KWAS CYTRYNOWY

Charakterystyka:

• C₆H₈O₇

• Hydroksykwas trójkarboksylowy, M cz = 192, temperatura topnienia 153°C, występuje w postaci bezwodnej lub jedno wodnej

• po raz pierwszy wyizolowany z soku cytryn

• występuje w niewielkich ilościach w większości organizmów żywych, gdyż spełnia istotną rolę w ich metabolizmie - jest ważnym produktem przejściowym w cyklu Krebsa

• posiada wysokie walory organoleptyczne tzn. przyjemny zapach oraz kwaśny smak

• doskonale rozpuszcza się w wodzie

• jest związkiem nietoksycznym

Głównie z tych względów kwas cytrynowy został dopuszczony przez FAO/WHO bez ograniczeń do produkcji żywności.

• do lat 30-tych XX wieku był otrzymywany przez wytłaczanie cytryn (zawartość tego kwasu w soku cytrynowym wynosi 7-9 %) - do uzyskania 1kg kwasu zużywano ok. 40 kg cytryn; na początku XX wieku produkcja wynosiła 10 000 ton i prowadzona była głównie we Włoszech

• produkcja drogą chemiczną jest nieopłacalna (wysoki koszt surowców, złożony proces technologiczny, konieczność stosowania silnie trujących odczynników np. cyjanowodór, niska wydajność procesu)

PRODUKCJA MIKROBIOLOGICZNA -jest metodą bezkonkurencyjną

• pierwsza mikrobiologiczna instalacja przemysłowa została zbudowana w Belgii w 1919 r.

• światowa produkcja kwasu cytrynowego przekracza 400 000 ton rocznie, duże zapotrzebowanie na ten kwas (80 %) jest w przemyśle spożywczym, lecz także farmaceutycznym, kosmetycznym, chemicznym i metalurgicznym

Producenci kwasu cytrynowego - mikroorganizmy:

• wyselekcjonowane szczepy pleśni Aspergillus niger, Aspergillus wentii, Penicillium luteum, Trichoderma viridae

• drożdze z rodzaju Candida (Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida intermedia), które syntetyzują kwas cytrynowy w obecności n-alkanów

• bakterie z rodzaju Arthrobacter

Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego

Szczepy Aspergillus niger stosowane w przemysłowej produkcji kwasu cytrynowego izoluje się ze środowisk naturalnych (gleba, woda, drzewa, owoce) i sprawdza ich aktywność w próbach fermentacyjnych. Ponieważ kwas cytrynowy, jako produkt pierwotnego metabolizmu, nie jest wydzielany przez mikroorganizmy w warunkach naturalnych w dużych ilościach, w związku z tym ilości o znaczeniu technologicznym uzyskuje się poprzez tzw. uaktywnienie szczepów produkcyjnych czyli poprzez zakłócenie/zaburzenie metabolizmu mikroorganizmów. Szczepy produkcyjne otrzymuje się zwykle w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczepów naturalnych.

W charakterze mutagenów stosowane są czynniki fizyczne (np. promieniowanie ultrafioletowe - naświetlanie konidii), chemiczne lub kombinacje obu tych metod.

Okazuje się jednak, że szczepy zapewniające wysoką wydajność kwasu cytrynowego w procesie wgłębnym na podłożu mineralnym nie sprawdza się w procesie powierzchniowym na podłożu melasowym.

Przyczyna tego jest zbyt bogata zawartość w melasie buraczanej składników mineralnych i stymulatorów wzrostu w postaci związków azotowych i fosforowych, co powoduje nadmierny rozwój biomasy grzybni przy jednocześnie osłabionej biosyntezie kwasu cytrynowego.

Dobry szczep produkcyjny Aspergillus niger powinien!!!

• syntetyzować duże ilości kwasu cytrynowego przy nieobfitym wytwarzaniu grzybni

• wykorzystywać proste, tanie i łatwo dostępne składniki podłoża

• wykazywać dużą stabilność genetyczną

• nie powinien wytwarzać lub ew. w min. ilościach innych kwasów np. szczawiowego, glukonowego

Kwas cytrynowy powstaje w początkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntazę cytrynianową. W procesie rozwoju grzybni (trofofaza), a następnie produkcji kwasu cytrynowego (idiofaza) heksozy asymilowane są w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozofosforanowym (HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia się w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustępuje glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego.

