Metody Spektroskopowe
•1 H NMR
•13 C NMR
•31 P NMR
•15 N NMR
•Widma Wielowymiarowe
•Spektrometria Masowa

Magnetyczny Rezonans Jądrowy wykorzystuje
zjawisko absorpcji i emisji energii
w postaci fali elektromagnetycznej o częstotliwości
radiowej przez jądra
określonych izotopów,umieszczonych w silnym polu
magnetycznym.

Zastosowanie NMR
•Chemia Organiczna
- Identyfikacja i ustalanie struktury związków
organicznych
- Badanie oddziaływań na poziomie cząsteczkowym
•Biochemia i Biologia Molekularna
- Badanie struktury białek
- Badanie struktury kwasów nukleinowych
- Oddzialywanie biomolekul z ligandami
•Medycyna
-Tomografia obrazowa
-NMR

Interpretacja widma 1 H-NMR
Przesunięciem chemicznym ó nazywamy różnicę
częstotliwości rezonansowej
protonu lub grupy protonów w stosunku do
częstotliwości
rezonansowej wzorca (TMS
tetrametylosilan).Przesunięcie chemiczne wyrażamy
w ppm (part per milion)
Przesunięcie chemiczne zależy od otoczenia
chemicznego.

Sprzężenie spinowo-spinowe To rozszczepienie
sygnału protonu lub grupy protonów na kilka linii
tworzących multiplet (d,t ,q ...),na skutek
oddziaływania z sąsiednimi jądrami o
właściwościach
magnetycznych. Odległość między sąsiednimi
liniami w multiplecie,zmierzona w Hz nazywa się
stałą sprzężenia J.Analiza sprzężenia spinowo-
spinowego dostarcza istotnych informacji o budowie
związku.

Przygotowanie próbki do eksperymentu NMR
•Standardowe rurki szklane o średnicy od 4 lub 1O
mm
•1 - 1O mg związku organicznego rozpuszczonego
w deuterowanym rozpuszczalniku (0.5- 2ml)
•Substancja wzorcowa dodawana jako wzorzec
wewnętrzny lub zewnętrzny
•Tetrametylosilan lub sulfonian tetrametylosilanu

Zalety wzorca
•Silny sygnał 12 protonów na "krawędzi' widma
•Dobra rozpuszczalność w większości
rozpuszczalników organicznych
•Łatwy do usunięcia - niska temperatura wrzenia
•Nieaktywny względem innych związków
•Nie nakłada się z innymi sygnałami
•Uniwersalny wzorzec zarówno do 1H, jak i 13C
NMR

Spin cząstek elementarnych
•Cząstki elementarne posiadają trzy podstawowe
właściwości: masę, ładunek i spin.
•Spin jest własnym momentem pędu cząstki
elementarnej
•Spin jest wielkością tensorową, zależną od kierunku
ruchu cząsteczki
•Cząsteczki będące aglomeratem cząstek
elementarnych, np. jądra atomowe, posiadają swój
spin,
będący sumą wektorową spinów składowych cząstek
elementarnych
•Spin cząstek elementarnych ma wartość(+/-) %
•Kwantowa liczba spinowa jądra (l) może
przyjmować wartości O, 1/2, 1, 3/2, 2, 5/2.

Poziomy energetyczne jąder w polu magnetycznym
Z ruchem wirowym jadra związany jest jego wektor
momentu pędu "s" zwany spinem jądrowym
s=h/2pi x pier I(I+1)
Jądra atomowe wykazujące właściwości
magnetyczne
I różne od 0
można uważać za jądrowe dipole magnetyczne "mi"
mi=yS /11>
Liczba możliwych poziomów energetycznych jadra
N=2I + 1

Czułość NMR/MRI - Im silniejsze pole
magnetyczne tym wyższa energia związana ze
zmianą
stanu energetycznego,tym silniejszy sygnał MR

Precesja spinu pod wpływem zewnętrznego pola
magnetycznego
Spiny zachowują się w ten sposób gdyż posiadają
zarówno kątowy jak i magnetyczny moment.
Klasycznym analogiem ruchu precesyjnego jąder
jest dziecięcy bączek. Różnica polegn na tym,
że bączek po pewnym czasie upada, natoniast jadro
kręci się caly czas.

