Kwas cytrynowy

Kwas cytrynowy (2-hydroksyl,2,3-propanotrikarboksylowy) o M

cz

=192 i temperaturze topnienia

153°C po raz pierwszy zostal wyizolowany z soku cytryn. Wystepuje w postaci bezwodnej lub

jedno wodnej. Jednowodna forma kwasu cytrynowego otrzymywana jest przez krystalizacje w

temperaturze ponizej 36,6°C, powyzej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy

jest mocnym kwasem organicznym, o czym decyduja stale dysocjacji wynoszace w 18°C

odpowiednio, K

1

=8,7x10

-4

, K

2

=1,77xl0

-5

,K

3

=1,0xl0

-7

. Rozpuszczalnosc w wodzie w temperaturze

20°C wynosi 73,3 g/100 cm

3

, w alkoholu w temperaturze 15°C 75,91 g/100 cm

3

. Kwas cytrynowy

otrzymywany jest wylacznie na drodze biologicznej z substratów naturalnych odtwarzalnych

(pochodzenia roslinnego), co miedzy innymi decyduje o oplacalnosci produkcji. Swiatowa

produkcja kwasu cytrynowego przekracza 300 000 ton rocznie, jej rozmiary podyktowane sa duzym

zapotrzebowaniem na ten kwas, glównie, bo az w 80%, przez przemysl spozywczy, lecz takze

farmaceutyczny, chemiczny i metalurgiczny. Szerokie wykorzystanie kwasu cytrynowego w

przemysle spozywczym wynika z jego dzialania konserwujacego na skutek obnizania wartosci pH

srodowiska. Jest jednoczesnie zwiazkiem nietoksycznym, o dobrych cechach smakowych i

zapachowych. Glównie z tych wzgledów kwas cytrynowy zostal dopuszczony przez FAO/WHO

bez ograniczen do produkcji zywnosci. Kwas ten stosowany jest w przemysle owocowo-

warzywnym jako inaktywator enzymów (oksydaz), które odpowiedzialne sa za utlenianie zwiazków

fenolowych, powodujacych ciemnienie owoców i warzyw. Wykorzystywany jest równiez do

produkcji napojów, slodyczy, owoców kandyzowanych, a takze w produkcji win, jako preparat

zakwaszajacy i stabilizujacy. Tworzenie przez kwas cytrynowy kompleksowych polaczen z jonami

metali (Fe,Cu, Zn) zadecydowalo o jego szerokim zastosowaniu jako stabilizatora (antyoksydanta)

olejów. Poprzez wiazanie metali katalizujacych proces jelczenia tluszczów, kwas cytrynowy

przerywa reakcje tworzenia nadtlenków i innych produktów powstalych w wyniku utleniania

nienasyconych kwasów tluszczowych w procesie autooksydacji olejów.

Wlasciwosci tworzenia kompleksów z metalami ciezkimi wyznaczylo szeroki obszar wykorzystania

kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem

powlokami ochronnymi. W przemysle farmaceutycznym stosowany jest jako dodatek do tabletek,

powodujac musujacy efekt podczas ich rozpuszczania w wodzie. Ponadto cytrynian trisodowy i

tripotasowy uzywany jest w Stacjach Krwiodawstwa jako preparat zapobiegajacy krzepnieciu krwi.

W technologiach chemicznych kwas cytrynowy, a zwlaszcza jego sole (np.cytrynian trisodowy),

znalazly szerokie wykorzystanie w chemii gospodarczej wypierajac trudno biodegradowane

fosforany ze skladu detergentów. Estry kwasu cytrynowego i alkoholi alifatycznych, np. ester

trietylowy, tributylowy, znalazly zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w masach

plastycznych, z których wytwarza sie cienkie powloki (filmy) ochraniajace zywnosc. Wodne 24%

roztwory kwasu cytrynowego stosowane sa w mleczarstwie do usuwania z aparatury tzw. kamienia

mlecznego, tj. osadu utworzonego z bialka, tluszczu i soli mineralnych mleka. Producentami kwasu

cytrynowego sa wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, Aspergillus wentii oraz liczne

drozdze z rodzaju Candida (Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida intermedia), które

syntetyzuja kwas cytrynowy w srodowiskach zawierajacych n-alkany. Wsród szczepów z gatunku

Candida lipolytica zostal wyselekcjonowany szczep, u którego stwierdzono cykl plciowy, co

odróznialo go od innych. W 1972 roku Yarrow na podstawie szczególowych badan wskazujacych

na wiele unikalnych cech dotyczacych morfologii askospor nadal mu nazwe Yarrowia lipolytica.

Gatunek ten wyróznia sie szczególna wlasciwoscia syntetyzowania kwasu cytrynowego z n-parafin,

co stawia go w szeregu cennych szczepów przemyslowych.

