Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin
Materiały informacyjne na warsztaty dla
pracowników laboratoriów kontroli GMO
Sfinansowano ze środków UNEP/GEF
W ramach realizacji przez IHAR projektu UNEP/GEF Pt.  Wsparcie krajowych ram bezpieczeństwa
biologicznego w Polsce Nr GFL/2716-02-4531
Radzików - kwiecień 2005
TÅ‚umaczenie:
Dr Anna Linkiewicz
Dr Iwona Wiśniewska
Dr SÅ‚awomir Sowa
1
Analiza próbek spożywczych na zawartość
Genetycznie Modyfikowanych Organizmów
Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA
M. Somma
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 2
Wstęp
Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych jest pierwszym etapem większości
procedur stosowanych w biologii molekularnej jak też we wszystkich technikach
inżynierii genetycznej. Podstawowym celem tego etapu jest uzyskanie czystego
materiału, bez względu na z
ródło jego pochodzenia, z przeznaczeniem na
przeprowadzenie specyficznych analiz przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy
(PCR), w celu wykrycia genetycznych modyfikacji (GM). Jakość i czystość kwasów
nukleinowych jest czynnikiem silnie wpływającym na wynik reakcji PCR. Aby
ograniczyć obecność inhibitorów reakcji PCR, należy użyć właściwą metodę izolacji
kwasów nukleinowych. Lista możliwych inhibitorów reakcji PCR jest przedstawiona w
Tabeli 1. W celu zapobieżenia fałszywie-negatywnym wynikom należy sprawdzić
matrycę. W tym celu trzeba użyć specyficznych próbek dających pozytywny wynik
PCR, w przypadku gdy inhibicja nie ma miejsca. Do tego celu wykorzystuje siÄ™
roślinno-specyficzne (eukariotyczne lub chloroplastowe) lub gatunkowo-specyficzne
analizy PCR.
Tabela 1. Niektóre inhibitory reakcji PCR
Inhibitor Inhibujące stężenie
SDS >0,005%
Fenol >0,2%
Etanol >1%
Izopropanol >1%
Octan sodu >5 mM
Chlorek sodu >25 mM
EDTA >0,5 mM
Hemoglobina >1 mg/ml
Heparyna >0,15 i. m/ml
Mocznik >20 mM
Mieszanina reakcyjna >15%
Istnieje wiele metod izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych. Wybór
najwłaściwszej i najbardziej odpowiedniej metody dla konkretnych wymagań zależy
od:
" Analizowanego kwasu nukleinowego
" Organizm z jakiego przeprowadzamy izolacjÄ™ kwasu nukleinowego
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 3
" Rodzaj materiału z jakiego przeprowadzamy izolację (rodzaj tkanki, organ,
stopień przetworzenia, itd.)
" Oczekiwane rezultaty ( plon, czystość, czas przeznaczony na oczyszczanie)
" Docelowe przeznaczenie (PCR, klonowanie, znakowanie, blotowanie, Real
Time-PCR, synteza cDNA)
Zasady niektórych metod stosowanych obecnie do izolacji i oczyszczania
kwasów nukleinowych przedstawione są w następnych podrozdziałach.
Metody izolacji kwasów nukleinowych
Izolacja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego wymaga
przeprowadzenia lizy komórek, inaktywacji komórkowych nukleaz oraz
oddzielenia izolowanego kwasu nukleinowego od pozostałości komórkowych.
Często idealna procedura lizy komórek jest kompromisem pomiędzy metodą na
tyle inwazyjną, by uszkodzić materiał z którego izolujemy kwas nukleinowy i
jednocześnie na tyle delikatną, by nie zniszczyć materiału genetycznego komórki.
Typowe procedury lizy komórkowej składają się z etapów:
" Mechaniczne uszkodzenia (np. ucieranie, liza hipotoniczna)
" Traktowanie chemiczne (np. liza detergentem, sole chaotropowe, redukcja
tiolowa)
" Trawienie enzymatyczne (np. proteinaza K)
Często w jednym etapie procedury rozrywa się błony komórkowe i inaktywuje
wewnątrzkomórkowe nukleazy. Przykładowo jeden roztwór może zawierać
detergenty rozpuszczające błony komórkowe i silnie chaotropowe sole
inaktywujące wewnątrzkomórkowe enzymy. Po lizie komórek i inaktywacji
nukleaz, pozostałości struktur komórkowych mogą być łatwo usunięte poprzez
filtracjÄ™ czy wytrÄ…canie.
Metody oczyszczania kwasów nukleinowych
Metody oczyszczania kwasów nukleinowych zazwyczaj zawierają kombinację
dwu lub więcej z poniższych technik:
" Izolacja/wytrÄ…canie
" Chromatografia
" Wirowanie
" Rozdział oparty na powinowactwie (affinity separation)
Skrótowy opis tych technik będzie przedstawiony w następnych podrozdziałach
(Zimmerman i in., 1998).
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 4
Izolacja/wytrÄ…canie
Ekstrakcja rozpuszczalnikowa jest często wykorzystywana do eliminacji
zanieczyszczeń kwasów nukleinowych. Przykładowo metoda oparta na ekstrakcji
mieszaninÄ… fenolu i chloroformu jest wykorzystywana do usuwania
zanieczyszczeń białkowych. Wytrącanie przy użyciu izopropanolu czy etanolu jest
stosowane w celu koncentracji kwasów nukleinowych. Jeśli ilość kwasów
nukleinowych jest niewielka, można do mieszaniny dodać obojętny nośnik (inert
carier) np. glikogen w celu zwiększenia efektywności wytrącania. Inne metody
wytrącania kwasów nukleinowych zakładają selektywne wytracanie w wysokich
stężeniach soli (wysalanie = salting out), czy wytrącanie białek poprzez zmiany
pH roztworu.
Chromatografia
Metody oparte na chromatografii mogą wykorzystywać różne techniki rozdziału
jak filtracja w żelu, wymiana jonowa, selektywna adsorpcja, rozdział oparty na
powinowactwie (affinity binding).
Podczas filtracji w żelu wykorzystywana jest porowata struktura cząsteczek żelu i
jej właściwości rozdziału cząsteczek o różnej wielkości. Matriks żelu o
zdefiniowanej wielkości porów umożliwia mniejszym cząsteczkom wniknięcie do
porów na zasadzie dyfuzji, a większe cząsteczki nie wnikają do żelu i są
wymywane w martwej objętości.
W ten sposób cząsteczki są wymywane w kolejności zmniejszającej się masy
molekularnej. Jonowymienna chromatografia jest inną techniką, która
wykorzystuje elektrostatyczne oddziaływania pomiędzy docelową cząsteczką a
grupą funkcyjną wypełnienia kolumny. Kwasy nukleinowe (o silnie negatywnym
ładunku, liniowe polianiony) mogą być wymywane z kolumny jonowymiennnej
przy użyciu prostych buforów solnych. W chromatografii adsorpcyjnej kwasy
wiążą się selektywnie z krzemionką lub szkłem w obecności odpowiednich soli
(np. soli chaotropowych), podczas gdy inne cząsteczki nie wiążą się do tych
substancji. Do elucji kwasów nukleinowych mogą być użyte bufor o niskim
stężeniu soli lub woda i w ten sposób otrzymuje się próbkę, która może być
wykorzystana w dalszych aplikacjach.
Wirowanie
Selektywne wirowanie może być bardzo efektywną metodą oczyszczania kwasów
nukleinowych. Przykładem jest ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu, które
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 5
już od wielu lat jest stosowane do oczyszczania DNA plazmidowego. Wirowanie
często łączone jest z inną metodą. Przykładem może być wirowanie kolumn
chromatograficznych, które łączy filtrację w żelu i wirowanie w celu oczyszczenia
DNA i RNA z mniejszych zanieczyszczeń (soli, nukleotydów, itp.) z wymianą
jonową i selekcją pod względem wielkości cząsteczki, gdzie filtracja w żelu
Å‚Ä…czona jest z wirowaniem w celu oczyszczenia DNA i RNA z mniejszych
zanieczyszczeń (soli, nukleotydów, itp). Niektóre procedury łączą selektywną
adsorpcjÄ™ na matriks chromatograficznej z wymywaniem jednego typu kwasu
nukleinowego o określonej czystości podczas wirowania.
Rozdział oparty na powinowactwie
W ostatnich latach, coraz więcej metod oczyszczania kwasów nukleinowych łączy
immobilizację opartą na powinowactwie (affinity immobilization) z rozdziałem
magnetycznym. Na przykład, poli(A) + mRNA może być wiązane z pokrytymi
streptawidyną namagnesowanymi cząstkami dzięki połączeniu ze znakowanym
biotyną oligo(dT). Kompleks ten może być łatwo usuwany z roztworu (lub
niewiążących się zanieczyszczeń) przy użyciu magnesu. Ta technika w stałej
fazie ułatwia oczyszczanie kwasów nukleinowych, ponieważ zastępuje kilka
etapów wirowania, ekstrakcji i separacji faz, jednoetapowym i szybkim rozdziałem
magnetycznym.
Metoda CTAB
Protokół oparty na wykorzystaniu bromku heksadecylotrimetyloamoniowego
(CTAB) został opracowany przez Murray a i Thompsona w 1980 roku (Murray i
Thompson, 1980) i opisany przez Wagnera i współpracowników w 1987 roku
(Wagner i in., 1987). Metoda ta jest wykorzystywana do izolacji i oczyszczania
DNA z materiału roślinnego i produktów pochodzenia roślinnego. Szczególnie
przydatna jest do usuwania polisacharydów czy polifenolowych zanieczyszczeń,
które mogłyby wpływać na czystość i jakość DNA. Procedura CTAB jest szeroko
wykorzystywana w technikach biologii molekularnej roślin i była sprawdzana w
testach walidacyjnych dotyczÄ…cych detekcji GMO (Lipp i in., 1999; 2001). Istnieje
kilka wariantów tej metody opracowanych dla szerokiego zakresu materiałów
spożywczych nisko i wysoko przetworzonych (Hupfer i in., 1998; Hotzel i in.,
1999; Mayer i in., 1997; Poms i in., 2001).
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 6
Zasady metody CTAB: liza, izolacja i wytrÄ…canie
Komórki roślinne mogą być poddane lizie przy użyciu detergentu jonowego
bromku heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), który tworzy nierozpuszczalny
kompleks z kwasami nukleinowymi w środowisku o niskim zasoleniu. W tych
warunkach polisacharydy, fenole i inne zanieczyszczenia pozostajÄ… w
supernatancie i mogą być usunięte. Kompleks DNA jest rozpuszczany w
roztworze o zwiększonym stężeniu soli i wytrącany etanolem lub izopropanolem.
W tej sekcji przedstawione zostaną zasady 3 etapów izolacji metodą CTAB  lizy
błon komórkowych, izolacji genomowego DNA i wytrącania DNA.
Liza błon komórkowych. Jak wcześniej zaznaczono, pierwszy etap izolacji DNA
obejmuje rozerwanie struktur komórkowych  ściany komórkowej i błony
jądrowej. W tym celu próbka jest homogenizowana i w pierwszej kolejności
traktowana buforem ekstrakcyjnym zawierajÄ…cym EDTA, Tris/HCl i CTAB.
Wszystkie błony biologiczne mają podobną ogólną budowę, i zawierają
cząsteczki tłuszczów i białek utrzymujących się razem przez oddziaływania
niekowalencyjne.
Rysunek 1. Uproszczony schemat budowy błon komórkowych1
Jak wykazano na Rys.1, cząsteczki tłuszczów są zorganizowane w ciągłą
podwójną warstwę w której  rozpuszczone są cząsteczki białek. Cząsteczki
tłuszczów składają się z hydrofilowych fragmentów nazywanych główkami
(heads) i hydrofobowych końcówek zwanych ogonkami (tails). W metodzie CTAB,
lizę błon komórkowych przeprowadza się poprzez przez użycie detergentu
(CTAB) zawartego w buforze ekstrakcyjnym.
1
Rysunki umieszczone na tej i następnych stronach pochodzą z: "Genetic Science Learning Center, University of
Utah, http://gslc.genetics.utah.edu."
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 7
Ze względu na podobną budowę warstwy lipidowej i detergentu, CTAB jako
składnik buforu ekstrakcyjnego pełni funkcję wychwytywania tłuszczów
wchodzących w skład błon komórkowych i błony jądrowej. Mechanizm wiązania
tłuszczów za pomocą detergentu jest przedstawiony na Rys. 2.
