5.1

Oznaczanie aktywności fotosystemu II

i układu rozszczepiającego wodę.

Hamowanie fotosyntetycznego transportu

elektronów przez DCMU

Wstęp.

Fotosystem II (PSII) jest jednym z

dwóch kompleksów barwnikowo - białkowych
aparatu fotosyntetycznego w których następuje
ostateczne przekształcenie energii wzbudzenia
dostarczonej przez foton na energię pary
ładunków: elektron - kation. Elektron wybity z
centrum reakcji PS II jest przenoszony na
plastochinon i dalej a powstałą "dziurę
elektronową" zajmuje elektron pochodzący z
H20. W procesie rozkładu wody na O2,

elektrony i protony bierze udział układ
rozszczepiają-cy wodę, zawierający jony Mn o
cyklicznie zmieniającej się wartościowości.
(Uwaga dot. nazewnictwa: nazwy "fotosystem
II" używa się w dwóch znaczeniach: albo dla
kompleksu chlorofilowo-białkowego
przenoszącego elektrony od układu
rozszczepiającego wodę do plastochinonu albo
dla PSII w poprzednim rozumieniu wraz z
kompleksem rozszczepiającym wodę. Tutaj

określenie "PSII" używane jest zawsze w
pierwszym znaczeniu.)

Łańcuch reakcji przekazywania

elektronów od wody do plastochinonów (i
następnie dalsze procesy fazy świetlnej
fotosyntezy ) można traktować jako szereg
reakcji redox. Jedną z metod mierzenia
szybkości przekazywania elektronów w
reakcjach redox jest pomiar zmian stężenia
utlenionego/zredukowanego donora lub
akceptora elektronów w czasie, w warunkach
umożliwiających reakcję.

Dichlorometylomocznik (DCMU) jest

inhibitorem kompetycyjnym transportu
elektronów między PSII a plastochinonem.
Hamuje linearny fotosyntetyczny transport
elektronów, konkurując z plastochinonem o
miejsce, w którym ten ostatni zostaje
zredukowany przez wzbudzony PSII.

Zasada oznaczenia.

Dichlorofenoloindofenol (DCIP),

sztuczny akceptor elektronów z PSII, w formie
zredukowanej jest bezbarwny a w formie
utlenionej - intensywnie niebieskofioletowy
(pochłania światło przy

λ

max = 580 - 600 nm

(zależnie od pH)). Szybkość zanikania
błękitnego zabarwienia DCIP (spadek
absorbancji w czasie) będzie więc miarą
szybkości redukcji tego związku. Forma
utleniona DCIP jest akceptorem elektronów z
PSII, wobec czego można oznaczać szybkość
przenoszenia elektronów od wody przez układ
rozszczepiający wodę i fotosystem II na
podstawie zmian absorbancji DCIP w
zawiesinie chloroplastów. W wypadku
obecności w zawiesinie chloroplastów DCIP
oznaczona zostanie albo aktywność układu
rozszczepiającego wodę albo PSII - w
zależności od tego, który z tych procesów
będzie zachodził wolniej (będzie czynnikiem
limitującym). Niezależnie od tego, światło

wzbudzające fotosystem musi wysycać reakcję,
gdyż w innym wypadku mierzona będzie nie
aktywność maksymalna ale zależna od
intensywności światła.

Oznaczenie aktywności samego PSII

można przeprowadzić, dodając do powyżej
opisanego układu sztuczny donor elektronów
dla PSII, np. difenylkarbazyd (DPC), dzięki
czemu redukcja DCIP przez fotosystem II nie
będzie limitowana szybkością dostarczania
elektronów z wody. DCMU hamuje
przekazywanie elektronów z PS II do DCIP,
wiążąc się z miejscem, w którym następuje
redukcja DCIP.

Ponieważ redukcja DCIP przez DPC

może zachodzić powoli również bez udziału
przenośników, należy określić "tło" reakcji
obserwując zmiany absorbancji w warunkach
w których PSII nie działa.

5.2

Wykonanie pomiarów.

Przygotowanie próbki do pomiaru.

Rozcieńczyć buforem E do

stężenia ok. 10

µ

g/ml taką ilość

zawiesiny błon tylakoidów, aby
uzyskać jej ok. 7 ml. Uzyskaną próbkę
nadal przechowywać w lodzie i w
ciemności. Oznaczyć stężenie

chlorofilu po rozcieńczeniu

, biorąc 200

µ

l zawiesiny i 800

µ

l acetonu na każdą próbkę

(nie rozcieńczać już buforem!); dalej
postępować jak opisano w opisie izolacji błon
tylakoidów.

Oznaczenie aktywności PSII wraz z układem rozszczepiającym wodę.

2 ml otrzymanej zawiesiny umieścić w
kuwecie pomiarowej; dodać taką ilość
roztworu DCIP aby absorbancja tego
związku przy

λ

=590 nm wynosiła ok.

0.5. Zmierzyć absorbancje próbki po

dodaniu DCIP, a następnie próbkę
oświetlać przez 10s i zmierzyć jej
absorbancję. Pomiar powtórzyć po
dalszych 10, 20, 40 i 60s oświetlania.

Oznaczenie aktywności PSII .

Do próbki przygotowanej jak w
poprzednim doświadczeniu dodać
10

µ

l nasyconego r-ru DPC w

metanolu. Pomiary wykonać jak
opisano wyżej.

Hamowanie aktywności PS II przez DCMU.

Do próbek przygotowanych jak w obu
poprzednich doświadczeniach dodać

roztworu DCMU do stężenia 10

µ

M.

Pomiary wykonać jak opisano wyżej.

Opracowanie wyników.

Na podstawie otrzymanych wyników oznaczyć szybkość przekazywania elektronów z H2O lub DPC do

DCIP przez PSII (i w pierwszym przypadku, przez układ rozszczepiający wodę). Stwierdzić która z
reakcji była czynnikiem limitującym. Szybkość przenoszenia elektronów określić w

µ

mol/min i

µ

mol

chlorofilu (lub jednostkach pochodnych) i jako ilość elektronów na s i cząsteczkę chlorofilu.
Określić procent zahamowania reakcji przez DCMU oraz szybkość przekazywania elektronów z DPC
do DCIP w obecności DCMU.
Molowy współczynnik absorbancji DCIP wynosi 16000 JAbs590 * .cm * M.

Reakcja redukcji DCIP przebiega wg równania:

= N

=

O

Cl

Cl

OH

2H +2e

+

-

OH

Cl

Cl

OH

N

H

Stężenie roztworów podstawowych wynosi: DCIP: 10 mM w buforze E, DPC: 100 mM w metanolu,
DCMU: 10 mM w mieszaninie etanol/aceton 1:1.

AW