W praktyce przemyslowej najwieksze znaczenie maja jednak szczepy Aspergillus niger. Proces

produkcyjny jest prowadzony metoda powierzchniowa LFS (ang. Liquid Surface Fermentation),

wglebna SmF (ang. Submerged Fermentation) oraz na pozywkach stalych, tzw. proces SSF (ang.

Solid State Fermentation). Ta ostatnia metoda najpowszechniej rozwinela sie w Japonii, gdzie 20%

ilosci kwasu cytrynowego wytwarzanego na drodze biologicznej pochodzi z procesu na podlozu

stalym. W metodzie tej surowcem moga byc otreby, wytloki z trzciny cukrowej (o wilgotnosci nie

mniejszej niz 40%), wadliwa melasa buraczana czy trzcinowa, która z uwagi na niewlasciwy sklad,

w tym obecnosc zwiazków toksycznych, nie mogla byc wykorzystana w pozostalych metodach. Ze

wzgledu na mozliwosc wykorzystania jako pozywek róznego rodzaju odpadowych surowców

roslinnych oraz mniejsze obciazenie sciekami, technologia ta spelnia warunki ekologiczne i w

ostatnich latach nabywa szczególnego znaczenia. Na podkreslenie zasluguje fakt, ze w tym procesie

nie potwierdza sie wiele mechanizmów wystepujacych w tradycyjnych sposobach otrzymywania

kwasu cytrynowego, np. wystepuje wyzsza tolerancja grzybni Aspergillus niger na stezenie w

podlozu jonów metali i mikroelementów. Inna metoda, z która zwiazana jest przyszlosc produkcji

kwasu cytrynowego, to hodowla ciagla i stosowanie immobilizowanych komórek grzybni

Aspergillus niger. Obecnie w swiatowej produkcji kwasu cytrynowego metoda wglebna jest

wiodaca i tylko okolo 30% kwasu otrzymywanego jest jeszcze metoda powierzchniowa.

Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego

Szczepy Aspergillus niger stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego otrzymane

zostaly w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczepów naturalnych. Techniki te,

mimo iz naleza do najstarszych, wciaz przynosza dobre rezultaty. W charakterze mutagenów

stosowane sa czynniki fizyczne, w tym glównie promieniowanie ultrafioletowe (o dlugosci fali

λ

=260 nm), chemiczne lub kombinacje obu tych grup. Selekcja szczepów po dzialaniach

mutagennych prowadzona jest wedlug kryterium przyszlego zastosowania. Praktyka wykazala

bowiem, ze szczepy zapewniajace wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego w procesie wglebnym na

podlozu mineralnym nie sprawdzaja sie w procesie powierzchniowym na podlozu melasowym.

Przyczyna tego jest zbyt bogata zawartosc w melasie buraczanej skladników mineralnych i

stymulatorów wzrostu w postaci zwiazków azotowych i fosforowych, co powoduje nadmierny

rozwój biomasy grzybni przy jednoczesnie oslabionej biosyntezie kwasu cytrynowego. Ulepszanie

szczepów Aspergillus niger do produkcji kwasu cytrynowego mozliwe jest takze w oparciu o

metody rekombinacji genetycznej, w których podstawowe znaczenie ma istnienie u plesni cyklu

paraseksualnego, umozliwiajacego przeprowadzenie hybrydyzacji i selekcje rekombinantów.

Doskonalenie szczepów do produkcji kwasu cytrynowego prowadzone jest na drodze fuzji

protoplastów miedzy odmianami Aspergillus niger rózniacymi sie wydajnoscia kwasu

cytrynowego, szybkoscia fermentacji czy tolerancja na skladniki podloza, celem otrzymania

szczepów o korzystnych cechach technologicznych. Istnieje mozliwosc tworzenia

miedzyrodzajowych fuzantów, np. pomiedzy Aspergillus niger i Trichoderma viride, wykazujacych

opornosc na analog glukozy, 2-deoksy-D-glukoze (tworzacy sie w srodowisku hodowlanym i

dzialajacy jako inhibitor enzymów glikolitycznych), przy zachowaniu wysokiej wydajnosci kwasu

cytrynowego.