Rysunek 2. Wiązanie lipidów
Gdy membrany błony komórkowe wystawione są na działanie buforu
ekstrakcyjnego CTAB detergent zawarty w buforze wiąże tłuszcze i białka,
umożliwiając uwolnienie genomowego DNA, co przedstawiono na Rys. 3. W
określonym stężeniu soli (NaCl), detergent tworzy z kwasami nukleinowymi
nierozpuszczalny kompleks. EDTA jest związkiem chelatującym i między innymi
wiąże magnez. Magnez jest kofaktorem dla DNazy. Poprzez wiązanie jonów Mg
przez EDTA, aktywność DNazy jest znacznie ograniczana. Tris/HCl zapewnia
roztworowi odpowiednią pojemność buforową (niskie lub wysokie pH uszkadza
DNA). Istotne jest, by czas pomiędzy homogenizacja próbki a dodaniem buforu
zawierającego CTAB był jak najkrótszy, ze względu na szybką degradację
kwasów nukleinowych na tym etapie izolacji. Od momentu kiedy błony
komórkowe i błony otaczające organelle (mitochondria, chloroplasty) zostały
rozerwane, rozpoczyna siÄ™ etap oczyszczania DNA.
Rysunek 3. Rozerwanie błon komórkowych i izolacja DNA genomowego
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 8
Izolacja. Na tym etapie polisacharydy, składniki fenolowe, białka i inne elementy
pozostałe po lizie komórki rozpuszczone w fazie wodnej są rozdzielane od
kompleksu CTAB - DNA. Usunięcie polisacharydów jak i składników fenolowych
jest szczególnie ważne ze względu na ich zdolność do inhibowania wielu reakcji
enzymatycznych. Przy niskim stężeniu soli (< 0.5M NaCl) związki
zanieczyszczające DNA nie wytrącają się i mogą być usunięte poprzez ekstrakcję
fazy wodnej chloroformem. Chloroform powoduje denaturacje białek i pozwala na
separację fazy wodnej i fazy organicznej. Zazwyczaj faza wodna jest fazą górną.
Zdarza się jednak, że gdy faza wodna jest gęsta z powodu dużego stężenia soli
(> 0.5 M NaCl), formuje się jako faza dolna. Dodatkowo kwasy nukleinowe będą
przechodziły do fazy organicznej, jeśli pH fazy wodnej będzie inne niż pH 7.8-8.0.
Jeśli jest to potrzebne, ekstrakcja chloroformem przeprowadzana jest dwu lub
trzykrotnie w celu całkowitego usunięcia zanieczyszczeń z fazy wodnej próbki.
Aby uzyskać jak najbardziej wydajną izolację DNA można przeprowadzić re-
ekstrakcję z fazy organicznej za pomocą roztworu wodnego, który jest dodawany
do poprzedniego ekstraktu.
Od chwili, gdy kompleks nukleinowy zostanie oczyszczony, możliwe jest przejście
do ostatniego etapu  wytracania DNA.
WytrÄ…canie. Na tym etapie, kwasy nukleinowe uwalniane sÄ… od detergentu. W
tym celu, faza wodna jest traktowana w pierwszej kolejności roztworem do
wytrącania będącym mieszaniną CTAB i NaCl o podwyższonym stężeniu (> 0.8M
NaCl). Sól jest potrzebna do wytrącania kwasu nukleinowego. Zamiast NaCl
może być stosowany octan sodu, ze względu na jego właściwości buforujące. W
tych warunkach detergent, który lepiej rozpuszcza się w alkoholu niż w wodzie,
może zostać wymyty ze środowiska reakcji, podczas gdy kwas nukleinowy ulega
wytrąceniu. Następujące po tym traktowanie 70% etanolem prowadzi do dalszego
oczyszczenia i odmycia próbki z pozostałości soli.
Oznaczanie ilości DNA metodą spektrofotometryczną
DNA, RNA, oligonukleotydy a nawet mononukleotydy mogą być mierzone
bezpośrednio w roztworze wodnym, w formie rozcieńczonej lub nierozcieńczonej.
Wykonuje się to poprzez pomiar absorpcji A, określanej też jako gęstość
optyczna OD, w świetle ultrafioletowym (czasem też w zakresie światła
widzialnego). Jeśli próbka jest czysta (bez znacznych ilości zanieczyszczeń
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 9
białkowych, fenolowych czy agarozy) spektrofotometryczny pomiar ilości UV
zaabsorbowanego przez zasady w DNA jest prosty i dokładny. Idealne bufory do
tego typu pomiarów mają niskie stężenie jonów (np. bufor TE). Stężenie kwasów
nukleinowych mierzone jest poprzez porównanie pomiaru dla próby ślepej i
adsorpcji przy długości fali 260 nm. Interferencja wynikająca z zanieczyszczeń
próbki może być określana poprzez wyznaczenie współczynnika A260/A280.
Adsorpcja przy długości fali 280 nm jest typowa dla białek, tak więc stosunek
A260/A280 mówi o czystości analizowanej próbki. W przypadku czystego DNA
stosunek ten powinien wynosić około 1.8, podczas gdy dla czystego RNA wahać
się powinien w okolicach 2.0. Absorpcja przy długości fali 230 nm odzwierciedla
zanieczyszczenia pochodzące od węglowodorów, białek, fenoli, czy
komponentów aromatycznych. W wypadku czystych próbek stosunek A260/A230
powinien wynosić około 2.2.
Alternatywna metoda  płytki agarozowe z bromkiem etydyny, jest przydatna jeśli
dysponujemy niewielkimi ilościami DNA. Ilość kwasu nukleinowego w
analizowanych próbkach jest porównywana do szeregu standardów stężeń DNA,
gdzie wyznacznikiem jest fluorescencja w świetle UV emitowana przez bromek
etydyny.
Zasady spektrofotometrycznego pomiaru stężeń DNA
Oznaczenie zawartości substancji rozpuszczonej w roztworze przy użyciu
spektrofotometru polega na przepuszczeniu światła przez roztwór. Aparat pracuje
na prostej zasadzie polegającej na tym, że światło o znanej długości fali
przechodzi przez próbkę a ilość energii transmitowanej przez próbkę jest
mierzona przez fotokomórkę umieszczoną z drugiej strony.
Jak przedstawia Rys. 4, pojedynczy układ spektrofotometryczny zawiera z
ródło
światła, pryzmat, statyw dla próbki i fotokomórkę. Połączone z nimi systemy
elektryczny i mechaniczny pozwalają na kontrolę intensywności iluminacji,
długości światła, oraz na konwersję energii otrzymanej przez fotokomórkę na
zmiany napięcia. Następnie zmiany napięcia przedstawiane są na skali
metrycznej, lub zapisywane przez komputer.
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 10
Rysunek 4. Schemat transmisji światła w spektrofotometrze.
Wszystkie cząsteczki absorbują kwanty energii przy specyficznej długości fali,
dzięki czemu możliwa jest ekstrapolacja stężenia związku w roztworze. Według
prawa Lamberta-Beera istnieje liniowa zależność pomiędzy absorbancją A (także
określaną jako gęstość optyczna OD) a stężeniem makrocząsteczek, która
określana jest następującym wzorem:
A=OD=µlc
Gdzie µ jest molowym współczynnikiem absorpcji, c to stężenie, a l to grubość
warstwy absorbującej (szerokość kuwety). Białka i kwasy nukleinowe pochłaniają
światło w ultrafiolecie, w zakresie fal między 210 i 300 nm. Jak już wyjaśniono,
maksimum absorpcji roztworów DNA i RNA znajduje się przy 260 nm, podczas
gdy maksimum dla roztworów białek znajduje się przy 280 nm. Ponieważ tak
roztwory DNA, jak i RNA częściowo absorbują światło przy długości fali 280 nm, a
roztwory białek częściowo pochłaniają świtało również przy długości fali 260 nm,
stosunek odczytu przy długości fali 260 nm i 280 nm (A260/A280) daje informacje
na temat czystości kwasów nukleinowych. W przypadku dobrej izolacji wartość
A260/A280 dla DNA wynosi 1.8, a dla RNA zbliżona jest do 2.0. Dla warstwy
absorbującej 10mm, przy długości fali 260 nm, absorbcja o wielkości A = 1
odpowiada okoÅ‚o 50 µg/ml dwuniciowego dsDNA, okoÅ‚o 37 µg/ml jednoniciowego
ssDNA, 40 µg/ml RNA i okoÅ‚o 30 µg/ml oligonukleotydów. W próbce mamy do
czynienia z zanieczyszczeniem białkami, jeśli stosunek wartości A260/A280 będzie
niższy niż wartości podane powyżej. Dodatkowo niemożliwe będzie w tym
wypadku dokładne ustalenie ilości DNA w próbce. Należy zaznaczyć, że
zanieczyszczenia próbki DNA przez RNA nie mogą być w sposób jednoznaczny
zidentyfikowane spektrofotometrycznie. Absorbancja przy długości fali 325 nm
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 11
może być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze oraz zanieczyszczeń samej
kuwety.
Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych
Wybór kuwety. Ilość roztworu kwasu nukleinowego, który możemy użyć do
oznaczeń absorbancji A, zależy od pojemności stosowanej kuwetki. Wybór
kuwetki powinien zależeć od przewidywanej ilości DNA, współczynnika
rozcieńczenia próbki i objętości próbki jaką dysponujemy. W większości procedur
stosowanych do analiz GMO, objętość próbki uzyskanej na koniec izolacji waha
siÄ™ od 50 do 100 µl. Do pomiarów spektroskopowych niewielkich objÄ™toÅ›ci
kwasów nukleinowych polecanych jest kilka typów kuwetek o niewielkiej
pojemnoÅ›ci  od 5 do 70 µl.
Nastawienie pomiarów. W celu kalibracji spektrofotometru, ważne jest by:
" Ustalić właściwą wielkość kuwety (grubość warstwy absorbującej)
" Ustalić właściwy współczynnik (zależy czy matrycą jest dsDNA, ssDNA, czy
RNA)
" Wykonać pomiar dla próby ślepej, zawierającej wodę lub bufor w którym
rozpuszczono próbkę (A260 = 0)
" Upewnić się czy ślepa próbka mierzona jest periodycznie
" Wykonać pomiary dla próbek referencyjnych o znanym stężeniu, dla upewnienia
się o dokładności wyników
Pomiary próbek o nieznanym stężeniu. W zależności od pojemności kuwetki,
różne ilości próbki pobierane są do pomiaru DNA (np. dla kuwetki o pojemności
mniejszej niż 0.2 ml, 5 µl roztworu DNA rozcieÅ„cza siÄ™ w 195 µl wody). Po
wykonaniu kalibracji spektrofotometru, do kuwety dodajemy rozcieńczony roztwór
DNA, zatykamy kuwetę i energicznie mieszamy, a następnie mierzymy
absorbancję próbki. W celu zmniejszenia błędu pomiaru wynikającego z
pipetowania, pomiar powinien być powtórzony przynajmniej raz, a do pipetowania
powinno być pobrane przynajmniej 5 µl próbki DNA. Wynik dla A260 mniejszy od
0.02 lub pomiędzy 1 i 1.5 (zależnie od użytego spektrofotometru) nie powinny być
brane pod uwagę ze względu na duży margines błędu.
Stężenie c kwasu nukleinowego w próbce jest mierzone zgodnie z poniższymi
wzorami:
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 12
" Jednoniciowe DNA c(pmol/µl) = A260/0.027
" Dwuniciowe DNA c(pmol/µl) = A260/0.020
" Jednoniciowe RNA c(pmol/µl) = A260/0.025
" Oligonukleotydy c(pmol/µl) = A260100/1.5NA+0.71NC+1.20NG+0.84NT
Gdzie A260 jest absorbancją mierzoną przy długości fali 260 nm
W Tabeli 2 przedstawione sÄ… pomiary absorbancji dla superoczyszczonego DNA
z trzustki cielęcej rozpuszczonej w buforze 1x TNE, przy założeniu, że DNA
referencyjne jest dwuniciowe i jego absorbancja wynosi A260 = 1 dla 50 µg/ml w
kuwetce o grubości warstwy absorpcyjnej 10mm. Stężenie DNA nominalnie
wynosiÅ‚o 25 µg/ml.
DÅ‚ugość fali Absorbancja A260/A280 Stężenie (µg/ml)
325 0.01 - -
280 0.28 - -
260 0.56 2.0 28
230 0.30 - -
Tabela 2. Wartości absorbancji dla superczystego DNA z trzustki cielęcej w
buforze 1x TNE.
Część eksperymentalna
Wyposażenie
UWAGA
Całe wyposażenie użyte do analiz powinno być wysterylizowane przed użyciem,
a wszystkie pozostałości DNA muszą być usunięte. W celu uniknięcia
kontaminacji należy używać końcówek do pipet z barierą przeciw aerozolom, czyli
z filtrem.