Podłoże hodowlane - odgrywa niezwykle istotną rolę w produkcji kwasu cytrynowego:

• źródłem węgla i energii są cukry (stężenie zwykle 10-22%: tj. ~ 10% dla hodowli wgłębnej, 16% dla hodowli powierzchniowaej - zwykle stosuje się melasę buraczaną (produkt uboczny przemyslu cukrowniczego), syropy glukozowy lub fruktozowy

• kwasowość pożywki musi być wysoka (pH 2-3) - w tych warunkach kwas cytrynowy jest głównym produktem fermentacji; przy wyższych wartościach pH wytwarzane są znaczne ilości kwasu szczawiowego i glukonowego

• istotne jest wyeliminowanie soli metali (żelaza, manganu, cynku, etc.) - w tym celu dodaje się do podłoża żelazocyjanek potasu, który wytrąca jony metali, natomiast w nadmiarze działa jako inhibitor wzrostu i promotor wytwarzania kwasu

• niskie stężenie soli fosforowych i amonowych (zwykle siarczan amonu - źródło azotu) co limituje wzrost grzybni

• podłoże musi być intensywnie napowietrzane

Metody produkcji:

• na stałych pożywkach - SSF (ang. Solid State Fermentation)

• metodą powierzchniową - LSF (ang. Liquid Surface Fermentation)

• metodą wgłębną - SmF (ang. Submerged Fermentation)

HODOWLA W PODŁOŻACH STAŁYCH

• Metoda ta najpowszechniej rozwinęła się w Japonii.

• W metodzie tej surowcem mogą być odpady przemysłu ziemniaczanego i młynarskiego np. otręby, a także wytłoki z trzciny cukrowej, wadliwa melasa buraczana czy trzcinowa, która z uwagi na niewłaściwy skład, nie mogła być wykorzystana w pozostałych metodach.

• Hodowle prowadzi się w fermentorach tacowych (wilgotność podłoża 65-70%) w napowietrzonych komorach przez ok. 90 godz.

• Kwas wydziela się z podłoża poprzez ekstrakcję wodą.

• Metoda ta ma znaczenie marginalne.

HODOWLA POWIERZCHNIOWA (wydajność procesu 50-70% w stosunku do zużytego cukru)

• W metodzie powierzchniowej w warunkach statycznych grzybnia Aspergillus niger rozwija się na powierzchni pożywki, tworząc zwartą plechę złożona z mocno rozgałęzionych strzępek.

• Wspólną cechą obydwu metod: powierzchniowej i wgłębnej jest ich dwufazowość. W pierwszej zachodzi intensywny rozwój grzybni, trwa ona przeważnie do 72 godz. hodowli, po czym następuje druga faza, w której intensywnie wytwarzany jest kwas cytrynowy przy ograniczonym wzroście grzybni.

• W hodowli powierzchniowej obydwie fazy przebiegają w systemie jednostopniowym.

• W procesie wgłębnym pierwsza faza odbywa się w podłożu inokulacyjnym, o składzie różniącym się od fermentacyjnego, głównie ze względu na zmniejszoną ilość źródła węgla.

• W metodzie powierzchniowej najczęściej stosowanym surowcem jest melasa buraczana.

• Sterylną pożywkę melasową rozlewa się do tac sporządzonych ze stali kwasoodpornej i zamontowanych na specjalnych stelażach, umieszcza się w komorach z regulacją temperatury i napowietrzania. Kiedy temperatura pożywki obniży się do wartości 40°C, szczepi się ją konidiami pleśni zmieszanymi z węglem aktywnym jako nośnikiem. Po 24 godz. inkubacji pojawia się widoczna cienka grzybnia, której intensywny wzrost trwa do 48-72 godz., po czym słabnie na korzyść produkcji kwasu cytrynowego. Dojrzała grzybnia osiąga grubość 2-3 cm, jej warstwa dolna stykająca się z podłożem jest odpowiedzialna za syntezę kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu wynosi 7-9 dni w temp. 30°C, wydajność procesu 70-80%. W tym procesie obok kwasu cytrynowego (80%), do podłoża wydzielany jest kwas szczawiowy i kwas glukonowy oraz w śladowych ilościach kwasy z cyklu Krebsa. Po zlaniu spod grzybni przefermentowanego podłoża można ponownie wprowadzić świeżą pożywkę i wykorzystywać grzybnię kilkukrotnie.

HODOWLA WGŁĘBNA (wydajność procesu 80-90% w stosunku do zużytego cukru)

• Wgłębna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego w skali przemysłowej prowadzona jest w bioreaktorach o poj. 50-100 m³ z użyciem surowców o wyższym stopniu czystości niż w metodzie powierzchniowej, tj. cukru handlowego (sacharoza), soków cukrowniczych, mączek cukrowych, hydrolizatów skrobiowych. Rzadziej stosuje się melasę, ponieważ proces wgłębny z jej użyciem nie zapewnia odpowiedniej wydajności kwasu cytrynowego.

• W metodzie hodowli wgłębnej, w wyniku ciągłego mieszania, grzybnia rozwija się w całej objętości podłoża. Po 48 godzinach rozpoczyna się faza produkcji kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu biosyntezy, do momentu wyczerpania źródła węgla, wynosi od 5 do 7 dni w temperaturze 30-32°C.

