3.1
3. Cukrowce
3. Cukrowce
3. Cukrowce
3. Cukrowce
1. Analiza jakościowa cukrów prostych
1. Analiza jakościowa cukrów prostych
1. Analiza jakościowa cukrów prostych
1. Analiza jakościowa cukrów prostych
Do wykrywania i rozróżniania cukrowców wykorzystuje się reakcje oparte na
następujących własnościach tych związków:
a) odwodnione pod wpływem działania mocnych kwasów nieorganicznych
cukry przekształcają się w pochodne furfuralowe (furfural, metylenofurfural,
hydroksymetylenofurfural ), które w wyniku kondensacji z fenolami,
chinonami, aminami aromatycznymi tworzą produkty o charakterystycznym
zabarwieniu.
b) cukry posiadające wolną grupę karbonylową lub aldehydową wykazują silne
właściwości redukujące, dając typowe reakcje utlenienia i redukcji
1.1. Reakcja charakterystyczna dla wszystkich cukrów - odczyn Molischa
1.1. Reakcja charakterystyczna dla wszystkich cukrów - odczyn Molischa
1.1. Reakcja charakterystyczna dla wszystkich cukrów - odczyn Molischa
1.1. Reakcja charakterystyczna dla wszystkich cukrów - odczyn Molischa
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Pod wpływem stężonego H2SO4 pentozy i heksozy przechodzą
odpowiednio w furfural lub 5-hydroksymetylenofurfural. Związki te tworzą z
α
-naftolem połączenia triarylometanowe o czerwonofiołkowym zabarwieniu.
Odczyn ten dają wszystkie cukry, zarówno rozpuszczalne jak i
nierozpuszczalne. W przypadku tych ostatnich zabarwienie występuje na
granicy zetknięcia fazy stałej z fazą ciekłą. Reakcja ta przebiega o wiele łatwiej
z ketozami niż z aldozami.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Do 0.5 ml roztworu cukru dodać dwie krople świeżo
przygotowanego 10% alkoholowego roztworu
α
-naftolu i dokładnie
wymieszać. Zawartość probówki podwarstwić ostrożnie 0.5 ml stężonego
H2SO4. Na granicy obu warstw wystepuje czerwonofiołkowe zabarwienie.
Uwaga
Uwaga
Uwaga
Uwaga: Wystąpienie zielonego pierścienia jest niecharakterystyczne i pochodzi
od różnych zanieczyszczeń odczynników użytych do tej próby.
1.2. Reakcja charakterystyczna dla cukrów obojętnych - metoda antronowa
1.2. Reakcja charakterystyczna dla cukrów obojętnych - metoda antronowa
1.2. Reakcja charakterystyczna dla cukrów obojętnych - metoda antronowa
1.2. Reakcja charakterystyczna dla cukrów obojętnych - metoda antronowa
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Pod wpływem stężonego H2SO4 cukry obojętne ulegaja odwodnieniu
do furfuralu lub jego pochodnych, a te z kolei tworzą z antronem połączenia
kompleksowe o barwie zielonej. Aminocukry dają w tej reakcji odczyn ujemny.
Metoda ta jest wykorzystywana do ilościowego oznaczania cukrów.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Do suchej probówki odmierzyć 0.5 ml roztworu glukozy, a
nastepnie dodać 0.5 ml 0,2% roztworu antronu w stężonym kwasie siarkowym
i dokładnie wytrząsnąć. Pojawia się zielone zabarwienie.