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 13
" Instrumenty do pobierania próbek jak skalpel, ostrza do skalpela, moz
dzierz
" A
az
nia wodna lub blok grzejny
" Mikrowirówka
" Pipety
" Worteks
" Probówki 1,5 ml
" Naczynka wagowe
" szpatułki
" Waga z możliwością pomiaru 0,01g
" Pałeczki do mieszania
" Statywy na probówki
" Opcjonalnie  pompa i eksykator do suszenia osadu
Odczynniki
UWAGA
Wszystkie odczynniki chemiczne muszą być przeznaczone do biologii
molekularnej (molecular biology grade). Woda dejonizowana i bufory muszą być
przez użyciem autoklawowane. Wszystkie odczynniki powinny być wolne od DNA
i DNaz.
" Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy (CTAB) CAS 124-03-8
" Chloroform
" Izopropanol
" Na2EDTA CAS 6381-92-6
" Etanol
" NaCl
" Proteinaza K
" RNaza A
" (Tris-HCl) chlorowodorek hydroksymetyloaminometanu
" Sterylna dejonizowana woda
Bufor CTAB
20g/l CTAB 4g
1,4 M NaCl 16.4g
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 14
0,1 M Tris-HCl 3.15g
20 mM Na2EDTA 1.5g
" dodaj 100 ml dejonizowanej wody
" doprowadz
pH do wartości 8.0 z przy użyciu 1M NaOH
" dopełnij do 200 ml i autoklawuj
" bufor przetrzymuj w 4oC najdłużej przez 6 miesięcy
Roztwór do wytrącania CTAB
5g/l CTAB 1g
0,04 M NaCl 0.5g
" dodaj 100 ml dejonizowanej wody
" ustal doprowadz
pH do wartości 8.0 przy użyciu 1M NaOH
" dopełnij do 200 ml i autoklawuj
" bufor przetrzymuj w 4 oC najdłużej przez 6 miesięcy
NaCl 1,2 M
" Rozpuść 7.0 g NaCl w 100 ml dejonizowanej wody
" Autoklawuj i przetrzymuj w temperaturze pokojowej
Roztwór etanolu 70%
Wymieszaj 70 ml czystego etanolu z 30 ml sterylnej dejonizowanej wody
RNaza A 10 mg/ml, przechowuj w -20oC
Proteinaza K 20 mg/ml, przechowuj w -20oC
Procedura
Procedura wymaga sterylnych warunków pracy. Zanieczyszczenia próbek mogą
być eliminowane dzięki użyciu jednorazowego sprzętu i związków
dekontaminujących oraz przez unikanie tworzenia pyłów.
" Przenieś 100 mg homogenizowanej próbki do sterylnej probówki
wirówkowej 1.5 ml
" Dodaj 300 µl sterylnej dejonizowanej wody i wymieszaj szpatuÅ‚kÄ…
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 15
" Dodaj 500 µl buforu CTAB, wymieszaj
" Dodaj 20 µl proteinazy K (20 mg/ml), zworteksuj i inkubuj w 65oC przez
30-90 min*.
" Dodaj 20 µl RNazy A (10 mg/ml), zworteksuj i inkubuj w 65oC przez 5-10 min*
" Wiruj próbki przez 10 min przy 16 000 x g
" PrzenieÅ› supernatant do nowej probówki zawierajÄ…cej 500 µl chloroformu,
wytrzÄ…saj przez 30 s
" Wiruj przez 10 min przy 16 000 x g, do momentu rozdzielenia faz
" PrzenieÅ› 500 µl górnej fazy wodnej do nowej probówki zawierajÄ…cej 500 µl
chloroformu , wymieszaj
" Wiruj przez 5 min, 16 000 x g
" Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki 1.5 ml
" Dodaj 2 objętości roztworu wytrącającego CTAB, zmieszaj przez pipetowanie
góra-dół
" Inkubuj przez 60 min. w temperaturze pokojowej
" Wiruj przez 5 min, 16 000 x g
" Usuń supernatant
" Rozpuść osad w 350 µl NaCl (1,2 M)
" Dodaj 350 µl chloroformu i wytrzÄ…saj przez 30 sek
" Wiruj przez 10 min przy 16 000 x g, do momentu rozdzielenia faz
" Przenieś górną fazę do nowej probówki wirówkowej
" Dodaj 0.6 objętości izopropanolu, wymieszaj
" Wiruj przez 10 min przy 16,000 x g
" Usuń supernatant
" Dodaj 500 µl 70% etanolu i wymieszaj delikatnie
" Wiruj przez 10 min, 16,000 x g
" Usuń supernatant
" Wysusz osad i rozpuść DNA w 100 µl sterylnej dejonizowanej wody
Rozpuszczone DNA może być przetrzymywane w lodówce do maksimum 2 tygodni
lub w zamrażarce (-20oC) przez dłuższy czas.
* te dodatkowe, wcześniej tylko opcjonalne etapy, są obecnie wykorzystywane w
metodzie izolacji DNA opartej na CTAB w celu zwiększenia ilości DNA
izolowanego z ze złożonych matryc (jak żywność, zanieczyszczone próbki itp.).
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 16
Literatura
Hotzel, H., Müller, W. and Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of
residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified
ingredients. European Food Research Technology 209, 192-196.
Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic
modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction.
Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, 203-207.
Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and
Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction
for the detection of genetically modified organisms in various processed
foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.
Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC
collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and
maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923 928.
Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in
processed food products: development and validation of PCR assay for the
specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia
(Eds.). Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1).
Authenticity and adulteration of food-the analytical approach. 24-26 September
1997. Interlaken 1, 23-28. ISBN : 3-9521414-0-2.
Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight
plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321 4325.
Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of
specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research
Technology 213, 361-365.
Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and
Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines
and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84,
2097 2100.
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Izolacja i oczyszczanie DNA 17
Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative
evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean
food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,
81 90.
Analiza próbek spożywczych na zawartość Genetycznie Modyfikowanych Organizmów Rozdział 4
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie
Zmodyfikowanych Organizmów
Rozdział 9
Wykrywanie jakościowe kukurydzy MON810,
kukurydzy Bt-176 i soi Roundup Ready® metodÄ…
PCR
M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara
WORLD HEALTH ORGANIZATION ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION ! /  &/  % /
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA  ! , . 
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 2
Spis Treści
Rozdział 9
Wykrywanie jakościowe kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi
Roundup Ready® metodÄ… PCR
Badania 3
Wstęp 3
PCR specyficzny dla genu roślinnego: soja-lektyna 6
PCR specyficzny dla genu roślinnego: kukurydza-zeina 9
Screeningowe metody detekcji roślin GM 12
Wykrywanie promotora 35S 14
Wykrywanie terminatora nos 14
Specyficzna detekcja kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi Roundup Ready®
metodÄ… nested PCR 17
Wykrywanie kukurydzy MON810 17
Wkrywanie kukurydzy Bt-176 22
Wykrywanie soi Roundup Ready® 26
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 3
Badania
Wprowadzenie
Przedstawione protokoły bazują na metodzie PCR i pozwalają na screening GMO (stosując
promotor 35S i terminator nos) oraz wykrywanie specyficznych GMO (soi Roundup Ready®,
kukurydzy MON810 i kukurydzy Bt-176) w nieprzetworzonym i przetworzonym materiale,
przez porównanie z odpowiednimi niezmodyfikowanym genetycznie próbkami (soi i
kukurydzy).
Przedstawione metody pozwalają tylko na uzyskanie wyniku jakościowego wskazując na
obecność/nieobecność poszukiwanych sekwencji w próbce.
Wyposażenie
" mikropipety
" termocykler
" mała wirówka
" vortex
" statyw na probówki reakcyjne
" probówki reakcyjne PCR 0.2 ml
" probówki wirówkowe 1.5 ml
" oddzielne pomieszczenie z komorÄ… UV
Wskazówki
Cały sprzęt powinien być wolny od zanieczyszczeń DNA i jeśli to możliwe, wysterylizowany
przed użyciem.
W celu uniknięcia kontaminacji należy używać końcówek do pipet z filtrem, które chronią
przed możliwymi zanieczyszczeniami w wypadku tworzenia się aerozoli.
Odczynniki
" dATP CAS1923-31-7
" dCTP CAS102783-51-7
" dGTP CAS93919-41-6
" dTTP CAS18423-43-3
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 4
" 10x PCR bufor (zwykle pochodzÄ…cy od tego samego dostawcy, co polimeraza Taq
DNA)
" 25 mM MgCl2
" polimeraza Taq DNA
" oligonukleotydy
" olej mineralny (potrzebny w wypadku stosowania termocyklera bez pokrywy
wyposażonej w funkcję grzania)
" woda wolna od nukleaz
Roztwór podstawowy 4 mM dNTP
" dNTPs mogą być dostarczane we wcześniej wymieszanych roztworach
podstawowych - zawierajÄ…cych dATP, dCTP, dGTP, dTTP w takich samych
koncentracjach  lub oddzielnie w roztworach skoncentrowanych. Jeśli używamy
oddzielnych roztworów, należy każdy dNTP rozcieńczyć w sterylnej, dejonizowanej
wodzie do stężenia końcowego wynoszącego 4mM dNTP w roztworze
podstawowym.
" Roztwór należy podzielić na mniejsze części i przechowywać w temp. -20°C. dNTPs
pozostaną stabilne przez kilka miesięcy.
Roztwór starterów 20 µM
Startery  oligonukleotydy są zwykle dostarczane w formie liofilizowanej i powinny być
rozpuszczone aż do uzyskania roztworu 20 µM.
" Przygotować 20 µM roztwór starterów wedÅ‚ug wskazówek dostawcy.
- 1 µM = 1 pmol/µl wiÄ™c 20 µM = 20 pmol/µl
- Xnmol startera + 10X µl sterylnej wody = 100 pmol/µl = 100 µM
- Inkubować przez 5 min w 65°C, wstrzÄ…snąć i inkubować przez nastÄ™pne 3 min w
65°C
- RozcieÅ„czyć 1:5. Przygotować 1 mikroprobówkÄ™ wirówkowÄ… zawierajÄ…cÄ… 400 µl
sterylnej wody i dodać 100 µl roztwory starterów (100 µM). Stężenie koÅ„cowe: 20
µM
" Podzielić na maÅ‚e części i przechowywać w -20°C. Tak podzielone części,
przechowywane w -20°C pozostajÄ… stabilne przez 6 miesiÄ™cy; startery w formie
liofilizowanej pozostajÄ… stabilne w -20°C przez okres do trzech lat.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 5
bufor 10x PCR
" Zwykle bufor 10x PCR, zawierajÄ…cy 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9.0 w 25°C) i
1% Triton X-100 jest dostarczany razem z polimerazÄ… Taq DNA w formie gotowej do
użycia. Bufor powinien być wymieszany i zwirowany przed każdym użyciem.
" Podzielone części sÄ… przechowywane w -20°C i pozostajÄ… stabilne przez wiele
miesięcy.
Roztwór 25 mM MgCl2
Roztwór MgCl2  o czystości odpowiedniej do PCR jest zwykle dostarczany razem z
polimerazą Taq DNA w formie gotowej do użycia. Roztwór powinien być wymieszany (przy
użyciu vortexu) i krótko zwirowany przed każdym użyciem (powoduje rozbicie gradientu
koncentracji, który może wystąpić przy przedłużonym przechowywaniu). Przechowywać w
-20°C.
Woda wolna od nukleaz
Dla Mastermixu i rozcieńczeń DNA należy przygotować w małych porcjach sterylną, nie
zawierającą nukleaz, dejonizowaną wodę. Dla każdej serii analiz powinna być używana
nowa porcja wody.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 6
PCR specyficzny dla roślinnego DNA: soja- lektyna
Identyfikacja DNA soi jest przeprowadzana poprzez znalezienie genu lektyny. Reakcja PCR
z zastosowaniem starterów GMO3/GMO4 stwierdza, czy w próbce znajduje się możliwe do
powielenia DNA soi.
Charakterystyka starterów GMO3 i GMO4
GMO3
Sekwencja GCCCTCTACTCCACCCCCATCC
Długość 22
Masa molowa (g/mol) 6471.6
Punkt topnienia * (G/C) 65.1
GMO4
Sekwencja GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG
Długość 23
Masa molowa (g/mol) 6981.1
Punkt topnienia * (G/C) 59.6
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Kontrole
W każdej analizie bardzo ważne jest przeprowadzanie eksperymentów kontrolnych. Kontrole
negatywne są zaprojektowane w celu sprawdzenia czy odczynniki użyte do reakcji PCR nie
są zanieczyszczone przez DNA. Kontrole pozytywne zawierające scharakteryzowane próbki
są również konieczne w celu sprawdzenia efektywności i specyficzności reakcji PCR.