Orientacja momentu magnetycznego protonów w
polu magnetycznym
Jądra posiadające moment magnetyczny zgodny z
kierunkiem pola magnetycznego mają niską
energię, natomiast te, których moment skierowany
jest przeciwnie do kierunku pola mają
wysoką energię.

Sposoby rejestracj widma NMR
Absorpcyjny
•Próbkę naświetlamy promieniowaniem radiowym o
wąskim zakresie częstotliwości
•Płynnie zmieniamy częstotliwość
•Mierzymy ilość pochloniętego promieniowania
•Rejestrujemy widmo
Emisyjny
•Próbkę naświetlamy krótkim silnym impulsem
promieniowania radiowego o szerokim zakresie
częstotliwości
•Próbka pochłania energie i przechodzi w stan
wzbudzony
•Próbka powracając do stanu normalnego emituje
widmo
•Akumulujemy kilkaset sygnałów
•Dokonujemy transformacji Furiera
•Rejestrujemy obliczone widmo

Zalety i wady obu metod
ABS
•Prosta technicznie i obliczeniowo
•Mało precyzyjna
•Konieczne wysokie stężenie badanego związku
•Ma znaczenie głownie historyczne
EMI
•Pozwala wykonywać widma z miligramowych
ilości związku
•Można akumulować tysiące impulsów
•Pozwala na stosowanie zaawansowanych technik
(2D, 3D, odsprzęganie)
•Pozwala na rejestracje widm izotopów śladowych
np 13C
•Widma absorpcyjne i emisyjne są praktycznie
identyczne.
•Nie zmieniają si ę : przesuniecie chemiczne , stale
sprzężenia, integracja
•Wymaga skomplikowanej aparatury i
oprogramowania

Przesunięcie chemiczne "ó" protonów związanych
ze szkieletem węglowym
•Zależy od hybrydyzacji atomów węgla
•Zależy od polarności grup funkcyjnych w
sąsiedztwie
•Podobne podstawniki w podobny sposób wpływają
na przesunięcie
•W niewielki sposób zależy od rodzaju
rozpuszczalnika, stężenia próbki i sposobu
wykonania eksperymentu
•Ostre, dobrze zarysowane piki
•Liczbę protonów w sygnale pokazuje integracja
•Sygnały protonów o podobnym przesunięciu mogą
się nakładać

Efekt odciągnięcia elektronów przez elektroujemny
podstawnik jest widoczny
w postaci zwiększenia przesunięcia chemicznego

Przesunięcie chemiczne "ó" protonów związanych z
heteroatomami
•Zależy od rodzaju grupy funkcyjnej
•Słabo zależy od polarości grup funkcyjnych w
sąsiedztwie
•Zależy od rodzaju rozpuszczalnika, stężenia próbki
i sposobu wykonania eksperymentu
•Piki są najczęściej mało ostre bądź rozmyte
•Integracja może być zaniżona
•W niektórych polarnych deutercwanych
rozpuszczalnikach sygnał protonów związanych z
heteroatomami może być niewidoczny

Mechanizm przekazywania sprzężenia spinowo-
spinowego
•Stan magnetyczny sąsiednich jąder wpływa na spin
elektronów walencyjnych wokół tych
jąder i za pośrednictwem wiązań chemicznych jest
przekazywany na elektrony walencyjne
analizowanego jądra.
•W ten sposób częstotliwość rezonansowa
analizowanego jądra jest odzwierciedleniem
stanów energetycznych jąder sąsiednich.

•Silniejszy wpływ (łatwość przekazywania sygnału)
stanu energetycznego jąder sąsiednich
wyraża się zwiększeniem wartosci stałej sprzężenia.