1.3. Reakcja charakterystyczna dla ketocukrów - odczyn Seliwanowa
1.3. Reakcja charakterystyczna dla ketocukrów - odczyn Seliwanowa
1.3. Reakcja charakterystyczna dla ketocukrów - odczyn Seliwanowa
1.3. Reakcja charakterystyczna dla ketocukrów - odczyn Seliwanowa
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Pierwszy etap polega na przeprowadzeniu ketocukru w pochodną
furfuralową. Powstały 5-hydroksymetylenofurfural ulega kondensacji z
rezorcyną dajac produkt o barwie czerwonowiśniowej. Dodatni odczyn
Seliwanowa dają wszystkie ketopentozy, ketoheksozy i oligosacharydy
zawierające ketozy. Poprawny wynik reakcji zależy od zachowania ściśle
określonych warunków: stężenia użytego kwasu oraz czasu ogrzewania. 12%
HCl i 30 sek ogrzewania wystarcza do przeprowadzenia ketoz w pochodną
furfuralową, natomiast aldozy w tych warunkach pozostają nie zmienione.
Użycie kwasu o wyższym stężeniu lub wydłużenie czasu ogrzewania powoduje
że również aldozy dają dodatni odczyn Seliwanowa.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Do 2 ml roztworu fruktozy dodać 1 ml stężonego HCl (końcowe
stęż. HCl=12%) ogrzewać we wrzącej
wrzącej
wrzącej
wrzącej łaźni wodnej przez 30 sek. Mieszaninę
schłodzić i podzielić na dwie równe części. Do jednej z nich dodać parę
kryształków rezorcyny i zawartość obu probówek ogrzewać do wrzenia.
Porównać zabarwienie obu płynów. W probówce do której została dodana
rezorcyna, występuje czerwonowiśniowe zabarwienie lub osad tej samej barwy
rozpuszczalny w alkoholu. Wykonać odczyn z roztworem fruktozy i glukozy i
porównać wyniki.
Uwaga.
Uwaga.
Uwaga.
Uwaga. W probówce bez rezorcyny również występuje słaboróżowe
zabarwienie, ponieważ inne związki organiczne (niecukrowce) mogą sie barwić
3.2
pod wpływem ogrzewania z HCl. Dopiero porównanie barwy w obu
probówkach pozwala na stwierdzenie obecności cukru w badanej próbce.
1.4. Reakcja charakterystyczna dla pentoz - odczyn Biala
1.4. Reakcja charakterystyczna dla pentoz - odczyn Biala
1.4. Reakcja charakterystyczna dla pentoz - odczyn Biala
1.4. Reakcja charakterystyczna dla pentoz - odczyn Biala
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Pierwszy etap polega na przeprowadzeniu pentozy w furfural, który w
obecności jonów Fe+3 tworzy z orcyną (2,3-dihydroksy-5-metylobenzen)
produkt o barwie zielonej. 5-hydroksymetylofurfural (produkt odwodnienia
heksoz) reaguje znacznie słabiej z orcyną dając produkt o zabarwieniu
żółtobrązowym.
Wykonanie:
Wykonanie:
Wykonanie:
Wykonanie: Odmierzyć do probówki 0.3 ml odczynnika orcynowego (roztwór
orcyny i FeCl3 w HCl) dodać 0.5 ml roztworu arabinozy i ogrzewać we wrzacej
łaźni wodnej przez 5 min. Pojawia się zielone zabarwienie.
1.5. Odczyny redukcyjne
1.5. Odczyny redukcyjne
1.5. Odczyny redukcyjne
1.5. Odczyny redukcyjne
Cukry w roztworach obojętnych lub słabo kwaśnych wystepują w formach
pierścieniowych (wiązanie półacetalowe). W środowisku zasadowym lub silnie
kwaśnym formy pierścieniowe przechodzą w łańcuchowe i powstają wolne
grupy aldehydowe lub ketonowe. Cukry zachowują się jak aldehydy lub
ketony, wykazując charakterystyczne własności redukcyjne. Własności te
stanowią podstawę wielu metod analitycznych służących do wykrywania i
ilościowego oznaczania cukrów. Najbardziej znane próby polegają na redukcji
przez cukier kationów metali, np. Cu+2, Bi+3, Ag+1. Cukry redukując jony
metali same utleniają się do kwasów. Aldozy utleniają się do kwasów
aldonowych (utleniona grupa aldehydowa). Utlenianie ketoz jest bardziej
skomplikowane; w wyniku tego procesu powstaje mieszanina kwasów.