Do analizy przeprowadzanej przy użyciu PCR muszą być dołączone następujące kontrole:
Kontrola pozytywna: czyste DNA, wyizolowane z konwencjonalnej soi
Kontrola negatywna: czyste DNA, wyizolowane z innego gatunku, nie zawierajÄ…cego genu
lektyny
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Przygotowanie Mastermixu
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i
kontrole bez matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 1.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 7
Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z GMO3/GMO4 Mastermixu i
2 µl roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ…
przetrzymywane na lodzie.
Tabela 1. GMO3/GMO4 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy GMO3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy GMO4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.1
" Delikatnie wymieszać Mastermix GMO3/GMO4 poprzez pipetowanie i krótko zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
PCR program* (GMO3/GMO4)
Temperatura Czas
WstÄ™pna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 30 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 63ÚC 30 sek
WydÅ‚użanie 72ÚC 30 sek
Liczba cykli 40
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 8
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
* Uwaga: W czasie kursu, będą używane aparaty Perkin Elmer Gene Amp PCR system
9600, ABI 7500. Stosowanie innych modeli termocyklerów czy termocyklerów innych
producentów pozwoli na uzyskanie takich samych wyników, jeśli tylko programy będą
zaadaptowane i przetestowane1.
Analiza produktu reakcji PCR
Po amplifikacji poszukiwanej sekwencji, produkty reakcji PCR są analizowane przy użyciu
elektroforezy na żelu agarozowym w obecnoÅ›ci bromku etydyny. 8 µl z reakcji PCR jest
mieszane z 2 µl buforu do nakÅ‚adania na żel. NastÄ™pnie próbki sÄ… nakÅ‚adane na żel
agarozowy (1.5%). Rozdział elektroforetyczny trwa 1 godzinę i przebiega przy 100 V.
Równolegle, w celu dokładnego określenia wielkości ampikonu, rozdzielany jest marker mas
molekularnych (15 µl z 100 pz drabinki). Po rozdziale DNA na żelu, prążki sÄ… obserwowane
przy użyciu transiluminatora. Żel może być sfotografowany w celu otrzymania wyniku
eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Para starterów GMO3/GMO4 stosowana do wykrycia natywnego dla soi genu lektyny jest
używana w tym przypadku jako system kontrolny. Specyficzny dla lektyny prążek o wielkości
118 pz potwierdza, że wyizolowane DNA jest odpowiedniej jakości do amplifikacji.
W kontroli pozytywnej powielany będzie fragment o wielkości 118 pz. Kontrola negatywna i
kontrola bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków.
Jeśli pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nieważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki, a próbka nie daje prążka o wielkości 118 pz, oznacza
to, że próbka ta nie zawiera DNA soi, które można powielić. Należy pamiętać, że inne
protokoły w tej sesji są metodami jakościowymi pozwalającymi tylko na otrzymanie
jakościowego wyniku (zawiera/nie zawiera).
1
JRC i WHO nie rekomendują żadnych instrumentów wykorzystywanych podczas kursu czy
wymienionych w tym przewodniku. Analizy przeprowadzone w tych laboratoriach powinny być
powtarzalnie przeprowadzane przy użyciu alternatywnego sprzętu.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 9
PCR specyficzny dla roślinnego DNA: kukurydza-zeina
Identyfikacja DNA kukurydzy jest przeprowadzana poprzez znalezienie genu zeiny. Reakcja
PCR z zastosowaniem starterów ZEIN3/ZEIN4 stwierdza czy w próbce znajduje się możliwe
do powielenia DNA kukurydzy.
Charakterystyka starterów ZEIN3 i ZEIN4
ZEIN3
Sekwencja AGTGCGACCCATATTCCAG
Długość 19
Masa molowa (g/mol) 5772.3
Punkt topnienia * (G/C) 55.2
ZEIN4
Sekwencja GACATTGTGGCATCATCATTT
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6410.9
Punkt topnienia * (G/C) 51.7
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Kontrole
Kontrola pozytywna: czyste DNA, wyizolowane z konwencjonalnej kukurydzy
Kontrola negatywna: czyste DNA, wyizolowane z innego gatunku, nie zawierajÄ…cego genu
zeiny
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Przygotowanie Mastermixu
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i bez
matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 2.
Przedstawiana procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z ZEIN3/ZEIN4 Mastermixu i
2 µl roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ…
przetrzymywane na lodzie.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 10
Tabela 2. ZEIN3/ZEIN4 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy GMO3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy GMO4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.2
" Delikatnie wymieszać Mastermix ZEIN3/ZEIN4 poprzez pipetowanie i krótko zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
PCR program (ZEIN3/ZEIN4)
Temperatura Czas
WstÄ™pna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 96ÚC 1 min
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 1 min
WydÅ‚użanie 72ÚC 1 min
Liczba cykli 40
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 11
Analiza produktu reakcji PCR
Po amplifikacji poszukiwanej sekwencji, produkty reakcji PCR są analizowane przy użyciu
elektroforezy na żelu agarozowym w obecnoÅ›ci bromku etydyny. 8 µl z reakcji PCR jest
mieszane z 2 µl buforu do nakÅ‚adania na żel; nastÄ™pnie próbki sÄ… nakÅ‚adane na żel
agarozowy (1.5%). Rozdział elektroforetyczny trwa 1 godzinę i przebiega przy 100 V.
Równolegle, w celu dokładnego określenia wielkości ampikonu, rozdzielany jest marker
mas molekularnych (15 µl z 100 pz drabinki). Po rozdziale DNA na żelu, prążki sÄ…
obserwowane przy użyciu transiluminatora. Żel może być sfotografowany w celu otrzymania
wyniku eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Para starterów ZEIN3/ZEIN4 stosowana do wykrycia natywnego genu zeiny jest używana w
tym przypadku jako system kontrolny w celu potwierdzenia, że wyizolowane DNA jest
odpowiedniej jakości do amplifikacji. Jeśli wyizolowane DNA jest jakości odpowiedniej do
amplifikacji, na żelu będzie widoczny specyficzny dla genu zeiny prążek o wielkości 227 pz.
W kontroli pozytywnej powielany będzie również fragment o wielkości 227 pz.
Kontrola negatywna i bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków.
Jeśli pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nieważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki, a próbka nie daje prążka o wielkości 227 pz, oznacza
to, że próbka ta nie zawiera DNA soi, które można by powielić.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 12
Metoda screeningowa pozwalajÄ…ca na wykrycie Genetycznie
Zmodyfikowanych Roślin
Geny znajdują się pod kontrolą promotorów i terminatorów. Najczęściej używanym
promotorem w celu regulacji ekspresji transgenu jest promotor 35S (pochodzÄ…cy z CaMV) i
terminator nos (pochodzÄ…cy z Agrobacterium tumefaciens). Zidentyfikowanie jednej z tych
sekwencji regulatorowych w próbce zawierającej soję i/lub kukurydze wskazuje na obecność
GMO.
W soi Roundup Ready® możliwa jest identyfikacja zarówno promotora 35S jak i terminatora
nos, w przypadku kukurydzy tylko promotor 35S jest obecny w liniach Bt-176 i MON810.
Detekcja promotora 35S
Charakterystyka starterów p35S-cf3 i p35S-cr4
p35S-cf3
Sekwencja CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6414.5
Punkt topnienia * (G/C) 57.4
p35S-cr4
Sekwencja TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
Długość 25
Masa molowa (g/mol) 7544.2
Punkt topnienia * (G/C) 56.3
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Kontrole
Kontrola pozytywna: DNA z materiałów referencyjnych (kukurydza GM 0.5%)
Kontrola negatywna: DNA z materiałów referencyjnych (kukurydza GM 0%)
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Przygotowanie Mastermixu
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i bez
matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 3.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 13
Przedstawiana procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z p35S-cf3/p35S-cr4
Mastermixu i 2 µl roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania
Mastermixu sÄ… przetrzymywane na lodzie.
Tabela 3. p35S-cf3/p35S-cr4 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy GMO3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy GMO4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.3
" Delikatnie wymieszać Mastermix p35S-cf3/p35S-cr4 poprzez pipetowanie i krótko
zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
PCR program (p35S-cf3/p35S-cr4)
Temperatura Czas
WstÄ™pna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 25 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 62ÚC 30 sek
WydÅ‚użanie 72ÚC 45 sek
Liczba cykli 50
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 7 min
4ÚC "
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 14
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Analiza produktów PCR
Po amplifikacji produkty PCR są analizowane na żelu agarozowym z dodatkiem bromku
etydyny przy użyciu elektroforezy. 8 µl z reakcji PCR jest mieszane z 2 µl buforu do
nakładania na żel; następnie próbki są nakładane na żel agarozowy (2.5%). Rozdział
elektroforetyczny trwa 1 godzinę i przebiega przy 100 V. Równolegle, w celu dokładnego
okreÅ›lenia wielkoÅ›ci ampikonu, rozdzielany jest marker mas molekularnych (15 µl z 100 pz
drabinki). Po rozdziale DNA na żelu, prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora.
Żel może być sfotografowany w celu otrzymania wyniku eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Para starterów p35S-cf3/p35S-cr4 jest używana do wykrywania promotora 35S CaMV i
amplifikuje fragment o wielkości 123 pz. Ten promotor reguluje ekspresję wielu roślin
transgenicznych takich jak soja Roundup Ready® i kukurydza Bt-176.
W kontroli pozytywnej powielany będzie fragment o wielkości 123 pz. Kontrola negatywna i
kontrola bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków. Jeśli
pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nieważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki, a próbka prążek o wielkości 123 pz, oznacza to, że
próbka ta zawiera zmodyfikowane DNA.
Detekcja terminatora nos
Charakterystyka starterów HA-nos 118-f i HA-nos 118-r
HA-nos 118-f
Sekwencja GCATGACGTTATTTATGAGATGGG
Długość 24
Masa molowa (g/mol) 7462.8
Punkt topnienia * (G/C) 56.2
HA-nos 118-r
Sekwencja GACACCGCGCGCGATAATTTATCC
Długość 24
Masa molowa (g/mol) 7296.9
Punkt topnienia * (G/C) 61.2
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 15
Kontrole
Kontrola pozytywna: DNA z materiałów referencyjnych (RRS 0.5% GM)
Kontrola negatywna: DNA z materiałów referencyjnych (soja 0% GM)
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Przygotowanie Mastermixu
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i bez
matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 4.
Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z HA-nos118-f/HA-nos118-
Mastermixu i 2 µl roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania
Mastermixu sa przetrzymywane na lodzie.
Tabela 4. HA-nos118-f/HA-nos118-r Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy GMO3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy GMO4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.4
" Delikatnie wymieszać Mastermix p35S-cf3/p35S-cr4 poprzez pipetowanie i krótko
zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 16
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
PCR program (HA-nos118-f/HA-nos118-r)
Temperatura Czas
WstÄ™pna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 25 sec
PrzyÅ‚Ä…czanie 62ÚC 30 sec
WydÅ‚użanie 72ÚC 45 sec
Liczba cykli 50
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 7 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Analiza produktu PCR
Po amplifikacji produkty PCR są analizowane na żelu agarozowym z dodatkiem bromku
etydyny przy użyciu elektroforezy. 8 µl z reakcji PCR jest mieszane z 2 µl buforu do
nakładania na żel; następnie próbki są nakładane na żel agarozowy (2.5%). Rozdział
elektroforetyczny trwa 1h i przebiega przy 100 V. Równolegle, w celu dokładnego określenia
wielkoÅ›ci ampikonu, rozdzielany jest marker mas molekularnych (15 µl z 100 pz drabinki).
Po rozdziale DNA na żelu, prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora. Żel może
być sfotografowany w celu otrzymania wyniku eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Para starterów HA-nos118-f/HA-nos118-r jest używana do wykrywania terminatora nos i
amplifikuje fragment o wielkoÅ›ci 118 pz. Ten terminator jest obecny w soi Roundup Ready® i
innych liniach roślin transgenicznych (np. kukurydzy Bt-11)
W kontroli pozytywnej powielany będzie fragment o wielkości 118 pz.
Kontrola negatywna i bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków. Jeśli
pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nie ważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki a próbka prążek o wielkości 1118 pz oznacza to, że
próbka ta zawiera zmodyfikowane DNA.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 17
Specyficzna detekcja kukurydzy MON810, kukurydzy Bt-176 i soi
Roundup Ready® przy użyciu nested PCR
Detekcja kukurydzy MON810
Ten system detekcji jest specyficzny dla kukurydzy MON810. Poszukiwanymi elementami sÄ…
promotor 35S CaMV i region hsp70 ekson1/intron1, które są odpowiednio konstytutywną
sekwencją regulatorową i sekwencją genu białka szoku cieplnego stosowaną dla uzyskania
zwiększonego poziomu transkrypcji.