Sprzężenie spinowo-spinowe
•sprzężenie spinowo-spinowe s-s może być
przekazywane za pośrednictwem wiązań
chemicznych
lub przez przestrzeń dla jąder znajdujących się
blisko w przestrzeni, ale nie połączonych
wiązaniami chemicznymi.
•sprzężenie spinowo-spinowe może zachodzić
pomiędzy jądrami tego samego rodzaju np. H-H,
lub pomiędzy różnymi jądrami np . H-P , H-F.
•Nie zależy od sposobu wykonania eksperymentu i
siły pola magnetycznego

Właściwości sprzężenia spinowo-spinowego
•Miarą siły sprzężenia spinowo-spinowego jest stała
sprzężenia J wyrażana w Hz
•Stała sprzężenia zależy od rodzajów jąder
•Stała sprzężenia zależy od ilości i rodzaju wiązań
chemicznych pomiędzy oddziaływującymi jądrami
•Wiązania wielokrotne zwiększają wartość stałej
sprzężenia spinowo-spinowego
•Stała sprzężenia zależy od konformacji cząsteczki,
wzajemnego usytuowania jąder
•Stała sprzężenia przenosi się z taka sama siłą w obu
kierunkach oddziaływujących jąder

Sprzężenia spinowo-spinowego nie obserwujemy
•Gdy jądra oddalone są o więcej niż pięć wiązań
•Gdy protony są równoważne chemicznie
•Gdy w łańcuchu sprzężenia vvystępują heteroatomy
(wyjątkiem są układy heterocykliczne)
•Gdy protony związane są z heteroatomami
(wyjątkiem są protony amidowe)
•Gdy różnica przesunięć chemicznych jest mniejsza
od stałej sprzężenia
•Gdy czułość aparatu jest mniejsza od stałej
sprzężenia
•Gdy sprzęgające się grupy ulegają szybkim
zmianom konformacyjnym

Protony wicynalne i geminalne
•Sprzężenia między protonami vicynalnymi są
najczęściej analizowane na widmach 1H NMR
•Sprężenia między protonami geminalnymi są
widoczne tylko gdy mają inne otoczenia chemiczne
np.
w układach cyklicznych lub w pobliżu centrum
asymetrii

Konsekwencje wykonywania pomiarów w silnym
polu magnetycznym:
•Przesunięcie chemiczne nie zmienia się przy
zmianie natężenia pola
•Stała sprzężenia nie zmienia się przy zmianie
natężenia pola
•Zmienia się stosunek deltav/J
•Powoduje to zwężenie i rozsunięcie się sygnałów
•Ułatwia interpretację widma
•Graficzny obraz widma jest mniej czytelny -
konieczny jest numeryczny opis pików

Impulsowa rejestracja widma NMR
•Silny krótkotrwały impuls wprowadza jądra w
wyższy stan energetyczny
•Jądra wracając do stanu równowagi emitują sygnał
•Sygnał zaniku swobodnej precesji (FID -Free
lnduction Decay)
•Sygnał FID jest przekształcany poprzez
transformację Fouriera w funkcję amplituda
sygnału -częstotliwość - czyli "normalne" widmo

Rodzaje impulsów
•Rejestrujące, przygotowujące , odsprzęgające
•wąsko i szerokopasmowe
•Ukierunkowane i nieukierunkowane
•Krótkotrwale, długotrwałe i ciągłe
•Czas zaniku sygnału FID- czas relaksacji

Odsprżęganie
•Odsprzęganiem nazywamy proces naświetlania
sąsiednich jader odpowiadającą im częstotliwością
rezonansową w celu przeprowadzenia ich w wyższy
stan energetyczny w wyniku czego nie powodują
rozszczepienia sygnału badanych jąder
•Odsprzęganie homo i heterojądrowe

Widma- ATP
Attache Proton Test
•Stosowana jest sekwencja impulsów SEFT
(Spin Echo Fourier Transform)
•Sygnały atomów węgli związanych z nieparzystą
liczbą protonów CH3 i CH są ujemne, a z
parzystą CH2 i C - dodatnie
•Czwartorzędowe atomy węgla są widoczne

Widma 13C i 1H COSY
COrelatione SpectrascopY

•Są to widma dwuwymiarowe ; na jednej osi są
widoczne przesunięcia protonów a na drugiej
atomów węgla.
•Na osiach znajdują się również widma
jednowymiarowe 1H i 13C.
•W trakcie rejestracji widma COSY sygnał
przygotowujący ma częstotliwość protonowa, a
rejestrujący węglową.
•Widma te sa często zwane HETCOR l
(HETeronuclear CORelations)

Korelacja dalekiego zasięgu
•W celu wykrycia sprzężeń dalekiego zasięgu przez
dwa lub więcej wiązań stosuje się metodę HMBC
(Heteronuclear Multiple Band Coherence) .
•Obserwowane są sygnały o małych stałych
sprzężeniach od O do 40 Hz.