Produkty utleniania fruktozy przedstawia rys.1.
rys.1.
1.5.1. Odczyn Fehlinga
1.5.1. Odczyn Fehlinga
1.5.1. Odczyn Fehlinga
1.5.1. Odczyn Fehlinga
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: W przypadku odczynu Fehlinga redukcji ulega miedź z +2 do +1
stopnia utlenienia. Używa się odczynnika Fehling I, który zawiera CuSO4 oraz
odczynnika Fehling II, który zawiera NaOH i winian sodowo-potasowy.
Winian sodowo-potasowy zapobiega wytrącaniu się osadu Cu(OH)2, co może
nastąpić przy małej ilości cukru. Sól ta wiąże jony Cu+2 w kompleksową sól
kwasu winowego.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Zmieszać 20 ml roztworu roztworu Fehling I i 20 ml roztworu
Fehling II. Do probówki nalać 0.5 ml roztworu badanego cukru i 0.5 ml
przygotowanej mieszaniny; ogrzać do wrzenia. Występuje zabarwienie lub
brunatnoczerwony osad wydzielonego Cu2O.
1.5.2. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących - odczyn
1.5.2. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących - odczyn
1.5.2. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących - odczyn
1.5.2. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących - odczyn
Barfoeda
Barfoeda
Barfoeda
Barfoeda
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Odczyn ten stanowi modyfikację odczynu Fehlinga. Redukcję jonów
miedzi prowadzi się w środowisku słabo kwaśnym (rozcieńczony roztwor
kwasu mlekowego), w którym redukcja przebiega wolniej niż w środowisku
zasadowym. Ponadto w tych warunkach redukcja jonów miedzi zachodzi
3.3
znacznie szybciej w obecności cukrów prostych niż w obecności dwucukrów
redukujących, a więc dobranie odpowiednich warunków reakcji pozwala na
rozróżnienie tych dwóch grup związków.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie. Do jednej probówki odmierzyć 0.4 ml roztworu glukozy, a do
drugiej 0.4 ml roztworu maltozy. Do obu probówek dodać po 1 ml odczynnika
Barfoeda i ogrzewać przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej. W obecności
cukrów prostych wypada po tym czasie czerwony osad Cu2O, natomiast w
obecności dwucukrów redukujących osad pojawia się dopiero po 15-20 min
ogrzewania.
2. Analiza jakościowa polisacharydów
2. Analiza jakościowa polisacharydów
2. Analiza jakościowa polisacharydów
2. Analiza jakościowa polisacharydów
2.1. Hydroliza skrobi
2.1. Hydroliza skrobi
2.1. Hydroliza skrobi
2.1. Hydroliza skrobi
Podczas ogrzewania w środowisku kwaśnym skrobia ulega hydrolizie do
glukozy. Proces ten przebiega stopniowo poprzez stadium dekstryn oraz
stadium maltozy i izomaltozy. Proces hydrolizy można rejestrować przez
określanie własności redukujących (pojawiających się w miarę uwalniania
maltozy, izomaltozy i glukozy) oraz przez barwną reakcję z jodem (zanikającą
w miarę ubywania skrobi).
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Do probówki odmierzyć 2.5 ml 1% roztworu skrobi, dodać 1 ml
1M
1M
1M
1M roztworu kwasu siarkowego. Ogrzewać na łaźni wodnej przynajmniej przez
30 min. Po tym czasie zawartość ostudzić i zobojętnić Na
2
CO
3
+ NaOH.
Rozdzielić do dwóch probówek. Przeprowadzić reakcję Fehlinga oraz reakcję z
jodem na hydrolizacie i na wyjściowym roztworze skrobi. Porównać wyniki.