Charakterystyka starterów mg1, mg2, mg3 i mg4
mg1
Sekwencja TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC
Długość 25
Masa molowa (g/mol) 7665.1
Punkt topnienia * (G/C) 59.6
mg2
Sekwencja TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT
Długość 25
Masa molowa (g/mol) 7560.2
Punkt topnienia * (G/C) 57.9
mg3
Sekwencja ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC
Długość 25
Masa molowa (g/mol) 7472.2
Punkt topnienia * (G/C) 61.2
mg4
Sekwencja GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC
Długość 25
Masa molowa (g/mol) 7722.9
Punkt topnienia * (G/C) 59.6
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 18
Kontrole
Kontrola pozytywna: DNA z materiałów referencyjnych (MON810 0.1% GM)
Kontrola negatywna: DNA z materiałów referencyjnych (kukurydza 0% GM)
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Przygotowanie Mastermixu
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i bez
matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 5.
Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z mg1/mg2 Mastermixu i 2 µl
roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ…
przechowywane na lodzie.
Tabela 5. mg1/mg2 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy mg1 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy mg2 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.5
" Delikatnie wymieszać Mastermix mg1/mg2 poprzez pipetowanie i krótko zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 19
PCR program (mg1/mg2)
Temperatura Czas
WstÄ™pna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 45 sec
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 50 sec
WydÅ‚użanie 72ÚC 50 sec
Liczba cykli 35
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Przygotowanie Mastermixu 2
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w
Tab. 6. Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (49 µl z mg3/mg4
Mastermixu i 1 µl zamplifikowanego roztworu DNA z pierwszej reakcji PCR). Wszystkie
odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ… przetrzymywane na lodzie.
Tabela 6. mg3/mg4 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 33.75 µl 337.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy mg3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy mg4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 49 µl 490 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.6
" Delikatnie wymieszać Mastermix mg3/mg4 poprzez pipetowanie i krótko zwirować
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 20
" Przenieść po 49 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 1 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
Program dla nested PCR (mg3-mg4)
Temperatura Czas
Wstepna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 45 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 50 sek
WydÅ‚użanie 72ÚC 50 sek
Liczba cykli 40
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Analiza produktów PCR
Po amplifikacji produkty PCR są analizowane na żelu agarozowym z dodatkiem bromku
etydyny przy użyciu elektroforezy. 8 µl z reakcji PCR jest mieszane z 2 µl buforu do
nakładania na żel; nastepnie próbki sa nakładane na żel agarozowy (2.5%). Rozdział
elektroforetyczny trwa 1 godzinę i przebiega przy 100 V. Równolegle, w celu dokładnego
okreÅ›lenia wielkoÅ›ci ampikonu, rozdzielany jest marker mas molekularnych (15 µl z 100 pz
drabinki). Po rozdziale DNA na żelu, prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora.
Żel może być sfotografowany w celu otrzymania wyniku eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Pary starterów mg1/mg2 i mg3/mg4 są używane do specyficznego wykrywania kukurydzy
MON810. W wyniku nested PCR amplifikowany jest fragment o wielkości 149 pz.
Specyficzność jest warunkowana faktem, że startery są zaprojektowane w rejonie
pokrywajÄ…cym promotor P-35S oraz hsp70 ekson/intron gen.
W kontroli pozytywnej powielany będzie fragment o wielkości 149 pz.
Kontrola negatywna i bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 21
Jeśli pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nie ważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki, a próbka prążek o wielkości 149 pz, oznacza to, że
próbka ta zawiera DNA kukurydzy MON810.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 22
Detekcja kukurydzy Bt-176
Celem reakcji PCR jest wykrycie genu cryIA(b), który chroni roślinę przed żerowaniem
owadów, takich jak omacnica prosowianka.
Charakterystyka starterów CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 and CRYIA4
CRYIA1
Sekwencja CGGCCCCGAGTTCACCTT
Długość 18
Masa molowa (g/mol) 5394.6
Punkt topnienia * (G/C) 59.5
CRYIA2
Sekwencja CTGCTGGGGATGATGTTGTTG
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6519.2
Punkt topnienia * (G/C) 57.6
CRYIA3
Sekwencja CCGCACCCTGAGCAGCAC
Długość 18
Masa molowa (g/mol) 5397.6
Punkt topnienia * (G/C) 61.7
CRYIA4
Sekwencja GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6479.2
Punkt topnienia * (G/C) 57.6
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Kontrole
Kontrola pozytywna: DNA z materiałów referencyjnych (Bt-176 0.1% GM)
Kontrola negatywna: DNA z materiałów referencyjnych (kukurydza 0% GM)
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Przygotowanie Mastermixu 1
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 23
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i bez
matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 5.
Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z CRYIA1/CRYIA2
Mastermixu i 2 µl roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania
Mastermixu sÄ… przetrzymywane na lodzie.
Tabela 7. CRYIA1/CRYIA2 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy mg3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy mg4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.7
" Delikatnie wymieszać Mastermix CRYIA1/CRYIA2 poprzez pipetowanie i krótko
zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
Program PCR (CRYIA1/CRYIA2)
Temperatura Czas
Wstepna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 40 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 40 sek
WydÅ‚użanie 72ÚC 40 sek
Liczba cykli 25
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 24
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Przygotowanie Mastermixu 2
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w
Tab. 8. Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (49 µl z CRYIA3/CRYIA4
Mastermixu i 1 µl zamplifikowanego roztworu DNA z pierwszej reakcji PCR). Wszystkie
odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ… przetrzymywane na lodzie.
Tabela 8. CRYIA3/CRYIA4 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 33.75 µl 337.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy mg3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy mg4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 49 µl 490 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.8
" Delikatnie wymieszać Mastermix CRYIA3/CRYIA4 poprzez pipetowanie i krótko
zwirować
" Przenieść po 49 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 1 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 25
Program dla nested PCR (CRYIA3/CRYIA4)
Temperatura Czas
Wstepna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 40 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 40 sek
WydÅ‚użanie 72ÚC 40 sek
Liczba cykli 35
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Analiza produktu PCR
Po amplifikacji produkty PCR są analizowane na żelu agarozowym z dodatkiem bromku
etydyny przy użyciu elektroforezy. 8 µl z reakcji PCR jest mieszane z 2 µl buforu do
nakładania na żel; nastepnie próbki sa nakładane na żel agarozowy (2.5%). Rozdział
elektroforetyczny trwa 1 godzinę i przebiega 100 V. Równolegle, w celu dokładnego
okreÅ›lenia wielkoÅ›ci ampikonu, rozdzielany jest marker mas molekularnych (15 µl z 100 pz
drabinki). Po rozdziale DNA na żelu, prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora.
Żel może być sfotografowany w celu otrzymania wyniku eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Pary starterów CRYIA1/CRYIA2 i CRYIA3/CRYIA4 są używane do specyficznego
wykrywania syntetycznego genu cryIA(b) metodÄ… nested PCR. W wyniku nested PCR
amplifikowany jest fragment o wielkości 189 pz. Gen ten jest obecny w kukurydzy Bt-176 i w
innych liniach kukurydzy (np. Bt-11).
W kontroli pozytywnej powielany będzie fragment o wielkości 189 pz.
Kontrola negatywna i bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków.
Jeśli pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nieważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki, a próbka prążek o wielkości 189 pz, oznacza to, że
próbka ta zawiera DNA kukurydzy Bt-176.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 26
Detekcja soi Roundup Ready®
Celem reakcji PCR jest wykrycie genu CP4 EPSPS, który zapewnia odporność na herbicyd
Roundup®.
Charakterystyka starterów GMO5, GMO9, GMO7 I GMO8
GMO5
Sekwencja CCACTGACGTAAGGGATGACG
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6479.4
Punkt topnienia * (G/C) 59.5
GMO9
Sekwencja CATGAAGGACCGGTGGGAGAT
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6559.4
Punkt topnienia * (G/C) 59.5
GMO7
Sekwencja ATCCCACTATCCTTCGCAAGA
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6309.6
Punkt topnienia * (G/C) 55.8
GMO8
Sekwencja TGGGGTTTATGGAAATTGGAA
Długość 21
Masa molowa (g/mol) 6579.8
Punkt topnienia * (G/C) 51.7
*bazujÄ…c na [Na+] z 50 mM
Kontrole
Kontrola pozytywna: DNA z materiałów referencyjnych (RRS soja 0.1%)
Kontrola negatywna: DNA z materiałów referencyjnych (soja 0% GM)
Kontrola bez matrycy: kontrola negatywna Mastermixu, w której zamiast DNA użyta jest
woda
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 27
Przygotowanie Mastermixu 1
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek (włączając kontrole pozytywne/negatywne i bez
matrycy) są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w Tab. 9.
Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (48 µl z GMO5/GMO9 Mastermixu i
2 µl roztworu DNA). Wszystkie odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ…
przetrzymywane na lodzie.
Tabela 9. GMO5/GMO9 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10 reakcji
reakcjÄ™
Sterylna, dejonizowana woda 32.75 µl 327.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy mg3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy mg4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 48 µl 480 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.9
" Delikatnie wymieszać Mastermix GMO5/GMO9 poprzez pipetowanie i krótko zwirować
" Przenieść po 48 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 2 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 28
PCR program (GMO5/GMO9)
Temperatura Czas
Wstepna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 30 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 30 sek
Wydłużanie
Liczba cykli 72ÚC 40 sek
25
Wydłużanie końcowe
Wstepna denaturacja 72ÚC 3 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Przygotowanie Mastermixu 2
Odczynniki potrzebne do serii 10 próbek są ze sobą mieszane według instrukcji podanej w
Tab. 10. Przedstawiona procedura odnosi siÄ™ do reakcji na 50 µl (49 µl z GMO7/GMO8
Mastermixu i 1 µl zamplifikowanego roztworu DNA z pierwszej reakcji PCR). Wszystkie
odczynniki podczas przygotowywania Mastermixu sÄ… przechowywane na lodzie.
Tabela 10. GMO7/GMO8 Mastermix
Stężenie Mastermix Mastermix
końcowe na jedna na 10
reakcjÄ™ reakcji
Sterylna, dejonizowana woda 33.75 µl 337.5 µl
Bufor 10x PCR 1x 5 µl 50 µl
25 mM MgCl2 2.5 mM 5 µl 50 µl
4 mM dNTPs 0.2 mM 2.5 µl 25 µl
20 µM oligonukleotydy mg3 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
20 µM oligonukleotydy mg4 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl
Polimeraza Taq DNA 0.025 U/µl 0.25 µl 2.5 µl
RAZEM 49 µl 490 µl
" Przygotować mikroprobówkę wirówkową o poj.1.5 ml
" Dodać odczynniki według kolejności podanej w Tab.10
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 29
" Delikatnie wymieszać Mastermix GMO7/GMO8 poprzez pipetowanie i krótko zwirować
" Przenieść po 49 µl Mastermixu do probówek reakcyjnych PCR o poj. 0.2 ml
" Dodać po 1 µl roztworu DNA
" Delikatnie wstrząsnąć i krótko zwirować
" Umieścić probówki reakcyjne PCR w termocyklerze
Program dla nested PCR (GMO7/GMO8)
Temperatura Czas
Wstepna denaturacja 95ÚC 3 min
Denaturacja 95ÚC 30 sek
PrzyÅ‚Ä…czanie 60ÚC 30 sek
WydÅ‚użanie 72ÚC 40 sek
Liczba cykli 35
WydÅ‚użanie koÅ„cowe 72ÚC 3 min
4ÚC "
Po amplifikacji, próbki są krótko zwirowywane i wstawione na lód.
Analiza produktu PCR
Po amplifikacji produkty PCR są analizowane na żelu agarozowym z dodatkiem bromku
etydyny przy użyciu elektroforezy. 8 µl z reakcji PCR jest mieszane z 2 µl buforu do
nakładania na żel; nastepnie próbki sa nakładane na żel agarozowy (2.5%). Rozdział
elektroforetyczny trwa 1 godzinę i przebiega przy 100 V. Równolegle, w celu dokładnego
okreÅ›lenia wielkoÅ›ci ampikonu, rozdzielany jest marker mas molekularnych (15 µl z 100 pz
drabinki). Po rozdziale DNA na żelu, prążki są obserwowane przy użyciu transiluminatora.
Żel może być sfotografowany w celu otrzymania wyniku eksperymentu w formie obrazu.
Interpretacja wyników
Pary starterów GMO5/GMO9 i GMO7/GMO8 są używane do specyficznego wykrywania
konstruktu Roundup Ready® w soi metodÄ… nested PCR. W wyniku nested PCR
amplifikowany jest fragment o wielkości 169 pz. Startery GMO5 i GMO7 są komplementarne
do promotora 35S z wirusa mozaiki kalafiora CaMV, GMO9 hybrydyzuje z genem CP4
EPSPS z Agrobacterium sp. szczep CP4 a GMO8 z genem CTP EPSPS.
