranej pr�bki potrzeba 6 tygodni -synteza gen�w - klonowanie, PCR synteza gen�w do cel�w przemysBu spo|ywczego, farmaceu- tycznego . To jest produkcja biaBek (enzym�w ), hormon�w i synteza nowych gen�w, kt�rymi mo|emy zastpi geny zdefektowane, albo zdefektowane w spos�b uwarunkowany genetycznie, dziedzicznie albo zmutowanych sporadycznie i to nosi nazw terapii genowej . No i odmian techniki PCR jest technika RT-PCR mo|na j z filozofii dziaBania przyr�wna do Northern Blottingu. Tam r�wnie| mieli[my RNA, kt�re identyfikowali[my za pomoc sondy molekularnej znakowanej, kt�rym DNA, natomiast tu mamy mRNA, kt�ry amplifikujemy, czyli mamy transkrypt, kt�ry amplifikujemy, |eby si dowiedzie skd si wziB ten transkrypt. W tym celu pierwszym etapem jak Batwo zgadn jest odwrotna transkryptaza, a nastpnie uzyskany w ten spos�b DNA amplifikujemy typowo jak to robili[my w reakcji PCR. GENY W ONKOGENEZIE Geny, kt�re bior udziaB w onkogenezie mo|na podzieli na 3 kategorie : 1. Onkogeny, czyli s to takie geny, kt�re stymuluj proliferacj kom�rek, mo|na je przyr�wna do pedaBu gazu w samochodzie. Jak si na taki pedaB gazu naci[nie , albo w tym wypadku zaktywuje taki protoonkogen - kom�rka w spos�b niepochamowany zaczyna proliferowa. 2. Antyonkogeny, czyli drugi rodzaj gen�w, nazywane tak|e genami supresorowymi. I one przy- pominaj hamulec w samochodzie. Normalnie ten hamulec jest zacignity . Kom�rka rusza, czyli samoch�d rusza np. z g�rki i ten hamulec ulegnie uszkodzeniu 3. Mutatorowe . Geny mutatorowe normalnie bior udziaB w naprawie DNA, dbaj o integralno[ genomu. Je[li jedziemy to te| s swego rodzaju hamulcem jeden to np. hamulec rczny a drugi no|ny . Je[li ten hamulec ulegnie uszkodzeniu nastpuje gromadzenie bBd�w w informacji gene-tycznej zawartej w kom�rce i w konsekwencji prowadzi to do rozwoju niekt�rych chor�b nowo-tworowych Zainteresowanie onkogenami spowodowane jest tym, |e ju| w latach 20-tych, stwierdzono, |e niekt�re wirusy mog wywoBywa u zwierzt do[wiadczalnych nowotwory. Takim najpierwej od-krytym genem byB gen Src, kt�ry wywoBuje misaka Russa ( ? ). Tylko retrowirusy, kt�re posiada-j tego rodzaju geny, zwane onkogenami, s w stanie wywoBa transformacj nowotworow kom�rki . Natomiast wirusy, kt�re nie posiadaj tego rodzaju onkogen�w, transformacji nie wy- woBuj np. HIV powoduje niszczenie limfocyt�w LH , ale transformacji nowotworowej nie wywo-Buje. Warunkiem, |eby retrowirus wywoBaB transformacj jest posiadanie onkogenu. Ale jak si przyjrzano bli|ej tym wirusom onkogennym, |e wirusy te posiadaj geny jako |ywo przypominaj-ce te wystpujce u czBowieka. PowstaBa wic koncepcja, |e pradziadek albo prababcia odwiedza-jc kom�rk zwierzcia, na drog sobie zabraBa taki baga| w postaci genu prawidBowego, kt�ry nastpnie w wyniku mutacji ulegB pewnym zmianom. Onkogen nie jest do niczego potrzebny wirusowi . Wirus posiada w swoim genomie geny kodujce jego biaBka, czyli biaBka kapsydu, kwas�w nukleinowych potrzebne do replikacji - odwrotna transkryptaza, natomiast onkogen to ten niepotrzebny baga|. No i z takich wirus�w DNA, kt�re nie posiadaj onkogen�w, bo onko-geny posiadaj jedynie wirusy RNA retrowirusy, mamy takie, kt�re s szczeg�lnie wa|ne dla czBowieka. I to s dwa : >HPV 6, kt�ry wywoBuje raka szyjki macicy >no i mamy wirus