2.2. Hydroliza celulozy
2.2. Hydroliza celulozy
2.2. Hydroliza celulozy
2.2. Hydroliza celulozy
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada:W obecności mocnych kwasów i w podwyższonej temperaturze
celuloza ulega hydrolizie. Ostatecznym produktem hydrolizy tego
polisacharydu jest glukoza.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: W probówce wymieszać 9 ml wody i 1 ml stężonego
stężonego
stężonego
stężonego kwasu
siarkowego (pamiętaj o kolejności!)
(pamiętaj o kolejności!)
(pamiętaj o kolejności!)
(pamiętaj o kolejności!) a następnie umieścić w niej parę skrawków
bibuły lub papieru. Wykonać także próbkę porównawczą (bez kwasu i/lub bez
ogrzewania). Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez co
najmniej 60 min. Po upływie tego czasu nadsącze zobojętnić Na
2
CO
3
+ NaOH i
przeprowadzić reakcję Fehlinga.
2.3. Odróżnianie papieru bezdrzewnego od drzewnego
2.3. Odróżnianie papieru bezdrzewnego od drzewnego
2.3. Odróżnianie papieru bezdrzewnego od drzewnego
2.3. Odróżnianie papieru bezdrzewnego od drzewnego
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Papier gazetowy zawiera pentozany (polimery pentoz), które z
floroglucyną i HCl dają wiśniowe zabarwienie.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Kawałek papieru gazetowego zwilżyć kroplą 2% etanolowego
roztworu floroglucyny i kroplą stężonego roztworu HCl. Papier zabarwia się na
wiśniowo. Reakcja z bibułą filtracyjną wypada ujemnie.
4. Kwasy nukleinowe
4. Kwasy nukleinowe
4. Kwasy nukleinowe
4. Kwasy nukleinowe
Odróżnianie RNA od DNA.
Odróżnianie RNA od DNA.
Odróżnianie RNA od DNA.
Odróżnianie RNA od DNA.
1. Metoda oparta na reakcji z orcyną
1. Metoda oparta na reakcji z orcyną
1. Metoda oparta na reakcji z orcyną
1. Metoda oparta na reakcji z orcyną
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada. Wolne oraz związane w nukleozydach pentozy podczas ogrzewania ze
stężonym HCl przechodzą w furfural, który w obecności jonów Fe+3
kondensuje z orcyną, tworząc związek barwy zielonej. W warunkach
przeprowadzonej próby dezoksyryboza reaguje 10-krotnie słabiej niż ryboza, a
więc dla DNA odczyn wypada ujemnie.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie. Do dwóch probówek zawierajacych po 0.5 ml 0,1% roztworów
RNA lub DNA dodać po 0.5 ml odczynnika orcynowego i umieścić we wrzącej
łaźni wodnej na 15 min. W probówce zawierającej RNA pojawia się zielone
zabarwienie.
3.4
2. Metoda oparta na reakcji z difenyloaminą
2. Metoda oparta na reakcji z difenyloaminą
2. Metoda oparta na reakcji z difenyloaminą
2. Metoda oparta na reakcji z difenyloaminą
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada. Wolna i związana dezoksyryboza tworzy z difenyloaminą związek
barwny. W obecności RNA uzyskuje się ujemny wynik.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie. Do dwóch probówek zawierających po 0.5 ml 0,1% roztworów
RNA i DNA dodać po 0.5 ml odczynnika difenyloaminowego. Probówki
umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 min. W probówce zawierającej DNA
powstaje niebieskie zabarwienie.
Odczynniki: 10% alkoholowy roztwór
α
-naftolu, kwas siarkowy stężony, 0.2 %
roztwór antronu w stężonym kwasie siarkowym, rezorcyna
in subst.
, kwas
solny stężony, odczynnik orcynowy (1 g orcyny i 100 mg FeCl
3
.
6H
2
O w stęż.