Podobieńsw w spektroskopii 1H i 13C NMR
•Kwantowa spinowa liczba magnetyczna 1/2
•Widmo wykonywane w tej samej temperaturze
•Widmo wykonywane metodą impulsową
•identyczny sposób przygotowania próbki-
rozpuszczenie w deuterowanym rozpuszczalniku
•Ten sam wzorzec częstotliwości TMS
•Możliwość wykonania widma z tej samej próbki
(przy odpowiednio dużym jej stężeniu)
•Podobne czynniki wpływające na przesunięcie
chemiczne

Różnice w spektroskopii 1H i 13C NMR
•1H NMR - Ilość substancji niezbędna do
wykonania widma poniżej 1 mg
-iest bardziej czułY i łatwiejszy do wykonania
-Ilość linii w multiplecie jest zależna od ilości
protonów związanych z sąsiednim atomem
węgla (lub atomami węgla)
•13C NMR - powyżej 1 mg na każdy atom węgla w
analizowanym związku
-wymaga dłuższego czasu do otrzymania 13C
spectrum
-Ilość linii w multipiecie jest zależna od ilości
protonów bezpośrednio związanych z danym
węglem

Składowe widma analizowane w spektroskopii 1H i
13C NMR
1H - Przesunięcie chemiczne
Sprzężenie spinowo - spinowe
Integracja
13C Przesuniecie chemiczne
Intensywność pików jako in formacja pomocnicza

Metoda "off rezonance"
•Użycie częstotliwości odsprzęgaJacej nieco
powyżej lub poniżej częstotliwości rezonansowej
protonów
powoduje zwężenie multipletów węglowych, w
których obserwujemy tylko resztkowe stałe
sprzężenia.
•Z liczby linii w multipletach możemy wnioskować
o liczbie protonów bezpośrednio związanych z
węglem
(CH3 - q, CH2 - t, CH -d).
•Widoczne są tylko resztkowe stałe sprzężenia przez
jedno wiązanie.
•Niekiedy informacja o krotności multipletów
podawana jest w formie liter w pobliżu pliku.

Selektywne odsprzęganie protonów
•W widmie 1H NMR można zidentyfikować
częstotliwości rezonansowe wszysikich protonów.
•W 13C NMR można zas tosować wąskopasmowe
odsprzęganię pojedynczych protonów lub grupy
protonów i na
widmie widoczne są singlety węgli związanych z
danym protonem, natomiast pozostałe atomy węgli
są
szczątkowymi multipletami.

Metoda DEPT
•stosując odpowiednia sekwencje impulsów mozna
zroznicowac intensywnos sygnałow weglowych
grup CH3, CH2, CH
• Istnieja dwa sposoby zapisu widma DEPT
-sygnały wegli CH3 i CH z dodatnia
intensywnoscia, a CH2 z ujemna
- wszytskie grupy CH3, CH2 i CH rejestrowane sa
na oddzielnych widmach
-wegle czwartrzedowe sa niewidoczne

Dlaczego nie analizujemy sprzężenia spinowo
spinOwego na widmach 13 C NMR
•Widma rejestrujemy standardowo z odsprzęganiem
sygnałów protonowych
•Siałe sprzężenia H-13C są bardzo duże od 120-
270Hz
•Sprzężenie 13C-13C jest niewidoczne ponieważ
prawdopodobieństwo wystąpienia dwu izotopów
13C

obok siebie w szkielecie węglowym jest 1·10-4
(1%x1%)

Impulsowa rejestracja widma NMR
•Silny królkotlwały impuls wprowadza jądra w
wyższy stan energetyczny
•Jądra wracając do stanu równowagi emitują sygnał
•Sygnał zaniku swobodnej precesji (FID-Free
lnduclion Decay)
•Sygnał FID jest przekształcany poprzez
transformację Fouriera w funkcję amplituda sygnału
- częstotliwość
czyli "normalne" widmo