• Zaletą tej metody w porównaniu z metodą powierzchniową, jest:

• krótszy czas trwania procesu,

• mniejsze zagrożenie rozwojem obcej mikroflory z uwagi na niskie pH i zamknięte bioreaktory

• możliwość wydzielania kwasu cytrynowego z pożywki na drodze krystalizacji

• mniejsze obciążenie ściekami

Wydzielanie kwasu cytrynowego - Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa się tzw. metodą cytrynianową. Polega ona na wytracaniu na gorąco cytrynianu wapnia, traktując podłoże pofermentacyjne wodorotlenkiem wapnia. Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca₃(C₆H₅O₇)₂] po oddzieleniu od masy reakcyjnej traktuje się roztworem kwasu siarkowego H₂SO₄, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej. Wytracony gips oddziela się przez filtrację, roztwór zaś zagęszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizację. Metoda cytrynianowa jest bardzo uciążliwa z uwagi na duże zużycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia, a także wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilości gipsu.

Zanieczyszczenia - Źródłem zanieczyszczeń mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu cytrynowego jest przede wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym występują głównie bakterie z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a także Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Wszystkie drobnoustroje występujące jako zanieczyszczenia są zdolne do redukcji azotanów, co działa hamująco na rozwój grzybni.

Spośród pleśni najczęstszym zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. Konidia tych pleśni dostają się z powietrzem stosowanym do przewietrzania komór, a także wraz ze szczepionką konidiów Aspergillus niger podczas jej rozpylania na powierzchnie pożywki. Pleśnie te są bogate w enzymy hydrolityczne, powodując lizę grzybni Aspergillus niger.

Kwas cytrynowy (E330) stosowany jako:

Regulator kwasowości, przeciwutleniacz, stabilizator, emulgator

Wykorzystywany jest w:

przemyśle spożywczym (największy odbiorca)

♦ w owocowo-warzywnym jako inaktywator enzymów (oksydaz), które odpowiedzialne są za utlenianie związków fenolowych, powodujących ciemnienie owoców i warzyw, jest znakomitym antyutleniaczem chroniącym żywność przed zepsuciem

♦ wykorzystywany w produkcji napojów, słodyczy, owoców kandyzowanych i innych wyrobów cukierniczych, w których podkreśla i wzmacnia smak owocowy

♦ w produkcji win, jako preparat zakwaszający i stabilizujący oraz do usuwania zmętnień

♦ do wyrobu marmolad, dżemów, galaretek owocowych, niektórych koncentratów spożywczych i esencji o aromatach cytrusowych, dodawany do miodu sztucznego i niektórych rodzajów margaryny, stosowany przy rafinacji olejów roślinnych

♦ do stabilizacji barwy, smaku i zapachu ryb, krewetek, owoców i warzyw składowanych w chłodniach

♦ tworzenie przez kwas cytrynowy kompleksowych połączeń z jonami metali (Fe, Cu, Zn) zadecydowało o jego szerokim zastosowaniu jako stabilizatora (antyoksydanta) olejów

przemyśle farmaceutycznym

♦ stosowany jest jako dodatek do tabletek, powodując musujący efekt podczas ich rozpuszczania w wodzie

♦ cytrynian trisodowy i tripotasowy używany jest w Stacjach Krwiodawstwa jako preparat zapobiegający krzepnięciu krwi

♦stosowany przy zatruciach ołowiem, kwas cytrynowy reagując z tym pierwiastkiem przekształca go w połączenia trudno przyswajalne przez organizm

przemyśle kosmetycznym

♦ wchodzi w skład kosmetyków np. szamponów, toników, kremów, utrwalaczy do włosów

przemyśle tekstylnym

♦ stosowany przy wyrobie tkanin - nadaje im trwałość i niepodatność na gniecenie

przemyśle chemicznym

♦ wykorzystywany do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem powłokami ochronnymi - tworzy kompleksy z metalami ciężkimi

♦ w produkcji detergentów pralniczych - głównie wykorzystywane sole (np. cytrynian trisodowy)

♦ stosowany przy wyrobie błon i płyt fotograficznych, papierów światłoczułych

przemyśle technicznym

♦ wodne roztwory kwasu cytrynowego stosowane są w mleczarstwie do usuwania z aparatury tzw. kamienia mlecznego, tj. osadu utworzonego z białka, tłuszczu i soli mineralnych

♦ sole kwasu cytrynowego (zwłaszcza amonowe) służą do czyszczenia przewodów metalowych różnych instalacji przemysłowych z rdzy

przemyśle tworzyw sztucznych

♦ estry kwasu cytrynowego i alkoholi alifatycznych znalazły zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w masach plastycznych, z których wytwarza się cienkie powłoki ochraniające żywność

2

---