HCl), 1% roztwory: glukozy, fruktozy, glukozoaminy, sacharozy, arabinozy,
maltozy, skrobi rozpuszczalnej,
Fehling I (3.46 g CuSO4.5H2O + 0.1 ml kwasu siarkowego stęż. dopełnić wodą
do 100 ml), Fehling II (17.3 g winianu sodowo-potasowego i 7 g NaOH
dopełnić do 100 ml), odczynnik Barfoeda, 1M kwas siarkowy, Nasycony r-r
Na
2
CO
3
w 30 % NaOH, roztwór I i KI (1 g I i 2 g KI rozpuścić w 300 ml wody),
2% roztwór floroglucyny w etanolu, 0.1% roztwory DNA i RNA, odczynnik
difenyloaminowy (1g difenyloaminy + 100 ml stęż. kwasu octowego + 2.75 ml
stęż. kwasu siarkowego), próbka-zagadka (dowolny z występujących w instr.
roztworów cukrowców).
5. Lipidy
5. Lipidy
5. Lipidy
5. Lipidy
Lipidy stanowią grupę zwiazków organicznych o znacznie zróżnicowanej
strukturze. Ich wspólną cechą jest to, że są nierozpuszczalne w wodzie ,
natomiast dobrze rozpuszczają się w rozpuszczalnikach ogranicznych. Z tego
też względu izoluje się je najczęściej z odwodnionych tkanek na drodze
ekstrakcji odpowiednimi rozpuszczalnikami . Niejednakowa rozpuszczalność
lipidów w różnych rozpuszczalnikach organicznych może stanowić podstawę
ich rozdziału; np. fosfolipidy dobrze rozpuszczają się w eterze, a nie
rozpuszczają się w acetonie. W celu rozdzielenia tłuszczów stosuje się
najczęściej chromatografię gazowo-cieczową lub cienkowarstwową. Pierwsza z
nich polega na rozdzieleniu metylowych pochodnych lipidów pomiędzy
gazową fazę ruchomą (np: hel) i lipofilną fazę płynną ( np: poliester kwasów
dikarboksylowych z alkoholami ). Chromatografię cienkowarstwową lipidów
przeprowadza się najczęściej na żelu krzemowym lub tlenku glinu, a do
identyfikacji rozdzielanych związków wykorzystuje się reakcje, w ktorych
powstają barwne kompleksy. Lipidy dzielimy na tłuszcze proste wśrod ktorych
wyróżniamy tłuszcze właściwe (estry glicerolu i wyższych kwasów
tłuszczowych ) i woski (estry wyższych jednowodorotlenowych alkoholi i
wyzszych kwasów tłuszczowych ), oraz tłuszcze złożone, do których zaliczamy
fosfolipidy i glikolipidy. Inną grupę lipidów stanowią pochodne izoprenu .
Zaliczane tu są m.in. sterydy, karotenoidy, dolichole, fitol. Lipidy są
podstawowym składnikiem błon biologicznych. Pełnią rownież w organizmie
funkcję zapasowego materiału energetycznego. Obejmują rownież prekursory
niektórych witamin oraz szereg hormonów.
1. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów liścia na żelu
1. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów liścia na żelu
1. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów liścia na żelu
1. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów liścia na żelu
krzemionkowym
krzemionkowym
krzemionkowym
krzemionkowym
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada:Chromatografia cienkowarstwowa pozwala na prowadzenie rozdziału
zarówno w środowisku polarnym jak i apolarnym. Rozdział substancji zachodzi
na zasadzie odwracalnej, fizycznej adsorpcji, podziału substancji między dwie
fazy ciekłe (fazą stacjonarną jest ciecz zaadsorbowana na ziarnach żelu), a także
3.5
na zasadzie wymiany jonowej (np. żel krzemionkowy ma odczyn słabo
kwasowy). Najczęściej ma miejsce kombinacja wszystkich trzech opisywanych
mechanizmów z przewagą jednego z nich. Do rozdzielania mieszaniny lipidów
wykorzystywana jest metoda chromatografii na żelu krzemionkowym. Stosując
różne układy rozpuszczalników można tą metodą rozdzielać różne grupy
lipidów. Lipidy są związkami bezbarwnymi i aby je zidentyfikować, płytkę po
rozdziale poddaje się wybarwianiu przy użyciu różnych reakcji
charakterystycznych.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie:
Esktrakcja lipidów:
Ok. 2 g świeżych liści pszenicy pociąć drobno i ucierać w moździerzu z
niewielką ilością piasku lub tłuczonego szkła. Dodać 10 ml mieszaniny
chloroform:metanol 1:2 (v/v). Całość ucierać jeszcze przez kilka minut,
wymieszać i odczekać, aż fragmenty tkanki opadną na dno moździerza. Nadsącz
metanolowy zebrać i przesączyć przez sączek do probówki.
Rozdział:
Na gotowej płytkę z naniesioną warstwą żelu krzemionkowego o wymiarach
ok. 20x5 cm narysować ołówkiem linię startu w odległości ok. 0.5 cm od
krótszego brzegu i zaznaczyć na niej 5 miejsc do nanoszenia próbek (3 wzorce
(monogalaktozyodiacyloglicerol (M), digalaktozylodiacyloglicerol (D),
sulfolipid (S)) i 2 różne ilości próbki (np. 20 i 50
µ
l ekstraktu (P1 i P2)).
Podpisać miejsca nanoszenia próbek i wzorców. Na odpowiednie pola za
pomocą mikrostrzykawki nanieść po 5
µ
l wzorców i odpowiednie ilości
ekstraktu, starając się, by powstająca plama była jak najmniejsza. Po każdym
roztworze płukać mikrostrzykawkę chloroformem. Można przyspieszyć
parowanie rozpuszczalnika, dmuchając na płytkę strumieniem zimnego
zimnego
zimnego
zimnego
powietrza z suszarki. Po naniesieniu próbek włożyć płytkę do komory
chromatograficznej z mieszaniną aceton:benzen:woda 81:30:4 (v/v/v) i rozwijać
do momentu osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika odległości ok. 1 cm od
górnego końca płytki. Płytkę wyjąć i suszyć pod digestorium
pod digestorium
pod digestorium
pod digestorium.
Barwnienie:
Płytkę włożyć na 20 min do komory wypełnionej parami jodu. Następnie
odbarwiać przez kilka minut na powietrzu (pod digestorium). Jod uwidacznia
lipidy, tworząc z nimi barwny kompleks.
2. Chromatografia bibułowa barwników liścia
2. Chromatografia bibułowa barwników liścia
2. Chromatografia bibułowa barwników liścia
2. Chromatografia bibułowa barwników liścia
Powszechnie stosowanym typem chromatografii podziałowej jest
chromatografia z zastosowaniem bibuły jako nośnika fazy nieruchomej (zwykle
rozpuszczalnika bardziej polarnego). Podczas wędrówki fazy ruchomej
(rozpuszczalnika mniej polarnego) po nośniku następuje ciągłe ustalanie
równowagi podziału substancji rozdzielanych pomiędzy te dwie fazy. Po
zakończeniu rozwijania chromatogramu poszczególne składniki rozdzielanej
mieszaniny zostają zatrzymane w różnych miejscach nośnika w zależności od
wartości ich współczynnika podziału między fazę ruchomą i stacjonarną.
Wykonanie:
Wykonanie:
Wykonanie:
Wykonanie:
Przygotowanie ekstraktu barwników:
Z homogenatu otrzymanego w wyniku rozcierania liści w poprzednim
doświadczeniu pobrać ciemnozieloną warstwę dolną (chloroformową),
możliwie bez fragmentów tkanek, przesączyć przez bibułę i w razie potrzeby
zagęścić przez odparowanie (mieszając w zlewce włożonej do ciepłej wody, pod
digestorium). Część ekstraktu (ok. 1 ml) odlać do probówki i dodać do niej 20-
50
µ
l stężonego HCl.