W kontroli pozytywnej powielany będzie fragment o wielkości 169 pz.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Wykrywanie jakoÅ›ciowe kukurydzy MON10, kukurydzy Bt-176 i soi RoundupReady® metodÄ… PCR. 30
Kontrola negatywna i bez matrycy nie powinny dawać żadnych widocznych prążków.
Jeśli pozytywne/negatywne kontrole nie dają oczekiwanych wyników, cała analiza PCR
wszystkich próbek jest nieważna.
Jeśli kontrole dają oczekiwane wyniki, a próbka prążek o wielkości 169 pz, oznacza to, że
próbka ta zawiera DNA soi Roundup Ready®.
Badanie próbek żywności na obecność genetycznie zmodyfikowanych organizmów Rozdział 9
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie
Zmodyfikowanych Organizmów
Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
F. Weighardt
WORLD HEALTH ORGANIZATION ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION ! /  &/  % /
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA  ! , . 
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
2
Spis treści
Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
WST
P 3
METODY PCR SA
UÅ»
CE DO ILOÅšCIOWEJ OCENY GMO 4
HISTORIA TECHNIK PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (REAL-TIME PCR) 6
ZASADY DZIAA
ANIA PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (REAL-TIME PCR) 6
ZASADY ILOÅšCIOWEGO OZNACZANIA METOD
PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (REAL-TIME PCR) 13
LITERATURA 19
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
3
Wstęp
W przypadku, gdy analiza jakościowa produktu żywnościowego dała pozytywny
wynik na obecność jednej lub kilku genetycznych modyfikacji (soja Roundup
Ready®, kukurydza Bt-176, Bt-11, MON810 i T25), to nastÄ™pny etap analityczny
polega na oszacowaniu, czy ich zawartość jest zgodna z prawem (Regulacja (EC)
1829/2003, Regulacja (EC) 1830/2003). W zwiÄ…zku z tym konieczna jest analiza
ilościowa każdej modyfikacji obecnej w indywidualnym składniku (Rysunek1).
Wyżej wspomniane Regulacje zakładają, że wszystkie produkty składające się lub
zawierające GMO albo produkowane z GMO muszą być znakowane w sposób
następujący: znakowanie nie jest wymagane dla produktów, w których rozważane
składniki zawierają poniżej 1% (obecnie 0.9%) GMO, ponieważ taka ilość GMO może
być przypadkowa lub technicznie nieunikniona. Wszystkie składniki (mąka, grysik,
olej, itd.) pochodzÄ…ce z jednego gatunku (np. z kukurydzy, soi, rzepaku itd.) sÄ… brane
pod uwagę łącznie jako jeden indywidualny składnik (np. kukurydza).
Maize GM
0,6%
Soya non GM
99,4%
Maize non GM
99,4%
SOYA GM
0,6%
Rysunek 1. Znakowanie nie jest wymagane. Ilość zarówno soi GM jak i kukurydzy GM jest
poniżej legalnego progu.
Jeśli, na przykład, składnik pochodzący wyłącznie z kukurydzy zawiera mniej niż 1%
(obecnie 0.9%) kukurydzy GM, nie jest konieczne znakowanie produktu
żywnościowego pochodzącego z niej. Z drugiej strony, jeśli zawiera więcej niż 1%
(obecnie 0.9%) kukurydzy GM, produkt z niej pochodzący musi być oznakowany.
Dzieje się tak nawet wtedy, jeśli w końcowym produkcie zawierającym sumę
wszystkich składników pochodzących z różnych gatunków (np. soja i kukurydza),
względna ilość kukurydzy GM kształtuje się poniżej 0.9%. Jeśli są obecne dwie lub
więcej odmian kukurydzy GM, to ich zawartość sumuje się i ich sumaryczny udział
procentowy decyduje o konieczności znakowania (Rysunek 2). Jeśli suma ta jest
poniżej progu 0.9%, znakowanie nie jest wymagane.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
4
Maize Bt 176
0,6%
Soya non GM
100%
Maize non GM
98,8%
Maize Bt 11
0,6%
Rysunek 2. Znakowanie jest wymagane ze względu na kukurydzę. Suma kukurydzy
Bt-11 (0.6%) i Bt-176 (0.6%) przekracza próg 0.9%.
Względna zawartość GMO (procentowa) określana jest jako stosunek ilości
specyficznych sekwencji GMO do ilości genu specyficznego dla rośliny (np. lektyny
dla soi i inwertazy lub zeiny dla kukurydzy). Wyliczony w ten sposób procent GMO
jest wyrażony następująco: GMO (%)= GM-DNA/referencyjny-DNA x 100.
Metody PCR służące do ilościowej oceny GMO
Głównym mankamentem konwencjonalnego PCR jest brak dokładnej informacji
ilościowej z powodu wydajności amplifikacji. Jeśli wydajność reakcji dla każdego
cyklu powielania jest stała, stężenie DNA po reakcji PCR powinno być wprost
proporcjonalne do początkowej ilości matrycowego DNA. Niestety, wydajność
powielania zmienia się zarówno pomiędzy reakcjami, jak i w kolejnym cyklu jednej
reakcji. Szczególnie w póz
niejszych cyklach reakcji PCR produkty powielania
powstają w sposób nie-ekspotencjalny i wydajności reakcji nie jest znana.
Ilościowe oznaczenie DNA w konwencjonalnym PCR polega na pomiarze w punkcie
końcowym reakcji i ma największą czułość, gdy powielanie osiąga maximum
wydajności (faza plateau). Na tym etapie reakcja przestaje mieć charakter
ekspotencjalny z powodu wyczerpywania się składników i stopniowej termicznej
inaktywacji zastosowanej polimerazy. Z tego powodu korelacja między stężeniem
końcowego produktu a początkową liczbą cząsteczek matrycowych jest ograniczona.
Aby przezwyciężyć te problemy powstały takie techniki jak: ilościowo-kompetytywny
PCR (quantitative-competitive QC-PCR) i PCR w czasie rzeczywistym (real-time
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
5
PCR), które pozwalają na określenie zależności między stężeniem matrycowego
DNA a ilością produktów PCR powstałych podczas powielania.
Ilościowo-kompetytywny PCR
Ilościowo-kompetytywny PCR (Giacca et al., 1994; Studer et al., 1998; Hardegger et al.,
1999) jest jedną z najwcześniej rozwiniętych metod ilościowego PCR. Metoda ta opiera
się na jednoczesnym powielaniu matrycowego DNA i określonej ilości wewnętrznego
standardu DNA (kompetytora) posiadajÄ…cych takie same miejsca wiÄ…zania startera.
Ponieważ początkowa ilość kompetytora jest znana i zakładając, że wydajność
amplifikacji DNA matrycowego i kompetytora jest taka sama, to stosunek ilości produktów
PCR oszacowanych np. elektroforetycznie odpowiada stosunkowi matrycowego DNA i
kompetytora w próbce przed reakcją.
Powielone DNA matrycy
Powielone DNA kompetytora
Rysunek 3. Jednoczesne powielanie określonej ilości matrycowego DNA z różną ilością
kompetytora.
Kompetytywny PCR jest z powodzeniem używany do określania ilości zarówno DNA jak i
RNA, lecz zakres jego działania jest ograniczony przez stosunek ilości matrycy do
kompetytora i mieści się w granicach od 1:10 do 10:1. W rzeczywistości największa
dokładność jest osiągnięta w punkcie równowagi, przy którym stosunek matrycy do
kompetytora wynosi 1:1 (Rysunek 3). Można go określić poprzez przetestowanie serii
rozcieńczeń i znalez
ć odpowiedni stosunek matrycy do kompetytora.
Kolejną niedogodnością kompetytywnego PCR jest konieczność scharakteryzowania i
skonstruowania różnych kompetytorów dla każdego rodzaju matrycy, jaka ma być
oznaczona ilościowo. W rzeczywistości nawet niewielkie różnice w wydajności powielania
poważnie wpływają na dokładność oznaczenia przy użyciu tej metody. Co więcej, po
zakończeniu reakcji kompetytywny PCR wymaga dokładnego określenia ilości
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
6
amplikonów matrycy i kompetytora, co zazwyczaj wymaga kolejnego pracochłonnego
etapu po reakcji PCR.
Kompetytywny PCR jest pół-ilościową metodą wymagającą standardu (kompetytora), do
którego odnosi się próbki. Wyniki mogą wskazywać tylko wartości poniżej, równe lub
powyżej określonego stężenia standardu.
Zaletą systemu kompetytywnego PCR jest jednak to, że nie wymaga specjalistycznego
sprzętu, jedynie standardowego aparatu PCR i wyposażenia takiego jak w standardowym
laboratorium biologii molekularnej.
PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR)
Dokładniejszą i obecnie szerzej stosowaną metodą do ilościowego oznaczania DNA jest
PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR). W przeciwieństwie do poprzedniego
systemu, gdzie oznaczanie zachodziło w końcowym punkcie reakcji, system ten pozwala
na monitorowanie reakcji w czasie, w którym ona rzeczywiście zachodzi. W tego rodzaju
systemie reakcja PCR jest związana z emisją sygnału fluorescencyjnego
proporcjonalnego do ilości produktu generowanego w każdym cyklu reakcji. Poprzez
pomiar fluorescencji w każdym cyklu reakcji, jest możliwe śledzenie reakcji w fazie
ekspotencjalnej. Pierwszy znaczÄ…cy wzrost fluorescencji jest skorelowany z poczÄ…tkowÄ…
ilością matrycy (Ahmed, 2002).
Historia technik PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR)
Pionierami badania kinetyki reakcji PCR poprzez stworzenie systemu zdolnego do
detekcji produktów PCR podczas ich akumulacji byli Higuchi i wsp. (1992, 1993). Ten
 real time system zawierał w mieszaninie reakcyjnej interkalującą cząsteczkę bromku
etydyny. Termocykler był zaadaptowany do naświetlania próbek promieniowaniem UV i
był zdolny do detekcji powstałej fluorescencji przy użyciu kamery CCD (charge coupled
device) połączonej z komputerem. Gdy zachodziło powielanie, wzrastała ilość
dwuniciowego DNA, z którym interkalował bromek etydyny, co w efekcie prowadziło do
wzrostu fluorescencji. Wykreślając zależność pomiędzy fluorescencją a numerem cyklu
otrzymuje się wykres dający pełniejszy obraz zachodzących procesów niż analizując
akumulację produktów po określonej ilości cykli.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
7
Zasady działania PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR)
Specyficzność metody PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR) zależy zarówno od
chemicznego sposobu generowania i monitorowania reakcji powielania, jak i od
instrumentu stosowanego do śledzenia sygnału. Do metody tej opracowano różne
inerkalujÄ…ce barwniki (bromek etydyny, SYBR Green I) i hybrydyzujÄ…ce sondy (TaqMan,
Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons, Scorpions, TaqMan
Minor Groove Binder).
PCR w czasie rzeczywistym oparty o barwnik SYBR Green I
Pierwsze zastosowanie metody PCR w czasie rzeczywistym wypływało bezpośrednio z
badań Higuchi ego i wsp. (1992, 1993), ale bromek etydyny zastąpiono mniej toksycznym
i bardziej specyficznym oraz bardziej czułym (10-25 razy) fluorescencyjnym barwnikiem
SYBR Green I (Haugland. 2002) przyłączającym się do dwuniciowego (ds) DNA.
Barwnik SYBR Green łączy się z mniejszą bruzdą dsDNA, ale nie wiąże się z ssDNA. W
konsekwencji tego wiÄ…zania wzrasta fluorescencja (wzbudzenie ok. 388nm i 254nm;
emisja ok. 560nm). Z chwilą rozpoczęcia reakcji PCR wzrastająca ilość nowo
syntetyzowanej nici powoduje wzrost sygnału fluorescencyjnego. Ograniczeniem tego
systemu bazującego na SYBR Green I jest to, że rozpoznaje on sekwencje DNA
niespecyficzne. W rzeczywistości zliczana jest każda dwuniciowa cząsteczka DNA
obecna w mieszaninie reakcyjnej, Å‚Ä…cznie z niespecyficznymi produktami reakcji PCR i
dimerami utworzonymi przez startery. Aby przezwyciężyć ten problem i odjąć
komponenty powstałe z powodu niespecyficznego DNA i dimerów utworzonych przez
startery, w niektórych aparatach jest możliwe przeprowadzenie analizy krzywej topnienia.
