Metody Spektroskopowe

•1 H NMR

•13 C NMR

•31 P NMR

•15 N NMR

•Widma Wielowymiarowe

•Spektrometria Masowa

Magnetyczny Rezonans Jądrowy wykorzystuje zjawisko absorpcji i emisji energii

w postaci fali elektromagnetycznej o częstotliwości radiowej przez jądra

określonych izotopów,umieszczonych w silnym polu magnetycznym.

Zastosowanie NMR

•Chemia Organiczna

- Identyfikacja i ustalanie struktury związków organicznych

- Badanie oddziaływań na poziomie cząsteczkowym

•Biochemia i Biologia Molekularna

- Badanie struktury białek

- Badanie struktury kwasów nukleinowych

- Oddzialywanie biomolekul z ligandami

•Medycyna

-Tomografia obrazowa

-NMR

Interpretacja widma 1 H-NMR

Przesunięciem chemicznym ó nazywamy różnicę częstotliwości rezonansowej

protonu lub grupy protonów w stosunku do częstotliwości

rezonansowej wzorca (TMS tetrametylosilan).Przesunięcie chemiczne wyrażamy w ppm (part per milion)

Przesunięcie chemiczne zależy od otoczenia chemicznego.

Sprzężenie spinowo-spinowe To rozszczepienie sygnału protonu lub grupy protonów na kilka linii

tworzących multiplet (d,t ,q ...),na skutek oddziaływania z sąsiednimi jądrami o właściwościach

magnetycznych. Odległość między sąsiednimi liniami w multiplecie,zmierzona w Hz nazywa się

stałą sprzężenia J.Analiza sprzężenia spinowo-spinowego dostarcza istotnych informacji o budowie związku.

Przygotowanie próbki do eksperymentu NMR

•Standardowe rurki szklane o średnicy od 4 lub 1O mm

•1 - 1O mg związku organicznego rozpuszczonego w deuterowanym rozpuszczalniku (0.5- 2ml)

•Substancja wzorcowa dodawana jako wzorzec wewnętrzny lub zewnętrzny

•Tetrametylosilan lub sulfonian tetrametylosilanu

Zalety wzorca

•Silny sygnał 12 protonów na "krawędzi' widma

•Dobra rozpuszczalność w większości rozpuszczalników organicznych

•Łatwy do usunięcia - niska temperatura wrzenia

•Nieaktywny względem innych związków

•Nie nakłada się z innymi sygnałami

•Uniwersalny wzorzec zarówno do 1H, jak i 13C NMR

Spin cząstek elementarnych

•Cząstki elementarne posiadają trzy podstawowe właściwości: masę, ładunek i spin.

•Spin jest własnym momentem pędu cząstki elementarnej

•Spin jest wielkością tensorową, zależną od kierunku ruchu cząsteczki

•Cząsteczki będące aglomeratem cząstek elementarnych, np. jądra atomowe, posiadają swój spin,

będący sumą wektorową spinów składowych cząstek elementarnych

•Spin cząstek elementarnych ma wartość(+/-) %

•Kwantowa liczba spinowa jądra (l) może przyjmować wartości O, 1/2, 1, 3/2, 2, 5/2.

Poziomy energetyczne jąder w polu magnetycznym

Z ruchem wirowym jadra związany jest jego wektor momentu pędu "s" zwany spinem jądrowym

s=h/2pi x pier I(I+1)

Jądra atomowe wykazujące właściwości magnetyczne

I różne od 0

można uważać za jądrowe dipole magnetyczne "mi"

mi=yS /11>

Liczba możliwych poziomów energetycznych jadra

N=2I + 1

Czułość NMR/MRI - Im silniejsze pole magnetyczne tym wyższa energia związana ze zmianą

stanu energetycznego,tym silniejszy sygnał MR

Precesja spinu pod wpływem zewnętrznego pola magnetycznego

Spiny zachowują się w ten sposób gdyż posiadają zarówno kątowy jak i magnetyczny moment.

Klasycznym analogiem ruchu precesyjnego jąder jest dziecięcy bączek. Różnica polegn na tym,

że bączek po pewnym czasie upada, natoniast jadro kręci się caly czas.

Orientacja momentu magnetycznego protonów w polu magnetycznym

Jądra posiadające moment magnetyczny zgodny z kierunkiem pola magnetycznego mają niską

energię, natomiast te, których moment skierowany jest przeciwnie do kierunku pola mają

wysoką energię.