W pracach ze szczepami przemyslowymi niezwykle waznym, a zarazem trudnym etapem, jest

zastosowanie wlasciwej metody przechowywania zapewniajacej stabilnosc cech materialu

biologicznego. Do przyjetych w praktyce metod nalezy liofilizacja, przechowywanie konidiów w

mieszaninie z jalowym piaskiem, weglem aktywnym lub cytrynianem wapnia. Istotna sprawa jest

równiez otrzymanie odpowiedniej ilosci i jakosci biochemicznej materialu szczepiennego, jakim sa

konidia szczepu przemyslowego. Stosowane pozywki sporulacyjne (pobudzajace wytwarzanie

konidiów) powinny indukowac w konidiach enzymy odpowiedzialne za synteze kwasu

cytrynowego. Najczesciej stosowane sa pozywki, które w swoim skladzie zawieraja niski poziom

wegla i azotu, natomiast wzbogacone sa w posredniki cyklu Krebsa. Praktyka wykazala, ze szczepy

przeznaczone do procesu wglebnego z uzyciem podloza mineralnego, aktywowane na podlozu

sporulacyjnym (ziemniaczano-glukozowo-agarowym o pH 6,0-7,0) zapewniaja wysoka wydajnosc

kwasu cytrynowego. Szczepy wykorzystywane w procesie powierzchniowym, w którym surowcem

jest melasa buraczana, wymagaja podloza sporulacyjnego zestalonego agarem, w którym obok

brzeczki slodowej w niewielkich ilosciach dodana jest melasa buraczana. Szczepy Aspergillus niger

stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego, na skutek pewnych zmian srodowiska

hodowlanego oraz sposobu przechowywania, moga swój dotychczasowy metabolizm,

ukierunkowany na synteze kwasu cytrynowego, zmienic na oksydacyjny, wynikiem czego jest

glównie produkcja biomasy. To czesto wystepujace zjawisko stwarza koniecznosc ciaglej selekcji

odmian o pozadanych cechach. Najczesciej przyjeta metoda skriningowa jest ocena wlasciwosci

kwaszacych poszczególnych osobników danej populacji i izolowanie najbardziej aktywnych. Testy

te przeprowadza sie na pozywkach stalych z dodatkiem wskaznika wartosci pH. Dalsza selekcja

szczepów odbywa sie na podstawie laboratoryjnych testów biologicznych w pozywkach

stosowanych w produkcji kwasu cytrynowego.

Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus

niger

Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niektórych odmian Aspergillus niger jest wynikiem zaklócen

w cyklu Krebsa wywolanych brakiem lub niska aktywnoscia enzymów odpowiedzialnych za jego

dalsza konwersje. Ten defekt biochemiczny jest uwarunkowany genotypowo, wiadomo jednak, ze

poprzez odpowiednie warunki hodowli aktywnosc szczepów w procesie biosyntezy moze byc

zintensyfikowana, zapewniajac wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego.

Korzystnymi warunkami procesu sa: wysokie stezenie cukru (ok. 10% w hodowli wglebnej i 16%

w hodowli powierzchniowej), niedobór jonów metali: Mn

+2

, Zn

+2

, Fe

+2

(<0,1 mg/100 cm

3

),

ograniczona ilosc zwiazków azotu i fosforu (limitacja wzrostu grzybni), niska wartosc pH, ok. 2,4-

2,6, dobre natlenienie srodowiska. Dwa ostatnie warunki odnosza sie glównie do procesu

wglebnego w pozywkach syntetycznych.

Kwas cytrynowy powstaje w poczatkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji

acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntaze cytrynianowa (rys. 1). W procesie

rozwoju grzybni (trofofaza), a nastepnie produkcji kwasu cytrynowego (idiofaza) heksozy

asymilowane sa w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozofosforanowym

(HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia sie w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustepuje

glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego. Zatem glównym regulatorem szybkosci glikolizy

jest fosfofruktokinaza, która staje sie jednoczesnie regulatorem biosyntezy kwasu cytrynowego.

Enzym ten jest wrazliwy na obecnosc cytrynianu w srodowisku, ale u szczepów Aspergillus niger w

procesie produkcji kwasu cytrynowego represja ta jest znoszona nadmiarem jonów NH

4+

w

komórkach, w wyniku zaklóconych przemian bialkowych spowodowanych niedoborem w podlozu

jonów Mn

2+

. Mechanizmem regulujacym biosynteze kwasu cytrynowego jest takze ograniczenie

syntezy ATP, który jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to istnienia w grzybni

alternatywnej tlenowej drogi oddechowej, jalowej energetycznie, a wiec nie blokujacej glikolizy.

Ten typ oddychania tlenowego, czesto wystepujacy u roslin, nie zostal jeszcze dokladnie zbadany u

szczepów Aspergillus niger. Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa oraz u

drozdzy z rodzajów Candida i Rhodotorula, najczesciej podczas przejscia z fazy logarytmicznego

wzrostu do fazy stacjonarnej. Alternatywna droga oddechowa ujawnia sie w momencie oslabienia

oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy

alternatywnej, ukladu enzymatycznego katalizujacego przenoszenie elektronów na tlen. Indukcje tej

oksydazy w komórkach grzybni moze wywolac:

- nagromadzenie sie NADH,

- zmniejszenie zapotrzebowania na ATP,

- niedobór ADP w mitochondriach,

- niedobór jonów Cu

+2

niezbednych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej.