Ebschteina-Barra. Wirus ten wywoBuje mononukleoz zakazn w naszej strfie klimatycznej. Ale jest on r�wnie| postrzegany jako czynnik etiologiczny wywoBujcy raka noso- gardzieli. Natomiast u dzieci w Afryce r�wnikowej ten sam wirus wywoBuje zBo[liwego chBoniaka, czyli nowotw�r ukB. chBonnego tzw. chBoniaka Bertita (?). Wszystko zale|y w jaki spos�b asocjuje z genomem gospodarza. Natomiast najwa|niejsze retrowirusy tzw. wirusy ostro trasformujce to s wBa[nie wirusy onkogenne posiadajce onkogeny. I ka|dy z wymienionych tutaj onkogen�w wirusowych ma sw�j odpowiednik w kom�rce gospodarza. U ka|dego z nas takie onkogeny wystpuj. Terminologia: Je|eli to co wystpuje u wirusa nazywamy onkogenem to to co wystpuje w formie prawidBowej mo|na nazwa protoonkogennem. Ale mo|na i m�wi inaczej to co wystpuje w kom�rce jest onkogennem, a to co powoduje rozw�j nowotworu onkogen zaktywowany. Te geny, kt�re znajduj si u wirus�w poprzedzone s literk ''v'' ( v- )czyli virus, natomiast te on-kogeny, kt�re wystpuj u nas poprzedzone s literk ''c'' (c-) czyli cellular , czyli kom�rkowy. Co to s za geny ? S to geny zaanga|owane w r�|ne etapy r�|nicowania, proliferacji kom�rki i odpowiedzi kom�rki na r�|ne sygnaBy, czyli nie s to jakie[ byle jakie geny. Nie s to np. geny kodujce enzymy glikolizy, nie s to enzymy beta-oksydacji zakodowane, ale transfer sygnaBu jak to si mdrze m�wi transdukcja sygnaBu i proliferacji kom�rki. S to na przykBad geny : - kodujce czynniki wzrostu, kt�re reguluj proliferacj kom�rek ( Sis ) - kodujce receptory powierzchniowe dla czynnik�w wzrostu . Bo to, |e jest czynnik wzrostu to jest nic. To tak jakby mie klucz i bdziemy potrzebowa jeszcze zamek - receptor, bo inaczej to nie dziaBa (ERBB - gen receptora powierzchniowego ) - kodujce skBadniki systemu transdukcji ( RAS ) - kodujce czynniki transkrypcyjne, czyli biaBka oddziaBywujce z DNA ( MYC , JUN ) - geny zaaga|owane w kodowanie cyklin oraz CDK, czyli Cyklin-depend kinases , kinazy zale|ne od cyklin (i tutaj mamy onkogen PRADT 1 ).No i co one takiego ciekawego robi ? Taka jest choroba -to s misaki lub biaBaczki -wirusowy onkogen Hau-cis,a on koduje pBytkopochodny czynnik wzrostu PDGF BaDcuch b -onkogen Ras -wywoBuje u szczur�w misaka , czuli nowotw�r tkanek mikkich , u czBowieka koduje jedno z biaBek Ras -onkogen Abl , kt�ry u myszy wywoBuje biaBaczk, u czBowieka koduje kinaz tyrozynoswoist -onkogen Fos-wirusowy, kt�ry wywoBuje misaka ko[ci, u czBowieka zanga|owany w kodowanie kinazy tyrozynoswoistej i czynnik�w transkrypcyjnych Gdyby to prze[ledzi na schemacie kom�rki s to czstki sygnaBowe zaanga|owane w receptory dla czstek sygnaBowych ...

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
6 BUDOWA I FUNKCJE KWASÓW NUKLEINOWYCH
Badanie składników kwasów nukleinowych 11 pdf
Lekcja I Skladniki i struktura kwasow nukleinowych (powtorzenie podstawowych informacji
PORÓWNANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH
IZOLACJA KWASOW NUKLEINOWYCH 13
elektroforeza kwasów nukleinpwych
biochemia kolo nukleinowe
Metody izolacji kwasów nukleinowych
Biochemia wejście kwasy nukleinowe opracowanie
Kwasy nukleinowe
Biochemia zwierząt skrypt UR
Zagadnienia do egzaminu z biochemii 2012
giełda egzaminacyjna z biochemii
egzamin biochemia
Biochemia Ćwiczenia 5

więcej podobnych podstron