Sposoby rejestracj widma NMR

Absorpcyjny

•Próbkę naświetlamy promieniowaniem radiowym o wąskim zakresie częstotliwości

•Płynnie zmieniamy częstotliwość

•Mierzymy ilość pochloniętego promieniowania

•Rejestrujemy widmo

Emisyjny

•Próbkę naświetlamy krótkim silnym impulsem promieniowania radiowego o szerokim zakresie

częstotliwości

•Próbka pochłania energie i przechodzi w stan wzbudzony

•Próbka powracając do stanu normalnego emituje widmo

•Akumulujemy kilkaset sygnałów

•Dokonujemy transformacji Furiera

•Rejestrujemy obliczone widmo

Zalety i wady obu metod

ABS

•Prosta technicznie i obliczeniowo

•Mało precyzyjna

•Konieczne wysokie stężenie badanego związku

•Ma znaczenie głownie historyczne

EMI

•Pozwala wykonywać widma z miligramowych ilości związku

•Można akumulować tysiące impulsów

•Pozwala na stosowanie zaawansowanych technik (2D, 3D, odsprzęganie)

•Pozwala na rejestracje widm izotopów śladowych np 13C

•Widma absorpcyjne i emisyjne są praktycznie identyczne.

•Nie zmieniają si ę : przesuniecie chemiczne , stale sprzężenia, integracja

•Wymaga skomplikowanej aparatury i oprogramowania

Przesunięcie chemiczne "ó" protonów związanych ze szkieletem węglowym

•Zależy od hybrydyzacji atomów węgla

•Zależy od polarności grup funkcyjnych w sąsiedztwie

•Podobne podstawniki w podobny sposób wpływają na przesunięcie

•W niewielki sposób zależy od rodzaju rozpuszczalnika, stężenia próbki i sposobu wykonania eksperymentu

•Ostre, dobrze zarysowane piki

•Liczbę protonów w sygnale pokazuje integracja

•Sygnały protonów o podobnym przesunięciu mogą się nakładać

Efekt odciągnięcia elektronów przez elektroujemny podstawnik jest widoczny

w postaci zwiększenia przesunięcia chemicznego

Przesunięcie chemiczne "ó" protonów związanych z heteroatomami

•Zależy od rodzaju grupy funkcyjnej

•Słabo zależy od polarości grup funkcyjnych w sąsiedztwie

•Zależy od rodzaju rozpuszczalnika, stężenia próbki i sposobu wykonania eksperymentu

•Piki są najczęściej mało ostre bądź rozmyte

•Integracja może być zaniżona

•W niektórych polarnych deutercwanych rozpuszczalnikach sygnał protonów związanych z

heteroatomami może być niewidoczny

Mechanizm przekazywania sprzężenia spinowo-spinowego

•Stan magnetyczny sąsiednich jąder wpływa na spin elektronów walencyjnych wokół tych

jąder i za pośrednictwem wiązań chemicznych jest przekazywany na elektrony walencyjne

analizowanego jądra.

•W ten sposób częstotliwość rezonansowa analizowanego jądra jest odzwierciedleniem

stanów energetycznych jąder sąsiednich.

•Silniejszy wpływ (łatwość przekazywania sygnału) stanu energetycznego jąder sąsiednich

wyraża się zwiększeniem wartosci stałej sprzężenia.

Sprzężenie spinowo-spinowe

•sprzężenie spinowo-spinowe s-s może być przekazywane za pośrednictwem wiązań chemicznych

lub przez przestrzeń dla jąder znajdujących się blisko w przestrzeni, ale nie połączonych

wiązaniami chemicznymi.

•sprzężenie spinowo-spinowe może zachodzić pomiędzy jądrami tego samego rodzaju np. H-H,

lub pomiędzy różnymi jądrami np . H-P , H-F.