Wymienione czynniki sprawiaja, ze cytoplazmatyczny koenzym NADH powstajacy w procesie

glikolizy jest utleniany z udzialem oksydazy alternatywnej szlakiem, w którym energia nie

wydziela sie w postaci ATP, lecz energii cieplnej. Mechanizm ten uruchamia sie przy rozkojarzeniu

fosforylacji oksydatywnej. Oksydaza alternatywnego oddychania cechuje sie, w odróznieniu od

oksydazy cytochromowej, niskim powinowactwem do tlenu. Oznacza to, ze dzialalnosc tego

enzymu wymaga znacznie wyzszego stezenia tlenu w srodowisku niz droga cytochromowa.

Badania wykazaly, ze dopiero stezenie tlenu powyzej 21% powoduje wzrost aktywnosci

oddychania alternatywnego. We wglebnym procesie otrzymywania kwasu cytrynowego, w fazie

produkcji przy intensywnym napowietrzaniu, moze byc wiec wzbudzana ta droga oddechowa.

Zaklócenie procesu wynikajace z braku doplywu tlenu moze spowodowac utrate tej aktywnosci i

przywrócenie oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej. Efektem tych zmian jest

zahamowanie syntezy kwasu cytrynowego na korzysc produkcji biomasy. Takie zjawisko

obserwuje sie podczas awarii systemu natleniania w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego

metoda wglebna.

Rys. 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: l - syntaza

cytrynianowa, 2,3- hydrataza akonitanowa, 4 - dehydrogenaza izocytrynianowa, 5 - dehydrogenaza 2-

ketoglutaranowa, 6 - liaza izocytrynianowa; pogrubione linie oznaczaja miejsca oslabionej aktywnosci

enzymatycznej

Do poznanych innych mechanizmów regulujacych synteze kwasu cytrynowego nalezy oslabienie

przemian enzymatycznych w cyklu Krebsa na etapach:

- hydratazy akonitanowej (hamowanej deficytem jonów Mn

2+

i Fe

2+

),

- mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej (hamowanej cytrynianem),

- dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stezeniem cukru i jonami NH

4+

).

Biosynteza kwasu cytrynowego u Aspergillus niger zwiazana jest takze z cyklem kwasów

dikarboksylowych - glioksalowym (rys. 1). Cykl ten przez reakcje anaplerotyczne (uzupelniajace)

dostarcza kwasu szczawiowego, który jest prekursorem kwasu cytrynowego.

Produkcja kwasu cytrynowego metoda powierzchniowa

Powszechne uzywanie okreslenia metoda powierzchniowa i metoda wglebna otrzymywania kwasu

cytrynowego wynika z odmiennych warunków hodowli, powodujacych rózna morfologie grzybni.

W metodzie powierzchniowej w warunkach statycznych grzybnia Aspergillus niger rozwija sie na

powierzchni pozywki, tworzac zwarta pleche zlozona z mocno rozgalezionych strzepek. W

metodzie wglebnej grzybnia rosnie w calej objetosci pozywki, tworzac w wyniku ciaglego jej ruchu

dosc zwarte fragmenty w formie grudek (pellets). Wspólna cecha obydwu metod otrzymywania

kwasu cytrynowego jest ich dwufazowosc. W pierwszej zachodzi intensywny rozwój grzybni, trwa

ona przewaznie do 72 godziny hodowli, po czym nastepuje druga faza, w której intensywnie

wytwarzany jest kwas cytrynowy przy ograniczonym wzroscie grzybni. W hodowli

powierzchniowej obydwie fazy przebiegaja w systemie jednostopniowym. W procesie wglebnym

pierwsza faza odbywa sie w podlozu inokulacyjnym, o skladzie rózniacym sie od fermentacyjnego,

glównie ze wzgledu na zmniejszona ilosc zródla wegla. Wegetatywny rozwój grzybni w obydwu

metodach rozpoczyna sie uaktywnianiem i kielkowaniem konidiów, wytwarzaniem kielka, a

nastepnie strzepki rostowej, która wydluzajac sie i rozgaleziajac, tworzy grzybnie o morfologii

odpowiadajacej warunkom hodowli. W metodzie powierzchniowego procesu otrzymywania kwasu

cytrynowego najczesciej stosowanym surowcem jest melasa buraczana. Melasa buraczana

zakwalifikowana jako surowiec jest rozcienczona do zawartosci sacharozy ok. 16%, a nastepnie

uzupelniona solami mineralnymi (KH

2

PO

4

– 0,008%, ZnSO

4

x 7H

2

0 – 0,0008% oraz K

4

Fe(CN)

6

-

ok. 0,08%); pH pozywki jest regulowane do wartosci 6,4-6,8. Dokladna ilosc K

4

Fe(CN)

