Metody otrzymywania

zwierząt transgenicznych

Na przestrzeni ostatnich 30 lat w naukach

biologicznych i medycznych zwierzęta transgeniczne

stały się niezwykle ważnym i przydatnym narzędziem.

Na początku lat 80 tych ubiegłego wieku podjęto

pierwsze próby otrzymania zwierząt transgenicznych.

Badacze Gordon i Rudle oraz Lacy i Costantini podjęli

się otrzymania myszy transgenicznych

Opanowanie hodowli zarodków poza ustrojem, a

także możliwości ich modyfikacji, oraz możliwości

biologii molekularnej pozwalające na dowolność

konstruowania danego fragmentu DNA pozwoliły na

otrzymanie zwierząt transgenicznych.

Zwierzęta transgeniczne posiadają w swoim

genomie, egzogenny DNA.

Co dało możliwość otrzymania

zwierząt transgenicznych?

Metody otrzymywania zwierząt

transgenicznych

Dzisiaj naukowcy dysponują cztema podstawowymi

metodami:

•Mikroiniekcja DNA

•Transfer genu przy pomocy wektorów wirusowych

•Modyfikacja pierwotnych komórek macierzystych.

•Transplantacja jąder komórkowych.

Mikroiniekcja DNA

Metoda ta wykorzystuje mikroiniekcję DNA do

przedjądrza jednokomórkowej zygoty lub zarodka.

Wykonuje

się

to

przy

pomocy

szklanej

mikrochirurgicznej pipety.

DNA w postaci roztworu jest wstrzykiwany do

wybranego przedjądrza i dalej hodowany in vitro do

stadium dwukomórkowego. Zarodki które przeżyją

mikroiniekcję, a jest ich zwykle około 50 %

implantowane są w macicy matek zastępczych.

Otrzymany w ten sposób organizm transgeniczny

może mieć wcześniej wprowadzony gen we

wszystkich komórkach lub być tak zwaną chimerą,

czyli organizmem, którego komórki nie są

jednakowe pod względem genomu.

W praktyce oznacza to, że nie we wszystkich

komórkach jest obecny transgen. Jest to spowodowane

faktem, że integracja transgenu do genomu zaszła po

pierwszym podziale komórkowym. Wówczas tylko

jedna z komórek potomnych będzie posiadała

transgen. Powyższy fakt ma olbrzymie znaczenie w

przypadku

zamiaru

wyprowadzenia

linii

transgenicznej, bowiem gdy dochodzi do sytuacji, że w

komórkach płciowych transgen będzie nieobecny, to

nie dojdzie do przekazania go następnym pokoleniom.

Zalety metody mikroiniekcji DNA

• można ją stosować przy wielu różnych gatunkach

• nie

ma

ona

ograniczenia

w

rozmiarze

wstrzykiwanego DNA

• brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA

• stosunkowo prosta

• szerokie

zastosowanie

w

tworzeniu

transgenicznych zwierząt

Wady metody mikroiniekcji

DNA

• Brak możliwości dokładnego kontrolowania objętości

wstrzykiwanego roztworu DNA

• nie ma możliwości wyboru lokalizacji takiej integracji

wstrzykniętego transgenu z genomem gospodarza

• Efektywność metody nie jest zadowalająca (1/200 u

królików, świń i owiec, u myszy 15 x częściej)

• wymaga użycia kosztownej aparatury

(mikromanipulatory, mikroskop odwrócony)

• Wymaga dużych umiejętnośći operatorów.

Samice poddane

superewolucji

Pobranie zygot od

samic

Mikroiniekcja DNA do jednego

z przedjądrzy zygoty

Implantacja embrionów u matki

zastępczej

Otrzymanie potomstwa z którego około

15% przedstawicieli jest osobnikami

transgenicznymi

Transfer genu przy pomocy

wektora wirusowego

Metoda

ta

jest

stosowana

aby

podnieść

prawdopodobieństwo otrzymania transgenicznego

potomstwa. Wydajność tej metody dochodzi do 80%

transgenicznego potomstwa.

Transfer ten odbywa się przy pomocy retrowirusa, lub

lentiwirusa, który infekuje komórki i w ten sposób

wprowadza gen, który chcemy wprowadzić. Zarówno

lentiwirusy jak i retrowirusy posiadają zdolność

integracji do genomu zainfekowanej komórki.