Odsprzęganie protonów w spektroskopii 13C NMR
•Odsprzęganiem nazywamy proces naświetlania
jąder 1H odpowiadającą im częstotliwością
rezonansową w celu
przeprowadzenia ich w wyższy stan energetyczny, w
wyniku czego nie powodują one rozszczepienia
sygnału
badanych jąder 13C
•Odsprzęganie heterojądrowe
•Odsprzęganie całkowite
•Odsprzęganie selektywne (np.tylko Ar)
•Odsprzęganie z NOE i bez NOE

Jądrowy efekt Overhausera NOE
•NAzywamy transfer energii wzbudzenia z jednych
jader na drugie na skutek zakłocenia przejsc
pomiedzy
poziomami enegetycznym
•zachodzi pomiedzy jadrami oddziaływujacymi ze
soba dipolowo
•jest tym skuteczniejsz im blizez znajduja sie
odddziałujace jadra

integracja na widmie 13C NMR jest zafałszowana
•Atomy wegla posiadaja bardzo rozny czas
relaksacji
•atomy o dlugim czasie relaksacji maja obnizaona
intensywnosc sygnału na widmie
•W procesie odsprzęgania energia jest
przekazywanaze wzbudzonych atomów wodoru na
sąsiednie atomy
węgla (Zjawisko NOE)
•Sygnały atomów węgla związane z 3 atomami
wodoru mają większą intensywność od węgli 4-to
rzędowych

Wpływ czasu relaksacji na intensywność sygnału
-Atomy węgla o królkim czasie relaksacji posiadają
kilka protonów lub są w elastycznym
fragmencie cząsteczki
-Atomy węgla o dlugim czasie relaksacji, najczęściej
są IV rzędowe lub są w sztyvvnym fragmencie
cząsteczkl i mają niska intensywność

Wpływ efektu NOE na intensywność sygnałów w
widmie 13C NMR
•Sygnał odsprzęgania wprowadza atomy wodoru w
wyższy stan energetyczny
•Znajdujące się w stanie wzbudzonym jądra 1H
przekazują sąsiednim jądrom (np. 13C) stan
wzbudzenia
•Transfer energii odbywa się poprzez przestrzeń na
skutek oddziaływania dipol-dipol
•Na skutek dodatkowej porcji energii atomy węgla
związane z większą liczbą wodorów emitują
silniejszy
sygnał i tworzą intensywniejsze piki na widmie

Przesunięcie chemiczne w widmach 13C NMR
1. O przesunięciu chemicznym decydują te same
dwa główne czynniki jak w 1H NMR
-Hybrydyzacja i otoczenie chemiczne danego węgla
-Obecność polarnych podstawników w sąsiedztwie
2. Zakres przesunięć chemicznych jest znaczne
większy od O -250ppm (0-15ppm w1HNMR)
3. zakresy przesunięć poszczególnych typów węgli
są proporcjonalne do przesunięć związanych z
nim i wodorów

Widma-ATP Attache Proton Test
•Stosowana jest sekwencja impulsów SEFT (Spin
Echo Fourier Trans form)
•Sygnały atomów węgli związanych z nieparzystą
liczbą protonów CH3 i CH są ujemne , a z
parzystą CH2 i C - dodatnie
•Czwartorzędowe atomy węgla są widoczne

Spektrometria masowa
Spektrometrią masową (MS) nazywamy zbiór
technik analitycznych, które pole gają na
przeprowadzeniu próbki w stan zjonizowany i
analizie powstałych jonów z
uwzględnieniem stosunku ich masy do ładunku

Wykorzysta nie spektrometrii masowej w chemii
organicznej
• Określenie masy cząsteczkowej badanego związku

• Identyfikacja związku poprzez porównanie z
widmami umieszczonymi w bazach danych
• Wyznaczenie wzoru sumarycznego związku (na
podstawie intensywności pików izotopowych i
precyzyjnej masy)
• Analiza budowy związku na podstawie
fragmentacji
• Możliwość połączenia spektrometru masowego z
chromatografem gazowym i cieczowym
• Możliwość połączenia ze sobą dwóch
spektrometrów masowych w uklad tandemowy