6

musi byc

eksperymentalnie okreslona dla kazdej odmiany melasy buraczanej, poniewaz zelazocyjanek potasu

wytraca ze srodowiska metale ciezkie - Fe, Zn, Pb, których pewne ilosci sa niezbedne dla procesu

biosyntezy kwasu cytrynowego. Sterylna pozywke melasowa w objetosci 500-600 dm

3

rozlewa sie

za pomoca odpowiednich urzadzen do tac, o wymiarach 2 m dlugosci, 2,5 m szerokosci i 0,16 m

glebokosci. Tace sa sporzadzone ze stali kwasoodpornej i sa zamontowane na specjalnych

stelazach, umieszczanych w komorach z regulacja temperatury i napowietrzania. Kiedy temperatura

pozywki obnizy sie do wartosci 40°C, szczepi sie ja konidiami plesni zmieszanymi z weglem

aktywnym jako nosnikiem. Po 24 godzinnej inkubacji pojawia sie widoczna cienka grzybnia, której

intensywny wzrost trwa do 48-72 godzin, po czym slabnie na korzysc produkcji kwasu

cytrynowego. Dojrzala grzybnia osiaga grubosc 2-3 cm, jej warstwa dolna stykajaca sie z podlozem

jest odpowiedzialna za synteze kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu wynosi 168-216 godz. w

temp. 30°C, zapewniajac wydajnosc kwasu cytrynowego na poziomie 70-80% w stosunku do

poczatkowej ilosci cukru w pozywce. W tym procesie obok kwasu cytrynowego, stanowiacego

okolo 80% zawartosci wszystkich kwasów, do podloza wydzielany jest kwas szczawiowy i kwas

glukonowy oraz w sladowych ilosciach kwasy z cyklu Krebsa.

Zanieczyszczenia mikrobiologiczne

Zródlem zanieczyszczen mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu

cytrynowego jest przede wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym wystepuja glównie bakterie

z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a takze Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Zródlem tych

ostatnich bakterii oprócz melasy moze byc takze woda stosowana w procesie technologicznym, jesli

nie spelnia wymagan okreslonych norma. Wszystkie drobnoustroje wystepujace jako

zanieczyszczenia sa zdolne do redukcji azotanów (V) do azotanów (III), które dzialaja hamujaco na

rozwój grzybni. Badania wykazaly, ze w podlozu melasowym, po niewlasciwie przeprowadzonej

sterylizacji, moga pozostac zywe bakterie z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, wywierajace

antagonistyczny wplyw na rozwój grzybni Aspergillus niger. Sposród plesni najczestszym

zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. W procesie

technologicznym konidia tych plesni dostaja sie z powietrzem stosowanym do przewietrzania

komór, a takze wraz ze szczepionka konidiów Aspergillus niger podczas jej rozpylania na

powierzchnie pozywki. Plesnie te sa bogate w enzymy hydrolityczne, dzieki którym rozwijaja sie

na grzybni Aspergillus niger, powodujac jej lize. Aby uniknac skutków zanieczyszczen

mikrobiologicznych, nalezy stosowac aktywna szczepionke grzybni Asperillus niger, szybko

opanowujaca srodowisko i obnizajaca wartosc pH do poziomu hamujacego rozwój mikroflory

bakteryjnej. Podobnie jak w kazdym procesie biotechnologicznym musi byc zapewniona wysoka

czystosc aparatury i komór fermentacyjnych oraz powietrza do ich przewietrzania, poniewaz w

przeciwnym razie te srodowiska stac sie moga zródlem zanieczyszczenia rózna mikroflora,

zaklócajaca proces produkcji kwasu cytrynowego.

Wydzielanie kwasu cytrynowego z podloza hodowlanego

Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa sie tzw. metoda cytrynianowa. Polega ona na wytracaniu

na goraco cytrynianu wapnia, traktujac roztwór pofermentacyjny wodorotlenkiem wapnia.

Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca

3

(C

6

H

5

O

7

)

2

] po oddzieleniu od masy reakcyjnej zadaje sie

roztworem H

2

SO

4

, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej. Wytracony gips

oddziela sie przez filtracje, roztwór zas zageszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizacje.