Wadą tej metody jest to, że ekspresji ulegają także

geny genomu retrowirusa, podczas rozwoju zarodka.

Dlatego trzeba podejmować kroki, aby wyciszyć

ekspresję tych genów. Prawdopodobnie lentiwirusy

stanowiące jedną z klas retrowirusów nie wykazują

tej cechy. Są zdolne do infekcji komórek dzielących

się, jak i komórek nie dzielących się.

Modyfikacja pierwotnych komórek

macierzystych

Ta metoda jest używana najczęściej do

otrzymywania

organizmów

z

wyciszoną

ekspresją danego genu. Niewątpliwą zaletą tej

metody jest to, że pozwala ona na określone,

precyzyjne modyfikowanie miejsca w genomie.

Wykonanie

Początkowo z blastocysty izolowane są komórki ES

(z. ang. embryo stem cells). Są to komórki

niezróżnicowane, posiadające zdolność po wtórnym

prowadzeniu do blastocysty wbudowania się do

tkanek rozwijającego się embrionu

W hodowlach in vitro do wcześniej pobranych

komórek ES wprowadza się geny przy pomocy

najczęściej metody elektroporacji, ale także,

lipofekcji wykorzystującej jako nośniki DNA lipidy

kationowe, oraz metody wapniowej.

Metoda ta polega na wprowadzeniu pożądanej

sekwencji DNA w hodowlach In vitro do komórek

macierzystych. Komórki pnia nie są zróżnicowane i

mają zdolność różnicowania do różnych typów

komórek np. komórek zarodkowych lub komórek

somatycznych. W ten sposób mogą dać początek

nowemu organizmowi. Te komórki są następnie

wprowadzane do zarodka w fazie blastocysty.

Wprowadzany fragment DNA posiada sekwencję genu

selekcyjnego. Jest ona otoczona przez sekwencje

homologiczne do poddawanego modyfikacji genu. Po

wprowadzeniu do komórki w jądrze następuje

rozpoznanie sekwencji otaczających i wymiana

sekwencji genomowej na sekwencję wprowadzaną.

Wprowadzenie

egzogennego

DNA

powoduje

wyłączenie tego genu i prowadzi do otrzymania tzw.

komórki knock-out

.

Obecność genu selekcyjnego i późniejsza jego

ekspresja pozwala na selekcję komórek, w których

zaszła wymiana, środowisku czynnika slekcyjnego.

Wyselekcjonowane

komórki

namnaża

się

w

środowisku czynnik selekcyjnego a następnie

transferuje się do blastocysty, gdzie dochodzi do

połączenia

się

komórek

zmodyfikowanych

i

pierwotnymi

(niemodyfikowanymi)

komórkami

zarodka i stworzenia jednego organizmu.

Otrzymany w ten sposób organizm jest chimerą

posiadającą część komórek zmodyfikowanych i

część niemodyfikowanych. Jeżeli cecha zostanie

przekazana komórkom rozrodczym to dany osobnik

przekaże daną cechę potomnemu pokoleniu, które

będzie heterozygotyczne. Dopiero skrzyżowanie

dwóch heterozygot może prowadzić do otrzymania

homozygotycznego

osobnika

z

całkowicie

wyłączonym

genem

na

obu

chromosomach

homologicznych.

Wadą tej metody jest to że znajduje

ona zastosowanie jedynie u myszy.

Transplantacja jąder komórkowych

Zaletą tej metody jest to, że znajduje zastosowanie

u wielu innych gatunków niż wcześniej opisana.

Metoda ta zwana jest również klonowaniem

somatycznym.

Wykorzystuje

wiele

rodzajów

komórek

somatycznych

mogących

być

wykorzystywanymi do modyfikacji w podobny

sposób co mysie komórki embryo ste cells.

Zmodyfikowaną wcześniej komórkę knock-out

umieszcza się w pobliżu oocytu pozbawionego

wcześniej jądra komórkowego. Następnie w procesie

elektrofuzji wykorzystującego pole elektryczne łączy

się obie komórki i w ten sposób otrzymuje się

zarodek jednokomórkowy. Rozwój takiego zarodka

jest

kierowany

początkowo

przez

składniki

znajdujące się w cytoplazmie oocytu, a nstępnie

funkcję tą pełni jądro komórki somatycznej.