Przeprowadzenie rozdziału
Na bibule chromatograficznej o wymiarach ok. 23x15 cm narysować ołówkiem
2 linie startu, w odległości ok. 2.5 cm od dłuższej krawędzi bibuły. Następnie
na te linie nanieść kilkakrotnie pipetą Pasteura otrzymane ekstrakty, susząc
miejsca nanoszenia strumieniem zimnego powietrza z suszarki. Bibułę spiąć w
walec i umieścić w komorze chromatograficznej o poj. ok. 1 l zawierającej na
dnie warstwę ok. 1 cm mieszaniny o składzie benzyna : aceton 125:15 (v/v).
3.6
Rozdział prowadzić do momentu osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika
górnej krawędzi bibuły. Następnie chromatogram wyjąć ze zlewki i wysuszyć.
Obrysować ołówkiem widoczne na chromatogramie barwne plamy, wyciąć
obrysowane fragmenty bibuły pokroić na drobne paseczki i wyekstrahować
barwniki acetonem. Wykonać widma absorpcyjne tak uzyskanych roztworów
barwników. Określić wpływ środowiska kwaśnego na skład barwnikowy liścia.
3. Wykrywanie cholesterolu
3. Wykrywanie cholesterolu
3. Wykrywanie cholesterolu
3. Wykrywanie cholesterolu (odczyn Liebermanna-Burcharda)
Zasada
Zasada
Zasada
Zasada: Pod wpływem stężonego kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu
octowego tworzy się zabarwiony kwas monosulfonowy bicholestadienu.
Reakcję tę wykorzystuje się także do ilościowego oznaczania cholesterolu
metodą spektrofotometryczną.
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie
Wykonanie: Badaną próbkę rozpuścić w chloroformie; jeżeli utworzyła się
górna warstwa wodna, to zebrać warstwę dolną (chloroformową), dodać do niej
bezwodnego siarczanu magnezu (w celu odwodnienia) wytrząsnąć przez 2 min,
odstawić i po chwili zebrać ciecz znad osadu. 0.5 ml roztworu zadać 1 ml
bezwodnika kwasu octowego i (ostrożnie,
ostrożnie,
ostrożnie,
ostrożnie, może wyprysnąć podczas
dodawania!) 150
µ
l stężonego kwasu siarkowego. O obecności cholesterolu
świadczy zabarwienie z początku różowo-czerwone następnie przechodzące w
zielone. Równoczenie wykonywać próbę kontrolną na próbce nie zawierającej
cholesterolu i próbę na chloroformowym roztworze cholesterolu. UWAGA:
UWAGA:
UWAGA:
UWAGA:
Szkło używane do oznaczeń musi być suche!
Szkło używane do oznaczeń musi być suche!
Szkło używane do oznaczeń musi być suche!
Szkło używane do oznaczeń musi być suche!
Materiały:
Zielone liście (pszenicy,
Bilbergia
sp. lub t.p.) płytki do TLC pokryte żelem
krzemionkowym, bibuła chromatograficzna, ew. materiał do oznaczania
cholesterolu.
Odczynniki:
Wzorce lipidów, solwent do chromatografii cienkowarstwowej j.w., jod,
benzyna, aceton, chloroform, metanol, bezwodnik kwasu octowego, stężony
kwas siarkowy, stężony kwas solny, chloroformowy roztwór cholesterolu
Sprzęt:
Komora do chromatografii bibułowej, komora do chromatografii
cienkowarstwowej, komora do barwienia w parach jodu, mikrostrzykawka 10
µ
l, pipety pasteurowskie z obtopionymi końcami, suszarka, szkło laboratoryjne,
pipety automatyczne 1000 i 200
µ
l.