Handlowy kwas cytrynowy wyodrebniony ta metoda jest zwiazany z jedna czasteczka wody

(C

6

H

5

O

7

xH

2

O). Metoda cytrynianowa jest bardzo uciazliwa dla przemyslowej produkcji kwasu

cytrynowego, z uwagi na duze zuzycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia, a takze

wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilosci gipsu. W Instytucie Technologii Przemyslu

Chemicznego i Spozywczego Akademii Ekonomicznej we Wroclawiu zostala opracowana metoda

wydzielania i oczyszczania kwasu cytrynowego tzw. metoda bezcytrynianowa. Moze byc ona

wykorzystana tylko w tych przypadkach, w których do biosyntezy kwasu cytrynowego stosowane

sa substraty o wysokiej czystosci, tj.: glukoza, skrobia, maczki cukrowe, a wiec glównie we

wglebnej hodowli Aspergillus niger. Metoda bezcytrynianowa polega na:

- dezaktywacji grzybni w temp. 70°C i oddzieleniu od roztworu hodowlanego,

- oczyszczeniu filtratu garbnikami i ziemia okrzemkowa,

- odbarwieniu na kolumnie weglowej,

- zatezeniu w wyparce prózniowej do 72% zawartosci kwasu cytrynowego,

- krystalizacji kwasu cytrynowego w temp. 7°C.

Wydajnosc krystalizacji kwasu cytrynowego wynosi okolo 50%. Odciek miedzykrystaliczny po

odbarwieniu weglem aktywnym oczyszcza sie na jonitach (kationit i anionit). Proces oczyszczania

jest tak prowadzony, aby oczyszczony odciek odpowiadal wymaganiom stawianym przez norme na

spozywczy kwas cytrynowy w plynie.

Powierzchniowa biosynteza kwasu cytrynowego z wykorzystaniem melasy jako surowca dostarcza

duzych ilosci scieków o wysokim wskazniku BZT

5

Filtrat, po oddzieleniu cytrynianu wapnia,

mozna po zageszczeniu stosowac jako dodatek do pasz lub poddawac beztlenowej fermentacji

metanowej w oczyszczalniach scieków. Istnieje takze koncepcja wykorzystania filtratu do produkcji

drozdzy paszowych. Powaznym problemem ekologicznym jest gips wytwarzany w procesie

oczyszczania kwasu cytrynowego. Zagospodarowanie gipsu jako materialu budowlanego jest

mozliwe dopiero po odpowiednim oczyszczeniu. Roztwór hodowlany po oddzieleniu grzybni

zawiera obok glównego metabolitu, jakim jest kwas cytrynowy, wiele cennych enzymów, glównie

enzymy pektynolityczne, proteolityczne, a takze glukanazy, co stwarza mozliwosc ich

przemyslowego pozyskiwania. Ponadto zródlem wielu enzymów (proteinazy, amylazy, pektynazy,

oksydaza glukozowa), które moga byc wydzielane dla celów handlowych, jest grzybnia Aspergillus

niger. Wytwarzana w duzych ilosciach w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego moze byc takze

wykorzystana na cele paszowe, poniewaz zawiera ponad 40% bialka w suchej masie, z czego

polowa to bialko dobrze przyswajalne. Ponadto zawiera liczne mikroelementy. Dodatek suszu

grzybowego w ilosci 10-15% do pasz dla zwierzat hodowlanych, dorównuje wartosci odzywczej

preparatom drozdzy paszowych.

Melasa buraczana jako surowiec do produkcji kwasu cytrynowego

Melasa buraczana jest ubocznym produktem przemyslu cukrowniczego. Jej sklad chemiczny

podano na rys. 4.

Rys. 4. Sklad chemiczny melasy buraczanej

W grupie niecukrów melasy (zwiazków rozpuszczalnych, nie bedacych sacharoza), stanowiacych

okolo 30% zawartosci suchej masy, znajduja sie zwiazki, które sprzyjaja rozwojowi

drobnoustrojów, w tym takze szczepów produkcyjnych oraz takie, których dzialanie jest dla

mikroorganizmów szkodliwe. Do pierwszej grupy naleza aminokwasy, biotyna, kwas pantotenowy,

mezoinozytol. W drugiej grupie znajduja sie zwiazki o charakterze nieorganicznym (aniony,

kationy) oraz zwiazki organiczne, tj. kwasy organiczne, zwiazki bialkowe, zwiazki barwne oraz

inne, o róznej strukturze chemicznej. Suma wszystkich zwiazków melasy wykorzystywanych przez

drobnoustroje stanowi 51-58% suchej masy. Szkodliwe dla drobnoustrojów przemyslowych

zwiazki melasy maja rózne pochodzenie. Niektóre z nich powstaja podczas gnicia buraków w

czasie ich przechowywania w kopcach badz pochodza ze srodków chemicznych, które stosuje sie

dla zahamowania szerzenia sie „kopcowej zgnilizny". Inne zródlo zwiazków szkodliwych, to

preparaty uzywane w zabiegach agrotechnicznych (nawozy mineralne, preparaty chwasto- i

owadobójcze). Nie bez znaczenia dla jakosci surowcowej melasy sa zwiazki powstale podczas

przerobu buraków, tj. kwasy lotne, azotany (V), zwiazki barwne, które tworza sie juz w