Po ostatnim etapie PCR produkty są powoli podgrzewane aż do dysocjacji i analizowana
jest fluorescencja. Ponieważ każdy dsDNA ma specyficzną temperaturę topnienia, jest
możliwe ilościowe określenie w jednej mieszaninie reakcyjnej komponentów mających
różne temperatury topnienia i w ten sposób wyeliminowanie z ilościowego oznaczenia
komponentów niespecyficznych.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
8
Metody real-time PCR oparte o sondy specyficzne względem sekwencji
Problem specyficzności fluorescencyjnej detekcji amplikonu został rozwiązany przez
zastosowanie sekwencyjnie specyficznych sond znakowanych fluorescencyjnie
umiejscowionych pomiędzy parą starterów PCR. Proces hybrydyzacji (i ewentualnie
degradacji) zazwyczaj nie interferuje z ekspotencjalną akumulacją produktów PCR.
Obecnie stosowanych jest kilka różnych podejść do specyficznych reakcji ilościowych
bazujÄ…cych na PCR w czasie rzeczywistym.
Sondy FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
FRET opiera się na transferze energii od fluorofora będącego donorem do fluorofora
będącego akceptorem (Rysunek 4) (Haugland, 2002). Główne założenia systemu FRET
są następujące:
czÄ…steczki donora i akceptora muszÄ… być w bliskiej odlegÅ‚oÅ›ci (najczęściej 10-100Å).
spektrum absorpcji akceptora musi się nakładać ze spektrum emisji fluorescencji donora
Orientacje przejściowych dipoli donora i akceptora muszą być równoległe
Jeśli donor i akceptor są w bliskiej odległości wzbudzenie donora niebieskim światłem
powoduje przeniesienie energii do akceptora, który następnie emituje światło o większej
długości fali. Tworzenie produktu PCR może być monitorowane przez dodanie do
starterów PCR dwu sekwencyjnie specyficznych sond znakowanych fluorescencyjnie
zwanych sondami hybrydyzacyjnymi. Sondy hybrydyzacyjne stanowiÄ… parÄ™, przy czym
jedna sonda jest znakowana za pomocą barwnika będącego donorem (3 - Fluorescyna),
a druga przy użyciu barwnika pełniącego funkcję akceptora (5 - Red 640 lub 5 -Red 705).
Ponieważ FRET maleje wraz z odległością, sondy hybrydyzacyjne muszą być tak
zaprojektowane, aby hybrydyzowały w sąsiadujących obszarach matrycy DNA
(zazwyczaj są rozdzielone 1-5 nukleotydową przerwą). Jeśli obie sondy hybrydyzują, to
oba barwniki sÄ… blisko siebie i przeniesienie energii od donora do akceptora powoduje
powstawanie sygnału mierzalnego za pomocą fluorymetru.
Degradujące sondy (zasady działania systemu TaqMan)
System TaqMan wykorzystuje 5 -3 egzonukleolityczną aktywność Taq DNA polimerazy,
dzięki której może podczas reakcji PCR degradować sondę (Lie and Petropoulos, 1998).
Sonda TaqMan jest zazwyczaj oligonukleotydem o długości 20-30 zasad (zazwyczaj ma
Tm o 10oC wyższą niż Tm starterów) i zawiera na końcu 5 fluorescencyjny barwnik
reporterowy a na końcu 3  wygaszacz (Rysunek 4). Ponieważ koniec 3 jest
zablokowany, sonda nie może być wydłużana tak jak starter. Podczas reakcji PCR, sonda
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
9
wiąże się specyficznie z matrycą pomiędzy miejscami wiązania starterów. Kiedy sonda
jest nienaruszona, bliskość barwnika i wygaszacza powoduje supresję fluorescencji
(Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Jeśli sonda zhybrydyzowała z matrycą, to podczas
reakcji PCR, 5 -3 egzonukleolityczną aktywność Taq DNA polimerazy degraduje sondę w
miejscu między reporterem a wygaszaczem. Powoduje to wzrost fluorescencji, co jest
następstwem powielania. Akumulacja produktów PCR jest wykrywana poprzez
monitorowanie wzrostu fluorescencji barwnika reporterowego. Proces ten zachodzi w
każdym cyklu i nie interferuje z ekspotencjalną akumulacją produktu. W odróżnieniu od
sondy FRET, degradująca sonda uwalnia fluorochrom w każdym cyklu dodając nowy
barwnik do uwolnionego poprzednio. W konsekwencji sygnał fluorescencyjny jest mocno
wzmacniany w każdym cyklu. TagMan system używa uniwersalnych parametrów
termicznych i warunków reakcji PCR. Jedynym specyficznym wymaganiem dla
fluorogenicznych sond jest to, aby nie było na końcu 5 zasady G, ponieważ jej obecność
blisko barwnika reporterowego wygasza jego fluorescencjÄ™ nawet po rozszczepieniu.
Rysunek 4. Różne zasady
działania PCR w czasie
rzeczywistym:
I.SYBR green I.
II.sondy FRET (Fluorescence
Resonance Energy
Transfer)
III.5 -3 degradujÄ…ce sondy
TaqMan probes.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
10
Molecular Beacons
Molecular Beacons są to sondy DNA mające strukturę typu szpilki do włosów. Sekwencja
pętli jest komplementarna do specyficznej matrycy, a sekwencje pnia są komplementarne
jedna do drugiej (Rysunek 5) (Tyagi i Kramer, 1996). Końce 5 i 3 sondy są
kowalencyjnie zwiÄ…zane z fluoroforem i wygaszaczem. Kiedy struktura szpilki jest
zamknięta, wówczas fluorofor i wygaszacz są blisko siebie. W tym przypadku wszystkie
fotony emitowane przez fluorofor są absorbowane przez wygaszacz. W obecności
sekwencji komplementarnej, sonda rozwija siÄ™ i hybrydyzuje do matrycy. Fluorofor
zostaje rozdzielony z wygaszaczem i sonda zaczyna fluoryzować.
Rysunek 5. Zasada działania sondy typu Molecular Beacons.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
11
Sondy typu Skorpion
Kolejne sondy są reprezentowane przez rodzinę sond zwanych  Skorpiony . Składają się
one ze specyficznej sekwencji sondy oraz struktury szpilki (Rysunek 6) (Thelwell i in.,
2000).
Fluorofor jest przyłączony do końca 5 i daje sygnał fluorescencyjny, który jest wygaszany
w obrębie konfiguracji szpilki przez fragment przyłączony do końca 3 . Po wydłużeniu
startera sondy Skorpiona, podczas powielania, specyficzna sekwencja sondy jest zdolna
do związania się z sekwencjami komplementarnymi w obrębie tej samej nici DNA.
Hybrydyzacja otwiera pętle w kształcie szpilki do włosów, co powoduje że fluorescencja
nie jest dłużej wygaszana i obserwuje się wzrost sygnału. Zablokowanie reakcji PCR
między starterem a sekwencją pnia zapobiega przypadkowemu odczytaniu sekwencji
pętli, co mogłoby prowadzić do otwarcia struktury szpilki do włosów pod nieobecność
specyficznej sekwencji matrycy. Umieszczenie sondy i startera w jednej czÄ…steczce daje
pewną przewagę nad systemami z sondą homogenną. W przeciwieństwie do systemów
Molecular Beacons, TaqMan czy FRET, metoda Skorpion oprócz starterów nie wymaga
osobnej sondy.
Rysunek 6. Zasada działania sond typu Skorpion.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
12
Sondy TaqMan MGB
Sonda MGB (Minor Groove Binder  przyłączająca się do mniejszej bruzdy DNA) jest
małą cząsteczką w kształcie półksiężyca, która pasuje dokładnie do mniejszej bruzdy
dupleksu DNA (Kutyavin i in., 2000). W sondach TaqMan grupa MGB jest
przyłączona do końca 3 razem z barwnikiem wygaszającym (Rysunek 7). Kiedy
sonda TaqMan hybrydyzuje, grupa MGB stabilizuje przyłączanie poprzez zagięcie do
mniejszej bruzdy dupleksu DNA utworzonego pomiędzy sondą a sekwencją matrycy.
Stabilizacja jest daleko bardziej efektywna, gdy dupleksy pasują dokładnie (tzn. gdy
nie ma żadnych błędnych parowań). Oprócz wzmożonej siły dyskryminacyjnej,
wzrost stabilności związany jest z tym, że sondy TaqMan MGB są bardzo krótkie
(zazwyczaj 13-20mery) w porównaniu do standardowych sond TaqMan (zazwyczaj
18-40mery). Sondy TaqMan MGB mają kilka przewag w ilościowym PCR,
szczególnie w analizie multipleksowej. Poprawiona wydajność spektralna pozwala na
większą precyzję i zgodność między indywidualnymi analizami, a większa
specyficzność hybrydyzacji umożliwia większą dyskryminację matrycy. Co więcej,
krótsza sonda ułatwia przeprowadzenie analizy, gdyż pasuje ona do większej ilości
miejsc w obrębie krótszego regionu matrycy. Rozmiar amplikonu może być
zredukowany do minimum poprzez użycie krótszych sond MGB, co w konsekwencji
może poprawić zgodność między analizami.
Rysunek 7. Zasada działania sond MGB.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
13
Zasady ilościowego oznaczania metodą PCR w czasie
rzeczywistym (real-time PCR)
Ilościowe oznaczanie względne
Zawartość GMO w próbce może być wyrażona jako ilość materiału genetycznie
zmodyfikowanego w stosunku do całkowitej ilości materiału. Aby określić tę wartość przy
użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym, konieczne jest określenie ilości sekwencji
endogennego genu referencyjnego (używanego jako normalizator) oraz ilości
specyficznych sekwencji GMO. Jako geny referencyjne powinny być wybrane geny
gatunkowo specyficzne, obecne jako pojedyncze kopie w genomie haploidalnym,
reprezentatywne dla różnych linii tego samego gatunku i będące powielane podczas
analizy tak jak GMO (chociaż to głównie zależy od dobrego zaprojektowania starterów i
sondy). We względnym oznaczaniu ilości GMO powstaje problem wynikający z
interpretacji procentowej zawartości GMO, dlatego procentowa zawartość GM może być
określana jako waga czystego modyfikowanego składnika do całkowitej wagi samego
składnika (tj. waga kukurydzy GM do całkowitej wagi wszystkiej kukurydzy zawartej w
próbce). Z analitycznego punktu widzenia odpowiednim sposobem kalkulowania
zawartości procentowej GMO jest podawanie ilości sekwencji GMO w stosunku do ilości
sekwencji specyficznych gatunkowo. Ta definicja jednak w niewystarczający sposób
charakteryzuje linie GMO; dlatego w interpretacji wyników trzeba wziąć pod uwagę
dodatkowo następujące parametry:
a) ploidalność danego zdarzenia transformacyjnego. Jest możliwe, że roślina otrzymana
w wyniku danego zdarzenia transformacyjnego ma inną ploidalność od wyjściowej
rośliny dzikiej wt (np. tertaploid zamiast diploidu)
b) zygotyczność rośliny otrzymanej w wyniku zdarzenia transformacyjnego. Cecha GM
może być homozygotyczna lub heterozygotyczna.
c) LiczbÄ™ insercji pojedynczego sztucznego konstruktu na genom haploidalny. Jeden
konstrukt może być wstawiony jako pojedyncza kopia w genomie haploidalnym bądz

w wielu kopiach.
Punkt c. może być ominięty przez zaprojektowanie systemu starter-sonda obejmującego
rejon graniczny wstawienia konstruktu do genomu. Ponieważ sekwencje graniczne są
unikalne daje to podwójną korzyść, gdyż taki system jest specyficzny dla zdarzenia
transformacyjnego i wyklucza z kalkulacji wielokrotne insercje tego samego konstruktu.
Punkty a. i b. są omijane empirycznie przez użycie materiałów referencyjnych
homogennych z próbką (np. materiał referencyjny w postaci mączki kukurydzy do
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
14
ilościowego oznaczania mączki kukurydzy). Alternatywnie, standardy ilościowe inne niż
certyfikowane materiały referencyjne (np. sekwencje klonowanego DNA lub mieszanina
genomowego DNA) powinny być kalibrowane wobec materiałów referencyjnych, aby
skorygować rozbieżności w ilościowym oznaczeniu. Ogólnie akceptowanym sposobem
rozwiązania tego problemu w odniesieniu do punktów a) i b) jest wyrażenie procentu
GMO w odniesieniu do genomów haploidalnych. Podczas opracowywania metod ten
aspekt ilościowego oznaczenia powinien być wzięty pod uwagę w każdym przypadku,
ponieważ na limit detekcji (LOD) i limit oznaczenia ilościowego (LOQ) wpływa realna
liczba kopii, która jest oznaczana.
Projektowanie eksperymentu ilościowego oznaczania GMO.
Projektowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym musi obejmować następujące
komponenty:
- jeden system PCR zaprojektowany do detekcji sekwencji DNA GMO specyficznych
- drugi system PCR zaprojektowany do detekcji referencyjnych sekwencji endogennych,
będących gatunkowo specyficznymi i odpowiednimi do zastosowania jako normalizator w
obliczaniu względnej zawartości GM.
- krzywą standardową zarówno dla specyficznych sekwencji GMO jak i dla referencyjnych
sekwencji endogennych. Dla każdej eksperymentalnej próbki ilość specyficznych
sekwencji GMO jak i referencyjnych sekwencji endogennych jest wyliczana z
odpowiedniej krzywej standardowej. Aby uzyskać względną zawartość specyficznych
sekwencji GMO, ich ilość jest normalizowana poprzez ilość referencyjnych sekwencji
endogennych. Zgodnie z wymogami statystycznymi krzywa standardowa powinna
zawierać przynajmniej cztery punkty o różnym stężeniu. Każdy punkt krzywej
standardowej i każda próbka powinna być nakładana przynajmniej w trzech
powtórzeniach.
Oprócz tego, zarówno podczas ilościowego oznaczania genu referencyjnego jak i GMO
musi być dodawana kontrola negatywna reakcji (NTC  no template control). Można
zastosować też inne kontrole (np. negatywna kontrola DNA, pozytywna kontrola DNA).
Wreszcie, ilościowe oznaczenie genu referencyjnego i specyficznych sekwencji GMO
powinny zachodzić podczas jednego przebiegu reakcji PCR (współpowielanie), a nie w
osobnych przebiegach, co pozwala uniknąć możliwych błędów statystycznych pomiędzy
różnymi eksperymentami.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
15
Multipleksowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym
W zależności od odczynników i aparatury zastosowanej do oznaczania ilościowego,
możliwe jest takie zaprojektowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym, aby
przeprowadzić ilościowe oznaczenie sekwencji referencyjnych i GMO oddzielnie w
odrębnych probówkach lub w tych samych probówkach jako reakcję multipleksową. Oba
układy mają wady i zalety: reakcja multipleksowa oszczędza czas i odczynniki (w jednym
eksperymencie możliwe jest analizowanie podwójnej liczby próbek), unikając w ten
sposób błędów pomiędzy pomiarem genów referencyjnych i GMO, ponieważ reakcja
zachodzi w tej samej probówce, ale jest ona mniej czuła (w odniesieniu do LOQ) z
powodu interferencji między obiema reakcjami i różnym zużyciem reagentów w obu
reakcjach. Z drugiej strony, rozdzielone reakcje PCR, w których mierzy się ilość genu
referencyjnego i GMO są bardziej czułe w odniesieniu do LOQ, lecz wymagają podwójnej
ilości reagentów i studzienek na płytce do PCR i są bardziej narażone na ryzyko np.
błędu pipetowania niż gdy mierzona jest jedna próbka. Zastosowanie różnych barwników
reporterowych dla sond TaqMan stwarza możliwość detekcji powielania więcej niż jednej
matrycy w tej samej probówce. Barwniki reporterowe FAM i VIC są rozróżnialne,
ponieważ charakteryzują się maximum emisji przy różnych długościach fal. Do
przeprowadzenia multipleksowej reakcji TaqMan można zastosować różne barwniki
emitujące różne długości fal (FAM, TET, VIC i JOE). Barwnik TAMRA jest stosowany w
sondzie jako wygaszasz, natomiast ROX jest w mieszaninie reakcyjnej barwnikiem
pasywnym. W celu uzyskania lepszych wyników rekomendowana jest kombinacja
barwników FAM (DNA docelowy) i VIC (kontrola endogenna), ponieważ wykazują
największe różnice w maximum emisji. Z drugiej strony JOE i VIC nie powinny być
stosowane razem. Multipleksowa reakcja TaqMan może być przeprowadzona na
aparatach ABI PRISM 7700, 7900, 7500, 7300 i 7000, ponieważ te aparaty są zdolne do
detekcji kilku barwników wykazujących emisję przy różnych długościach fal.
Graficzna analiza danych otrzymanych w reakcji PCR w czasie rzeczywistym
W czasie reakcji PCR zbierane sÄ… dane fluorescencyjne i konstruowany jest wykres
zależności wielkości sygnału od liczby cykli (lub czasu). Zazwyczaj wykres jest
przedstawiany w skali półlogarytmicznej. W reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyróżnia
się trzy różne fazy: pierwsza obejmująca na wykresie słabe fluktuacje odpowiadające
sygnałowi tła, druga ekspotencjalna faza z wykresami wzrastającymi równolegle i trzecia
faza, gdzie wykresy osiÄ…gajÄ…  plateau (Rysunek 8).
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
16
Rysunek 8. Reakcja PCR w czasie rzeczywistym. Zaznaczono typowe fazy reakcji.
Istotą reakcji PCR w czasie rzeczywistym jest to, że oznaczanie ilościowe zachodzi nie w
punkcie końcowym reakcji PCR (plateau), ale na etapie, gdy ekspotencjalny wzrost ilości
powielanego DNA (wartość Rn) osiąga poziom znacznie wyższy od sygnału tła. Taki
sposób pomiaru znacznie poprawia dokładność oznaczenia ilościowego, ponieważ
wówczas istnieje bezpośrednia korelacja między ilością początkową matrycy a cyklem,
przy którym powielanie zaczyna mieć charakter ekspotencjalny. W reakcji PCR w czasie
rzeczywistym cykl progowy (CT) jest zdefiniowany eksperymentalnie jako cykl, przy
którym sygnał fluorescencyjny osiąga średnią sygnałów fluorescencyjnych mierzonych
pomiędzy trzecim a piętnastym cyklem plus odchylenie standardowe. Im większa jest
początkowa ilość genomowego DNA, tym wcześniej jest wykrywany produkt powstający
w reakcji PCR i tym niższa jest wartość CT. W praktyce, wybór linii progowej
determinującej wartość CT należy często do operatora i jest jednym z subiektywnych
elementów PCR w czasie rzeczywistym. Linia progowa powinna być umieszczona
powyżej jakichkolwiek fluktuacji linii bazowej i w obrębie fazy ekspotencjalnego wzrostu,
który po przetransformowaniu do skali logarytmicznej wygląda liniowo (wszystkie wykresy
są równoległe). W niektórych przypadkach linia progowa powinna być umieszczona na
takim poziomie, gdzie wykresy, dla kolejnych powtórzeń, zaczynają być najbardziej
zgodne. W rzeczywistości, czasami zdarza się, że wykresy dla powtórzeń w bardzo
wczesnym etapie fazy ekspotencjalnej, wykazują rozbieżność, która maleje lub całkowicie
zanika podczas przebiegu reakcji.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
17
Nachylenie krzywej odzwierciedla wydajność reakcji. Aby to nachylenie było wskaz
nikiem
rzeczywistej wydajności (a nie sygnał fluorescencyjny) należy obserwować punkt
przegięcia krzywej. Jest to punkt początkowy fazy linearnej i reprezentuje największe
tempo zmian wzdłuż całej krzywej.
Kalkulacja zawartości GMO
Wyjściowymi danymi reakcji PCR w czasie rzeczywistym jest "Rn będąca różnicą
pomiędzy Rn+ (sygnał fluorescencyjny obejmujący wszystkie komponenty) i Rn-
(sygnał tła reakcji  linia bazowa lub odczyt dla próbki NTC).
Zawartość GMO w próbce może być określona dwoma sposobami:
1. Wykreślanie dwu krzywych standardowych opartych o różne ilości DNA
- pierwsza krzywa z systemem ilościowym specyficznym dla genu
referencyjnego
- druga krzywa z systemem ilościowym specyficznym dla matrycy GM
Dla każdej próbki ilość genu specyficznego i genu referencyjnego są określane przez
interpolację krzywej standardowej. Zawartość procentowa GMO DNA jest obliczana
jako stosunek ilości sekwencji GM do ilości sekwencji genu referencyjnego:
(GM/gen referencyjny x 100).
Należy wziąć również pod uwagę to, że analizowane próbki muszą mieścić się w
granicach obu krzywych standardowych. Próbki wychodzące poza krzywe muszą być
odrzucane, ponieważ mogą powodować błędy w ilościowym oznaczeniu.
2. Porównawcza metoda CT (""CT): W metodzie tej porównuje się względne ilości
sekwencji GMO w odniesieniu do sekwencji genu referencyjnego. KrzywÄ…
standardową uzyskuje się przez zastosowanie serii próbek o różnych znanych
zawartościach GMO (np. certyfikowane materiały referencyjne z IRMM). W rezultacie
otrzymuje się jedną krzywą standardową wartości (""CT) ("CT = CT refencyjnego-CT GMO).
Zawartość GMO otrzymuje się przez obliczenie wartości "CT próbki i porównanie jej
z wartościami otrzymanymi dla standardów. Aby ta metoda była zadawalająca,
wydajności reakcji powielania dla obu systemów PCR (dla GMO i genu
referencyjnego) powinny być podobne. Metodą kontrolującą wydajności reakcji jest
obserwacja jak zmienia się "CT (różnica pomiędzy dwoma wartościami obu reakcji
PCR dla tej samej początkowej ilości matrycy) w zależności od rozcieńczeni matrycy.
Jeśli wydajności dla dwu amplikonów są prawie równe, wykres logarytmu wyjściowej
ilości od "CT powinien być linią prawie horyzontalną (nachylenie <0.10). Oznacza to,
że oba systemy PCR pracują z podobną wydajnością w zakresie początkowej ilości
matrycy. Jeśli wykres wykazuje niejednakową wydajność, do ilościowego oznaczania
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
18
GMO powinna być użyta metoda krzywej standardowej. Zakres dynamiczny powinien
być określony zarówno dla (1) minimalnego i maksymalnego stężenia matrycy, w
zakresie w jakim otrzymamy precyzyjne wyniki i (2) minimalnego i maksymalnego
stosunku ilości obu oznaczanych genów, dla których wyniki są precyzyjne. W
konwencjonalnym kompetytywnym RT-PCR, zakres dynamiczny jest ograniczony do
stosunku GMO/kompetytor od około 10:1 do 1:10 (największa dokładność jest
uzyskiwana dla stosunku 1:1). W PCR w czasie rzeczywistym jest możliwe uzyskanie
dużo szerszego zakresu dynamicznego.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
19
Literatura
Regulation (EC) 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22
September 2003 on genetically modified food and feed. OJ L 268, 18.10.2003, pp. 1-23.
Regulation (EC) 1830/2003 of the European Parliament and of the Council of 22
September 2003 concerning the traceability and labelling of genetically modified
organisms and the traceability of food and feed products produced from genetically
modified organisms and amending Directive 2001/18/EC. OJ L 268, 18.10.2003, pp 24-
28.
Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified organisms in foods.
Trends in Biotechnology 5, 215-23.
Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann Phys
(Leipzig) 2, 55-75.
Giacca, M., Zentilin, L., Norio, P., Diviacco, S., Dimitrova, D., Contreas, G., Biamonti, G.,
Perini, G., Weighardt, F., Riva, S. and Falaschi, A. (1994). Fine mapping of a replication
origin of human DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA 91, 7119-23.
Hardegger, M., Brodmann, P. and Hermann, A. (1999). Quantitative detection of the 35S
promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR. European Food
Research Technology 209, 83 87.
Haugland, R.P. (2002). The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,
Ninth Edition. Molecular Probes, Inc. http://www.probes.com
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous amplification
and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10, 413 417.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993). Kinetic PCR: Real-time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, 1026 1030.
Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S., Singer,
M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W., Meyer, R.B.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10
Wykrywanie GMO metodą ilościowego PCR
20
and Hedgpeth, J. (2000). 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence
specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Research 28, 655-61.
Lakowicz, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New
York, chapter 2.
Lie, Y. S. and Petropoulos, C. J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5'
nuclease assays. Current Opinion Biotechnol 9, 43-48.
Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, J. and Hübner, P. (1998). Quantitative competitive PCR for
the detection of genetically modified soybean and maize. Zeitschrift für Lebensmittel-
Untersuchung und -Forschung A 207, 207 213.
Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. Zeitschrift für Lebensmittel-
Untersuchung und -Forschung A and Brown, T. (2000). Mode of action and application of
Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Research 28, 3752-3761.
Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon
hybridisation. Nature Biotechnology 14, 303-308.
Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. and Brignon, P. (1999). Real-time quantitative
PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready soybean in
some representative foods. Journal of Agricultural Food Chemistry 47, 5261 5266.
Badanie próbek żywności na obecność Genetycznie Zmodyfikowanych Organizmów Rozdział 10