Wykorzystanie spektrometrii masowej w biochemii
• Określenie masy cząsteczkowej bialek i kwasów
nukleinowych
• Identyfikacja modylikacji potranstacyjnych
(glikozylacja , fosforylacja. metylacja itp)
• O kres lenie s topn ia utlenieni a resz t
cysteinowych
• Sekwencjonowanie białek
• Analiza bialek homologicznych podstawie znanych
fragmentów
• Możliwość połączenia spektrometru masowego z
chromatografem cieczowym FPLC

Budowa spektrometru masowego
Układ wprowadzenia probki - komora jonizacyjan -
analizator - detektor - system rejestracji danych
panuje wysoka proznia w spektrometrze masowym

Metody wprowadzania próbki
•wprowadzanie bez pośrednie (mikrocylinder,
płytka)
•wlot zimny
•wlot gorący
•układ wprowadzania z chromatografu gazowego
•układ wprowadzania z chromatografu cieczowego
(taśmowy, spray)

Metody jonizacji próbki
•jonizacja elektronami (El, DEI)
•jonizacja chemiczna (CI)
•bombardowanie szybkimi atomami (FAB)
•spektrometria masowa jonów wtórnych (SIMS)
•desorpcja laserowa (LD)
•termorozpylanie (TE)
•desorpcja laserowa z udziałem matrycy (MALDI)
•elektrarozpylanie (ESI)

Jonizacja elektronami ( Eiectron lonisation) -El
•jonizacja przy pomocy wiązki elektronów
•Jonizacja odbywa się w próżni .
•Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych
cząsteczek.
•El charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością
- poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.

Jonizacja chemiczna (Chemicallonisation) CI
•jony wytwarzane są na skutek zderzeń cząsteczek
badanego związku chemicznego z jonami
pierwotnymi
obecnymi w źródle jonów.
•Jest to metoda nie powodująca fragmentacji
cząsteczek (łagodna jonizacja) .
•Jonizacja odbywa się zwykle przy ciśnieniu rzędu
60 Pa.

Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom
Bombardment) (FAB)
• polega na bombardowaniu cząsteczki obojętnymi
atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70 eV ).
• Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej
lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej
substancji (matrycy) np. glicerolu

Spektrometria masowa jonów wtórnych
(secondary lon Mass Spectrometry) - SIMS
•Metoda ta początkowo była stosowana do
substancji przewodzących prąd lub substancji
naniesionych
na metalowe płytki.
•Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem
do substancji nie przewodzących prądu .
•Istnieje odmiana techniki SIMS w której badana
substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy
(najczęściej glicerolu). Technika ta jest nazywana
czasami LSIMS (Liquid Secondary lon Mass
Spectrometry) lub FIB (Fast lon Bombardment) .

Desorpcja laserowa (Laser desorplion) - LD
• jonizacja następuje przez naświetlanie próbki
silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami
są wysokoenergetyczne fotony .

Termorozpylanie (Termospray)- TE
• jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu
elektrycznego roztworu zawierającego sól i
analizowaną
substancję wewnątrz stalowej kapilary . Gorąca
substancja jest rozpylana w komorze próżniowej
z prędkością naddźwiękową.

Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix
Assisted Laser Desorption lonisation) MALDI
•stosuje się jonizację laserową, z tak dobraną energią
wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji
cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do
ich "wybijania" ze specjalnie przygotowanej
matrycy
•Matryca absorbuje energię lasera , która jest później
przekazywana do analizowanych cząsteczek.
•Metoda ta jest bardzo często stosowana w
badaniach nad białkami i kwasami nukleinowymi.

Elektrarozpylanie (Eiectrospray) - ESI
•polega na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną
substancję z kapilary, do której przyłożono
wysokie na pięcie ( 1 - 5 kV ) pod ciśnieniem
atmosferycznym.
•Jest to jedna z łagodnych metod jonizacj i - zwykle
nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek.
•Metoda ta jest bardzo często stosowana w
badaniach nad związkami wielkocząsteczkowymi.

Analizatory m /z
•magnetyczny
•magnetyczno-elektrostatyczny
•czasu przelotu (TOF)
•kwadrupolewy
•pułapka jonowa
•liniowa pułapka jonowa
•cyklotronowy analizalor jonów z transformacją
Fouriera

Analizator magnetyczno -elektrostatyczny. Sektor
magnetyczny
•wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w
polu magnetycznym
•Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień
zakrzywienia lotu zależy od stosunku masy
do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od
parametrów pola magnetycznego.
•Sektor magnetyczny charakteryzuje się stosunkowo
małą rozdzielczością. Związane jest to glównie
z dużymi różnicami prędkości cząsteczek
wpadających do urządzenia. Problem ten rozwiązuje
przez zastosowanie sektora elektrycznego przed
sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki
są rozpędzane. dzięki czemu różnice prędkości są
mniejsze.

Sektor elektryczny
•urządzenie to wykorzystuje zjawisko zmiany toru
lotu jonów w polu elektrosta tycznym ,
•jest zbudowane z dwóch równoległych,
zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał
elektryczny
•Jony o jednakowej energii translacyjnej maja
jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za
tym
sektorem znajduje się szczelina przez którą
przelatują jony tylko o określonej energii .
•Sektory elektryczne stosowane są przed sektorami
magnetycznymi w spektrometrach masowych o
podwójnym ogniskowaniu.

Analizator czasu przelotu (Time Of Flight) TOF
•jony wprowadzane do analizatora są przyspieszane
przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają
dryfować przez komorę analizatora. Na końcu
analizatora znajduje się detektor jonów
połączony z urządzeniem rejestrującym czas od
impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia
okreś lonego jonu w detektor.
•Pomiar m/z jest oparty na fakcie, że ze wzrostem
masy cząsteczkowej jonów, wydłuża się ich
czas przelotu. Obecnie stosuje się często analizatory
czasu przelotu ze zwierciadłem
elektrostatycznym. który zwiększa rozdzielczość
aparatu, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych
mas cząsteczkowych.
•Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo
dużymi rozdzielczościami oraz dużą czułością
•Są najczęściej stosowane razem z jonizatorami
MALDI.

Analizator kwadrupolewy
•analizator ten jest zbudowany z czterech
symetrycznie ułożonych równoległych prętów.
•Działa jako filtr masy - w jednym momencie
przepuszcza tylko jony o określonym stosunku
masy do ładunkU (m/z). Dzieje się to dzięki
przykładaniu do prętów prądu
zmiennego określonej częstotliwości i napięciu oraz
napięcia stałego.
•Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczai
jony o szerokim lub wąskim zakresie m/z.
•Jony przechodzące przez kwadrupol mogą być
poddawane dalszej analizie

Pułapka jonowa (ion trap) - IT

•pozwala on na przetrzymywanie jonów i działa na
zasadzie podobnej do kwadrupola
•Manipulując parametrami prądu przyłączonego do
elektrod można uwięzić w pułapce jony
o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub
można uwięzić jony o szerokim zakresie m/z.
•Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w
pułapce jonów o szerokim zakresie m/z i
wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o
określonym m/z.
•Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem
obojętnym - helem, o ciśnieniu 10-1 Pa
•Jeżeli jony w pułapce zostaną wzbudzone
(przyspieszone), zderzenia z atomami helu
spowodują fragmentację jonów.
•Pułapki jonowe charakteryzuj ą się zwykle dość
niewielką
rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz ba rdzo dużą
czułością.

Liniowa pułapka jonowa (linear lon Trap, Linear
Trap Quadrupo/e) - LTQ
•jest zbudowana, jak kwadrupol, z czterech
równoległych
prętów. Na obu końcach analizatora przy kładany
jest
potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę
jonów z
analizatora.
•Pomiar masy odbywa s ię przez wyrzucanie jonów
o
określonym m/z z analizatrora i detekcję.
•W liniowych pułapkach jonowych stosuje się częs
to dwa
detektory, co zwiększa czułość . Liniowe pułapki
jonowe
charakteryzują się bardzo dużą czułością (większą
niż zwykłe
pułapki jonowe) i stosunkowo niską rozdzielczością.
•W liniowej pułapce jonowej, jony mozna
przechowywać,
poddawać fragmentacji i mierzyć masy fragmentów.

Cyklotronowy analizator jonów z transformacją
Fourier a
•wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu
jonów w polu magnetycznym.
•Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają
w ruch kołowy .
•W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia -
ciśnienie nie
większe niż 10-4Pa. 10-6Pa lub mniejsze.
•Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą
być bardzo duże,
zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do
miliona (przy m/z
500 Th). Rozdzielczości tych analizatorów szybko
zmniejszają się
wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.
•W analizatorze FT-ICR przy pomocy zlożonej fali
elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie
wszystkie jony.
Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał
zawierający wiele
częstotliwości charakterystycznych dla jonów o
różnym m/z . Sygnał
ten jest przekształcany w widmo m/z przy pomocy
Transformacji Fouriera.

Detektory
•puszka Faradaya
•powielacz elektronowy
•mikrokanalikowy
•fotopowielaczowy
•cyklotronowego rezonansu jonów

Puszka Faradaya
•Jest to metalowa, cylindryczn a komora z
otworem przez który wlatują jony.
•Jony wpadające do detektora trafiają na dno
puszki i oddają swój ładunek.
•Powstający w ten sposób prąd jest mierzony.
•Detektory te charakteryzują się małą czułością.

Detektor- powielacz elektronowy
•zbudowany jest z serii płytek. do których
przylączono wysokie
napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę
(dynodę
konwersyjną), powodują emisję elektronów .
Elektrony te uderzają w
kolejną płytkę (dynodę) powodując wybicie
większej liczby
elektronów . z każdej, kolejnej płytki detektora
wybijane jest coraz
więcej elektronów - sygnał jest wzmacniany.
•Elektrony trafiają ostatecznie na anodę powodując
przepływ prądu,
który jest mierzony.
•W nowszych konstrukcjach powielaczy
elektronowych serię dynod

zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą
(powielacz
elektronowy o dynodzie ciągłej).
•Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury
powodując emisję
kolejnych elektronów . Dzięki kaskadowemu
wzmocnieniu sygnału
powielacze elektronowe są detektorami bardzo
czutymi.

Detektor mikrokanalikowy
•zbudowany jest z płytki z niewielkimi (4- 25 ~m) ,
zakrzywionymi otworami.
•Powierzchnia otworów pokryta jest
półprzewodnikiem
mającym zdolność emisji elektronów.
•Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest
potencjał
ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony
wyjściowej .
•Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze
ścianami
otworów powodując kaskadową emisję elektronów .
podobnie
jak w powielaczu elektronowym.
•Za każdym z kanalików znajduje się metalowa
anoda
zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób
jest
mierzony.

Detektor fotopowielaczowy
•składa się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla
jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu
fluorescencyjnego i fotopowielacza
•Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę
konwersyjną powodując emisję elektronów.
•Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny
przy
pomocy pola elektrycznego.
•Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są
fotony,
które trafiają do fotopowielacza
•Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest
rejestrowany .

Detektor cyklotronowego rezonansu jonów
•Analizatory ICR są jednocześnie detektorami
jonów, nie
wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.

Rodzaje pików na widmie masowym
•Pik molekularny - to pik odpowiadający masie
cząsteczkowej badanego związku, przy założeniu, że
cząsteczka jest zbudowana z najlżejszych izotopów.
•Pozorny pik molekularny - odpowiada masie
badanego
związku powiększonego o masę czynnika
jonizującego
(H', Na' , Li ', C4H5 · ).
•Pik izotopowy - to pik odpowiadający masie
badanego
związku, w którego cząsteczce jeden lub więcej
atomów
zostało zastąpione cięższymi izotopami (M+1, M+
2,
M+3 ).
•Pik główny - to najwyższy pik na widmie , któremu
przypisujemy intensywność 100%
•Piki fragmentacyjne - są to piki powstałe na skutek
rozpadu cząsteczk i w wyniku jonizacji.