ekstraktorze i w dalszych etapach oczyszczania soku. Niezwykle wazna role w tworzeniu

niekorzystnej frakcji melasy spelniaja pomocnicze srodki chemiczne stosowane w procesie

otrzymywania cukru. Do powszechnie uzywanych preparatów w przemysle cukrowniczym naleza:

flokulanty, emulgatory, dezynfektanty oraz srodki do gaszenia piany. W polskim cukrownictwie

jako preparaty przeciwpianowe stosuje sie lój barani, Spumole BJ, K-3, Rokamix oraz inne,

pochodzenia zagranicznego. Przecietnie na 100 ton buraków zuzycie srodka do gaszenia piany

wynosi od 0,6 do 24 kg. Ten bardzo szeroki przedzial uzytej ilosci preparatów przeciwpianowych

zalezy przede wszystkim od jakosci przerabianego surowca. Buraki niedojrzale, zbyt dlugo

skladowane, zmarzniete powoduja, ze wychodzacy z ekstraktora sok bardzo sie pieni, co zmusza

technologów do wiekszego zuzycia srodka przeciwpianowego Kumulowanie sie w melasie tego

rodzaju preparatów o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych nie wplywa korzystnie na jej

wartosc surowcowa. W procesie powierzchniowej fermentacji cytrynowej, w której melasa jest

podstawowym surowcem, nadmiar preparatów przeciwpianowych, np. typu Spumol K-3, zaklóca

proces rozwoju grzybni juz w stadium kielkowania konidiów, a utworzona grzybnia jest

nieprawidlowa i latwo ulega zatopieniu.

W grupie szczepów Aspergillus niger, cechujacych sie wysoka aktywnoscia biosyntezy kwasu

cytrynowego, istnieja odmiany wykazujace zróznicowana wrazliwosc na obecne w melasie zwiazki

zaklócajace rozwój grzybni i produkcje kwasu cytrynowego, z tego tez wzgledu przy selekcji

szczepów przemyslowych uwzgledniana jest ich tolerancja na zmienny sklad melasy i zawarte w

niej inhibitory wzrostu. Jednakze dobór materialu biologicznego i jego selekcja pod tym wzgledem

jest utrudniona ze wzgledu na zlozonosc skladu chemicznego melasy i obecnosc róznych

zwiazków, które moga byc odpowiedzialne za wadliwosc tego surowca. Klasyfikacja melas do

fermentacji cytrynowej oparta jest na danych z analizy chemicznej objetych norma PN 76/R-64772

(Tab. 1). Jednakze zakres stosowanych analiz chemicznych nie obejmuje kontroli wszystkich

skladników melas buraczanych, a zwlaszcza tych, które maja szkodliwy wplyw na rozwój grzybni

Aspergillus niger. Z tego wzgledu niezbednym testem do oceny przydatnosci surowca melasowego

jest wynik laboratoryjnych prób hodowli Aspergillus niger. Uzdatnianie melas do celów produkcji

kwasu cytrynowego (a takze itakonowego) odbywa sie poprzez dodatek do podloza zelazocyjanku

potasu w celu usuniecia nadmiaru jonów metali ciezkich, glównie zelaza. Inna metoda zalecana dla

procesu wglebnego jest odsalanie melasy na wymieniaczach jonowych.

Tab. 1. Klasyfikacja melas buraczanych wg PN-76/R-64772

Melasy buraczane

Parametr

I klasa

II klasa

°Bx

75,0

75,0-73,0

pH

7,0-8,5

7,0-9,0

Zawartosc sacharozy [%]

=47,0

=44,0

Czystosc (Cz.)* [%]

61,0-66,0

60,0-58,0

Cukier inwert. [%]

<1,0

nie norm.

Azot ogólny [%]

<1,7

2,3

Kwasy lotne (CH

3

COOH)

<1,4

nie norm.

Sole Ca i Mg (CaO) [%]

<1,2

<2.0

SO

2

[%]

=0

-

Ogólna liczba

drobnoustrojów

105

106

*Cz. - procentowa zawartosc sacharozy w suchej masie

Produkcja kwasu cytrynowego metoda wglebna

Wglebna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego w skali przemyslowej prowadzona jest w

bioreaktorach o pojemnosci od 50 do 100 m

3

z uzyciem surowców o wyzszym stopniu czystosci niz

w metodzie powierzchniowej, tj. cukru handlowego (sacharoza), soków cukrowniczych, maczek

cukrowych, hydrolizatów skrobiowych. Rzadziej do tego celu wykorzystywana jest melasa

buraczana, poniewaz proces wglebny z jej uzyciem nie zapewnia odpowiedniej wydajnosci kwasu

cytrynowego. W przypadku stosowania pozywki mineralnej, w której zródlem wegla jest handlowa

sacharoza, wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego wynosi ponad 80%. Obok zródla wegla w

ilosci 100-150 g/dm

3

, pozywka zawiera w swoim skladzie niezbedne sole mineralne, tj. (NH

4

)