•Nie zależy od sposobu wykonania eksperymentu i siły pola magnetycznego

Właściwości sprzężenia spinowo-spinowego

•Miarą siły sprzężenia spinowo-spinowego jest stała sprzężenia J wyrażana w Hz

•Stała sprzężenia zależy od rodzajów jąder

•Stała sprzężenia zależy od ilości i rodzaju wiązań chemicznych pomiędzy oddziaływującymi jądrami

•Wiązania wielokrotne zwiększają wartość stałej sprzężenia spinowo-spinowego

•Stała sprzężenia zależy od konformacji cząsteczki, wzajemnego usytuowania jąder

•Stała sprzężenia przenosi się z taka sama siłą w obu kierunkach oddziaływujących jąder

Sprzężenia spinowo-spinowego nie obserwujemy

•Gdy jądra oddalone są o więcej niż pięć wiązań

•Gdy protony są równoważne chemicznie

•Gdy w łańcuchu sprzężenia vvystępują heteroatomy (wyjątkiem są układy heterocykliczne)

•Gdy protony związane są z heteroatomami (wyjątkiem są protony amidowe)

•Gdy różnica przesunięć chemicznych jest mniejsza od stałej sprzężenia

•Gdy czułość aparatu jest mniejsza od stałej sprzężenia

•Gdy sprzęgające się grupy ulegają szybkim zmianom konformacyjnym

Protony wicynalne i geminalne

•Sprzężenia między protonami vicynalnymi są najczęściej analizowane na widmach 1H NMR

•Sprężenia między protonami geminalnymi są widoczne tylko gdy mają inne otoczenia chemiczne np.

w układach cyklicznych lub w pobliżu centrum asymetrii

Konsekwencje wykonywania pomiarów w silnym polu magnetycznym:

•Przesunięcie chemiczne nie zmienia się przy zmianie natężenia pola

•Stała sprzężenia nie zmienia się przy zmianie natężenia pola

•Zmienia się stosunek deltav/J

•Powoduje to zwężenie i rozsunięcie się sygnałów

•Ułatwia interpretację widma

•Graficzny obraz widma jest mniej czytelny - konieczny jest numeryczny opis pików

Impulsowa rejestracja widma NMR

•Silny krótkotrwały impuls wprowadza jądra w wyższy stan energetyczny

•Jądra wracając do stanu równowagi emitują sygnał

•Sygnał zaniku swobodnej precesji (FID -Free lnduction Decay)

•Sygnał FID jest przekształcany poprzez transformację Fouriera w funkcję amplituda

sygnału -częstotliwość - czyli "normalne" widmo

Rodzaje impulsów

•Rejestrujące, przygotowujące , odsprzęgające

•wąsko i szerokopasmowe

•Ukierunkowane i nieukierunkowane

•Krótkotrwale, długotrwałe i ciągłe

•Czas zaniku sygnału FID- czas relaksacji

Odsprżęganie

•Odsprzęganiem nazywamy proces naświetlania sąsiednich jader odpowiadającą im częstotliwością

rezonansową w celu przeprowadzenia ich w wyższy stan energetyczny w wyniku czego nie powodują

rozszczepienia sygnału badanych jąder

•Odsprzęganie homo i heterojądrowe

Widma- ATP

Attache Proton Test

•Stosowana jest sekwencja impulsów SEFT

(Spin Echo Fourier Transform)

•Sygnały atomów węgli związanych z nieparzystą liczbą protonów CH3 i CH są ujemne, a z

parzystą CH2 i C - dodatnie

•Czwartorzędowe atomy węgla są widoczne

Widma 13C i 1H COSY

COrelatione SpectrascopY

•Są to widma dwuwymiarowe ; na jednej osi są widoczne przesunięcia protonów a na drugiej atomów węgla.

•Na osiach znajdują się również widma jednowymiarowe 1H i 13C.

•W trakcie rejestracji widma COSY sygnał przygotowujący ma częstotliwość protonowa, a rejestrujący węglową.

•Widma te sa często zwane HETCOR l (HETeronuclear CORelations)

Korelacja dalekiego zasięgu

•W celu wykrycia sprzężeń dalekiego zasięgu przez dwa lub więcej wiązań stosuje się metodę HMBC

(Heteronuclear Multiple Band Coherence) .

•Obserwowane są sygnały o małych stałych sprzężeniach od O do 40 Hz.

Podobieńsw w spektroskopii 1H i 13C NMR

•Kwantowa spinowa liczba magnetyczna 1/2

•Widmo wykonywane w tej samej temperaturze

•Widmo wykonywane metodą impulsową

•identyczny sposób przygotowania próbki-rozpuszczenie w deuterowanym rozpuszczalniku

•Ten sam wzorzec częstotliwości TMS

•Możliwość wykonania widma z tej samej próbki (przy odpowiednio dużym jej stężeniu)

•Podobne czynniki wpływające na przesunięcie chemiczne

Różnice w spektroskopii 1H i 13C NMR

•1H NMR - Ilość substancji niezbędna do wykonania widma poniżej 1 mg

-iest bardziej czułY i łatwiejszy do wykonania

-Ilość linii w multiplecie jest zależna od ilości protonów związanych z sąsiednim atomem

węgla (lub atomami węgla)

•13C NMR - powyżej 1 mg na każdy atom węgla w analizowanym związku

-wymaga dłuższego czasu do otrzymania 13C spectrum

-Ilość linii w multipiecie jest zależna od ilości protonów bezpośrednio związanych z danym węglem

Składowe widma analizowane w spektroskopii 1H i 13C NMR

1H - Przesunięcie chemiczne

Sprzężenie spinowo - spinowe

Integracja

13C Przesuniecie chemiczne

Intensywność pików jako in formacja pomocnicza

Metoda "off rezonance"

•Użycie częstotliwości odsprzęgaJacej nieco powyżej lub poniżej częstotliwości rezonansowej protonów

powoduje zwężenie multipletów węglowych, w których obserwujemy tylko resztkowe stałe sprzężenia.

•Z liczby linii w multipletach możemy wnioskować o liczbie protonów bezpośrednio związanych z węglem

(CH3 - q, CH2 - t, CH -d).

•Widoczne są tylko resztkowe stałe sprzężenia przez jedno wiązanie.

•Niekiedy informacja o krotności multipletów podawana jest w formie liter w pobliżu pliku.

Selektywne odsprzęganie protonów

•W widmie 1H NMR można zidentyfikować częstotliwości rezonansowe wszysikich protonów.

•W 13C NMR można zas tosować wąskopasmowe odsprzęganię pojedynczych protonów lub grupy protonów i na

widmie widoczne są singlety węgli związanych z danym protonem, natomiast pozostałe atomy węgli są

szczątkowymi multipletami.

Metoda DEPT

•stosując odpowiednia sekwencje impulsów mozna zroznicowac intensywnos sygnałow weglowych grup CH3, CH2, CH

• Istnieja dwa sposoby zapisu widma DEPT

-sygnały wegli CH3 i CH z dodatnia intensywnoscia, a CH2 z ujemna

- wszytskie grupy CH3, CH2 i CH rejestrowane sa na oddzielnych widmach

-wegle czwartrzedowe sa niewidoczne

Dlaczego nie analizujemy sprzężenia spinowo spinOwego na widmach 13 C NMR

•Widma rejestrujemy standardowo z odsprzęganiem sygnałów protonowych

•Siałe sprzężenia H-13C są bardzo duże od 120-270Hz

•Sprzężenie 13C-13C jest niewidoczne ponieważ prawdopodobieństwo wystąpienia dwu izotopów 13C

obok siebie w szkielecie węglowym jest 1·10-4 (1%x1%)

Impulsowa rejestracja widma NMR

•Silny królkotlwały impuls wprowadza jądra w wyższy stan energetyczny

•Jądra wracając do stanu równowagi emitują sygnał

•Sygnał zaniku swobodnej precesji (FID-Free lnduclion Decay)

•Sygnał FID jest przekształcany poprzez transformację Fouriera w funkcję amplituda sygnału - częstotliwość

czyli "normalne" widmo

Odsprzęganie protonów w spektroskopii 13C NMR

•Odsprzęganiem nazywamy proces naświetlania jąder 1H odpowiadającą im częstotliwością rezonansową w celu

przeprowadzenia ich w wyższy stan energetyczny, w wyniku czego nie powodują one rozszczepienia sygnału

badanych jąder 13C

•Odsprzęganie heterojądrowe

•Odsprzęganie całkowite

•Odsprzęganie selektywne (np.tylko Ar)

•Odsprzęganie z NOE i bez NOE

Jądrowy efekt Overhausera NOE

•NAzywamy transfer energii wzbudzenia z jednych jader na drugie na skutek zakłocenia przejsc pomiedzy

poziomami enegetycznym

•zachodzi pomiedzy jadrami oddziaływujacymi ze soba dipolowo

•jest tym skuteczniejsz im blizez znajduja sie odddziałujace jadra

integracja na widmie 13C NMR jest zafałszowana

•Atomy wegla posiadaja bardzo rozny czas relaksacji

•atomy o dlugim czasie relaksacji maja obnizaona intensywnosc sygnału na widmie

•W procesie odsprzęgania energia jest przekazywanaze wzbudzonych atomów wodoru na sąsiednie atomy

węgla (Zjawisko NOE)

•Sygnały atomów węgla związane z 3 atomami wodoru mają większą intensywność od węgli 4-to rzędowych

Wpływ czasu relaksacji na intensywność sygnału

-Atomy węgla o królkim czasie relaksacji posiadają kilka protonów lub są w elastycznym

fragmencie cząsteczki

-Atomy węgla o dlugim czasie relaksacji, najczęściej są IV rzędowe lub są w sztyvvnym fragmencie

cząsteczkl i mają niska intensywność

Wpływ efektu NOE na intensywność sygnałów w widmie 13C NMR

•Sygnał odsprzęgania wprowadza atomy wodoru w wyższy stan energetyczny

•Znajdujące się w stanie wzbudzonym jądra 1H przekazują sąsiednim jądrom (np. 13C) stan wzbudzenia

•Transfer energii odbywa się poprzez przestrzeń na skutek oddziaływania dipol-dipol

•Na skutek dodatkowej porcji energii atomy węgla związane z większą liczbą wodorów emitują silniejszy

sygnał i tworzą intensywniejsze piki na widmie

Przesunięcie chemiczne w widmach 13C NMR

1. O przesunięciu chemicznym decydują te same dwa główne czynniki jak w 1H NMR

-Hybrydyzacja i otoczenie chemiczne danego węgla

-Obecność polarnych podstawników w sąsiedztwie

2. Zakres przesunięć chemicznych jest znaczne większy od O -250ppm (0-15ppm w1HNMR)

3. zakresy przesunięć poszczególnych typów węgli są proporcjonalne do przesunięć związanych z

nim i wodorów

Widma-ATP Attache Proton Test

•Stosowana jest sekwencja impulsów SEFT (Spin Echo Fourier Trans form)

•Sygnały atomów węgli związanych z nieparzystą liczbą protonów CH3 i CH są ujemne , a z

parzystą CH2 i C - dodatnie

•Czwartorzędowe atomy węgla są widoczne

Spektrometria masowa

Spektrometrią masową (MS) nazywamy zbiór technik analitycznych, które pole gają na

przeprowadzeniu próbki w stan zjonizowany i analizie powstałych jonów z

uwzględnieniem stosunku ich masy do ładunku

Wykorzysta nie spektrometrii masowej w chemii organicznej

• Określenie masy cząsteczkowej badanego związku

• Identyfikacja związku poprzez porównanie z widmami umieszczonymi w bazach danych

• Wyznaczenie wzoru sumarycznego związku (na podstawie intensywności pików izotopowych i

precyzyjnej masy)

• Analiza budowy związku na podstawie fragmentacji

• Możliwość połączenia spektrometru masowego z chromatografem gazowym i cieczowym

• Możliwość połączenia ze sobą dwóch spektrometrów masowych w uklad tandemowy

Wykorzystanie spektrometrii masowej w biochemii

• Określenie masy cząsteczkowej bialek i kwasów nukleinowych

• Identyfikacja modylikacji potranstacyjnych (glikozylacja , fosforylacja. metylacja itp)

• O kres lenie s topn ia utlenieni a resz t cysteinowych

• Sekwencjonowanie białek

• Analiza bialek homologicznych podstawie znanych fragmentów

• Możliwość połączenia spektrometru masowego z chromatografem cieczowym FPLC

Budowa spektrometru masowego

Układ wprowadzenia probki - komora jonizacyjan - analizator - detektor - system rejestracji danych

panuje wysoka proznia w spektrometrze masowym

Metody wprowadzania próbki

•wprowadzanie bez pośrednie (mikrocylinder, płytka)

•wlot zimny

•wlot gorący

•układ wprowadzania z chromatografu gazowego

•układ wprowadzania z chromatografu cieczowego (taśmowy, spray)

Metody jonizacji próbki

•jonizacja elektronami (El, DEI)

•jonizacja chemiczna (CI)

•bombardowanie szybkimi atomami (FAB)

•spektrometria masowa jonów wtórnych (SIMS)

•desorpcja laserowa (LD)

•termorozpylanie (TE)

•desorpcja laserowa z udziałem matrycy (MALDI)

•elektrarozpylanie (ESI)

Jonizacja elektronami ( Eiectron lonisation) -El

•jonizacja przy pomocy wiązki elektronów

•Jonizacja odbywa się w próżni .

•Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek.

•El charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością - poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.

Jonizacja chemiczna (Chemicallonisation) CI

•jony wytwarzane są na skutek zderzeń cząsteczek badanego związku chemicznego z jonami pierwotnymi

obecnymi w źródle jonów.

•Jest to metoda nie powodująca fragmentacji cząsteczek (łagodna jonizacja) .

•Jonizacja odbywa się zwykle przy ciśnieniu rzędu 60 Pa.

Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom Bombardment) (FAB)

• polega na bombardowaniu cząsteczki obojętnymi atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70 eV ).

• Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej

substancji (matrycy) np. glicerolu

Spektrometria masowa jonów wtórnych

(secondary lon Mass Spectrometry) - SIMS

•Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących prąd lub substancji naniesionych

na metalowe płytki.

•Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu .

•Istnieje odmiana techniki SIMS w której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy

(najczęściej glicerolu). Technika ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary lon Mass

Spectrometry) lub FIB (Fast lon Bombardment) .

Desorpcja laserowa (Laser desorplion) - LD

• jonizacja następuje przez naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami

są wysokoenergetyczne fotony .

Termorozpylanie (Termospray)- TE

• jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną

substancję wewnątrz stalowej kapilary . Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej

z prędkością naddźwiękową.

Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption lonisation) MALDI

•stosuje się jonizację laserową, z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji

cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich "wybijania" ze specjalnie przygotowanej

matrycy

•Matryca absorbuje energię lasera , która jest później przekazywana do analizowanych cząsteczek.

•Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad białkami i kwasami nukleinowymi.

Elektrarozpylanie (Eiectrospray) - ESI

•polega na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną substancję z kapilary, do której przyłożono

wysokie na pięcie ( 1 - 5 kV ) pod ciśnieniem atmosferycznym.

•Jest to jedna z łagodnych metod jonizacj i - zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek.

•Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad związkami wielkocząsteczkowymi.

Analizatory m /z

•magnetyczny

•magnetyczno-elektrostatyczny

•czasu przelotu (TOF)

•kwadrupolewy

•pułapka jonowa

•liniowa pułapka jonowa

•cyklotronowy analizalor jonów z transformacją Fouriera

Analizator magnetyczno -elektrostatyczny. Sektor magnetyczny

•wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym

•Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień zakrzywienia lotu zależy od stosunku masy

do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od parametrów pola magnetycznego.

•Sektor magnetyczny charakteryzuje się stosunkowo małą rozdzielczością. Związane jest to glównie

z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem ten rozwiązuje

przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki

są rozpędzane. dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.

Sektor elektryczny

•urządzenie to wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu elektrosta tycznym ,

•jest zbudowane z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny

•Jony o jednakowej energii translacyjnej maja jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za tym

sektorem znajduje się szczelina przez którą przelatują jony tylko o określonej energii .

•Sektory elektryczne stosowane są przed sektorami magnetycznymi w spektrometrach masowych o

podwójnym ogniskowaniu.

Analizator czasu przelotu (Time Of Flight) TOF

•jony wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają

dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów

połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia

okreś lonego jonu w detektor.

•Pomiar m/z jest oparty na fakcie, że ze wzrostem masy cząsteczkowej jonów, wydłuża się ich

czas przelotu. Obecnie stosuje się często analizatory czasu przelotu ze zwierciadłem

elektrostatycznym. który zwiększa rozdzielczość aparatu, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych

mas cząsteczkowych.

•Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami oraz dużą czułością

•Są najczęściej stosowane razem z jonizatorami MALDI.

Analizator kwadrupolewy

•analizator ten jest zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów.

•Działa jako filtr masy - w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku

masy do ładunkU (m/z). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu

zmiennego określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego.

•Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczai jony o szerokim lub wąskim zakresie m/z.

•Jony przechodzące przez kwadrupol mogą być poddawane dalszej analizie

Pułapka jonowa (ion trap) - IT

•pozwala on na przetrzymywanie jonów i działa na zasadzie podobnej do kwadrupola

•Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony

o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub można uwięzić jony o szerokim zakresie m/z.

•Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w pułapce jonów o szerokim zakresie m/z i

wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym m/z.

•Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem obojętnym - helem, o ciśnieniu 10-1 Pa

•Jeżeli jony w pułapce zostaną wzbudzone (przyspieszone), zderzenia z atomami helu

spowodują fragmentację jonów.

•Pułapki jonowe charakteryzuj ą się zwykle dość niewielką

rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz ba rdzo dużą czułością.

Liniowa pułapka jonowa (linear lon Trap, Linear Trap Quadrupo/e) - LTQ

•jest zbudowana, jak kwadrupol, z czterech równoległych

prętów. Na obu końcach analizatora przy kładany jest

potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę jonów z

analizatora.

•Pomiar masy odbywa s ię przez wyrzucanie jonów o

określonym m/z z analizatrora i detekcję.

•W liniowych pułapkach jonowych stosuje się częs to dwa

detektory, co zwiększa czułość . Liniowe pułapki jonowe

charakteryzują się bardzo dużą czułością (większą niż zwykłe

pułapki jonowe) i stosunkowo niską rozdzielczością.

•W liniowej pułapce jonowej, jony mozna przechowywać,

poddawać fragmentacji i mierzyć masy fragmentów.

Cyklotronowy analizator jonów z transformacją Fourier a

•wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym.

•Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy .

•W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia - ciśnienie nie

większe niż 10-4Pa. 10-6Pa lub mniejsze.

•Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże,

zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy m/z

500 Th). Rozdzielczości tych analizatorów szybko zmniejszają się

wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.

•W analizatorze FT-ICR przy pomocy zlożonej fali

elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony.

Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele

częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym m/z . Sygnał

ten jest przekształcany w widmo m/z przy pomocy Transformacji Fouriera.

Detektory

•puszka Faradaya

•powielacz elektronowy

•mikrokanalikowy

•fotopowielaczowy

•cyklotronowego rezonansu jonów

Puszka Faradaya

•Jest to metalowa, cylindryczn a komora z

otworem przez który wlatują jony.

•Jony wpadające do detektora trafiają na dno

puszki i oddają swój ładunek.

•Powstający w ten sposób prąd jest mierzony.

•Detektory te charakteryzują się małą czułością.

Detektor- powielacz elektronowy

•zbudowany jest z serii płytek. do których przylączono wysokie

napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę

konwersyjną), powodują emisję elektronów . Elektrony te uderzają w

kolejną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby

elektronów . z każdej, kolejnej płytki detektora wybijane jest coraz

więcej elektronów - sygnał jest wzmacniany.

•Elektrony trafiają ostatecznie na anodę powodując przepływ prądu,

który jest mierzony.

•W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod

zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz

elektronowy o dynodzie ciągłej).

•Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję

kolejnych elektronów . Dzięki kaskadowemu wzmocnieniu sygnału

powielacze elektronowe są detektorami bardzo czutymi.

Detektor mikrokanalikowy

•zbudowany jest z płytki z niewielkimi (4- 25 ~m) ,

zakrzywionymi otworami.

•Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem

mającym zdolność emisji elektronów.

•Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał

ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony

wyjściowej .

•Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami

otworów powodując kaskadową emisję elektronów . podobnie

jak w powielaczu elektronowym.

•Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda

zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób jest

mierzony.

Detektor fotopowielaczowy

•składa się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla

jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu

fluorescencyjnego i fotopowielacza

•Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę

konwersyjną powodując emisję elektronów.

•Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy

pomocy pola elektrycznego.

•Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony,

które trafiają do fotopowielacza

•Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest

rejestrowany .

Detektor cyklotronowego rezonansu jonów

•Analizatory ICR są jednocześnie detektorami jonów, nie

wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.

Rodzaje pików na widmie masowym

•Pik molekularny - to pik odpowiadający masie

cząsteczkowej badanego związku, przy założeniu, że

cząsteczka jest zbudowana z najlżejszych izotopów.

•Pozorny pik molekularny - odpowiada masie badanego

związku powiększonego o masę czynnika jonizującego

(H', Na' , Li ', C4H5 · ).

•Pik izotopowy - to pik odpowiadający masie badanego

związku, w którego cząsteczce jeden lub więcej atomów

zostało zastąpione cięższymi izotopami (M+1, M+ 2,

M+3 ).

•Pik główny - to najwyższy pik na widmie , któremu

przypisujemy intensywność 100%

•Piki fragmentacyjne - są to piki powstałe na skutek

rozpadu cząsteczk i w wyniku jonizacji.