2

SO

4

- 2g/dm

3

, MgSO

4

x7H

2

O – 0,2g/dm

3

, KH

2

PO

4

- 0,2 g/dm

3

, a pH regulowane jest do wartosci 2,5-

3,0. W zaleznosci od specyfiki szczepu Aspergillus niger pozywke w bioreaktorze szczepi sie

zawiesina konidiów w ilosci 105/cm

3

, po ich wczesniejszej 6-8 godzinnej inkubacji lub zawiesina

grzybni inokulacyjnej otrzymanej po 24-36 godzinach hodowli, stosujac 10% w stosunku do

objetosci pozywki w bioreaktorze. W metodzie hodowli wglebnej, w wyniku ciaglego mieszania,

grzybnia rozwija sie w calej objetosci podloza. Po 48 godzinach rozpoczyna sie faza produkcji

kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu biosyntezy, do momentu wyczerpania zródla wegla,

wynosi od 120 do 168 godzin w temperaturze 30-32°C i przy napowietrzaniu jalowym powietrzem

w ilosci 0,1-0,4 vvm (objetosc powietrza dostarczana do bioreaktora w stosunku do objetosci

podloza, wciagu minuty). Zaleta tej metody w porównaniu z metoda powierzchniowa z uzyciem

melasy, jest krótszy czas trwania procesu, mniejsze zagrozenie rozwojem obcej mikroflory z uwagi

na niska wartosc pH i zamkniete bioreaktory oraz mozliwosc wydzielania kwasu cytrynowego z

pozywki na drodze krystalizacji, a takze na mniejsze obciazenie sciekami. Otrzymywanie kwasu

cytrynowego metoda hodowli wglebnej stwarza jednak wiele trudnosci natury bioinzynieryjnej,

które wynikaja ze specyficznej morfologii grzybni w tych warunkach. Ciagly ruch cieczy

wywolany mieszaniem i napowietrzaniem powoduje, ze grzybnia w bioreaktorze wystepuje w

postaci klebków (pellets) o srednicy 0,2-3,0 mm badz strzepek grzybni o róznym stopniu

rozgalezienia lub tez jako mieszanina obu form morfologicznych. Taki wzrost grzybni, a takze

gestosc zawiesiny wynoszaca do 50 kg s.m./m

3

powoduja, ze srodowisko hodowlane osiaga wysoka

lepkosc. W tak niekorzystnych reologicznie warunkach utrudniona staje sie wymiana masy, a takze

dyfuzja tlenu do podloza oraz do komórek grzybni. Znajomosc fizjologii i morfologii grzybów

strzepkowych oraz parametrów reologicznych (lepkosc, gestosc) zmieniajacych sie wraz z

rozwojem grzybni jest niezbedna do wlasciwego zaprojektowania bioreaktora z odpowiednim

systemem doprowadzenia powietrza do srodowiska, mieszaniem masy reakcyjnej zapewniajacym

dobre warunki wymiany masy i wymiany gazowej (CO

2

, O

2

). Znane podstawowe zasady wymiany

masy i ciepla w biorektorach, dotyczace plynów newtonowskich, w przypadku hodowli grzybów

strzepkowych sa nieprzydatne, poniewaz organizmy te tworza zawiesiny o wlasciwosciach

nienewtonowskich. Stad tez bioreaktory stosowane do biosyntezy kwasu cytrynowego musza byc

specjalnie konstruowane. Najczesciej stosuje sie bioreaktory z mieszadlem turbinowo-tarczowym,

którego ruch powoduje silna dyspersje powietrza w cieczy. Najbardziej efektywna wymiane masy i

dyfuzje powietrza zapewniaja bioreaktory bezmieszadlowe z naturalna cyrkulacja cieczy typu air-

lift, w których powietrze do wnetrza aparatu wprowadzane jest przez odpowiednie urzadzenia

napowietrzajace. Bioreaktory wykonane sa ze stali kwasoodpornej i sa wyposazone w

oprzyrzadowanie pomiarowe, tj. elektrode tlenowa, elektrode redox (do pomiaru potencjalu

oksydoredukcyjnego), termometr polaczony z regulatorem temperatury, rotametr, pehametr,

regulator obrotów walu mieszadla i odpieniacz mechaniczny. W procesach prowadzonych w

bioreaktorach zjawisko pienienia sie nie zawsze skutecznie moze byc likwidowane mechanicznie,

czesto istnieje koniecznosc stosowania srodków przeciwpianowych, ale w sposób kontrolowany,

poniewaz nadmiar tego rodzaju preparatów o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych zaklóca

rozwój grzybni i zmniejsza wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego.