1

Ć

WICZENIA Z GOSPODARKI ENERGETYCZNEJ, WODNEJ I ŚCIEKOWEJ

CZĘŚĆ MIKROBIOLOGICZNA

Ć

wiczenie 4-5

Mikrobiologiczne kryteria oceny sanitarnej wody

Część teoretyczna:

1. Kryteria jakości sanitarnej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi.

2. Charakterystyka mikroorganizmów wskaźnikowych.

3. Drobnoustroje chorobotwórcze przenoszone drogą wodną. Bakterie chorobotwórcze i

potencjalnie chorobotwórcze występujące w wodach powierzchniowych.

Część praktyczna:

I. Oznaczanie liczby bakterii psychro- i mezofilnych

Jest to metoda hodowlana, w której zakłada się, że każda kolonia rozwija się z

pojedynczej komórki bakteryjnej, pozwala więc na określenie liczby żywych, zdolnych do

rozmnażania komórek bakterii znajdujących się w badanym materiale. Oznaczenie

wykonuje się metodą płytkową Kocha, stosując posiew głębinowy na podłoże z agarem

odżywczym.

Materiał: woda wodociągowa, rzeczna

Odczynniki i aparatura:

•

podłoże – agar odżywczy;

•

jałowe płytki Petriego;

•

probówki z płynem do rozcieńczeń (po 9ml);

•

jałowe pipety mikrobiologiczne (1ml).

Wykonanie:

1. Posiewu bakterii na agar odżywczy dokonuje się w dwóch równoległych

powtórzeniach. Wodę wodociągową należy posiewać bezpośrednio, pobierając 1

ml wody i przenosząc na jałową płytkę Petriego. Dodatkowo posiewu dokonuje

się z rozcieńczenia 10

-1

.

Wodę powierzchniową posiewa się z rozcieńczeń 10

-3

i/lub 10

-5

.

2. Płytki z zawiesiną bakterii (1ml) zalać upłynnionym na łaźni wodnej i ostudzonym

do 45°C podłożem i po dokładnym wymieszaniu pozostawić do zastygnięcia.

3. Płytki odwrócić do góry dnem i jedną z nich wstawić do cieplarki o temperaturze

22°C (oznaczenie bakterii psychrofilnych), drugą do cieplarki o temperaturze

37°C (oznaczenie bakterii mezofilnych).

4. Po okresie inkubacji (72 h dla bakterii psychrofilnych i 24 h dla bakterii

mezofilnych) policzyć wyrosłe kolonie. W razie stosowania rozcieńczeń próbki,

liczbę koloni należy pomnożyć przez odwrotność rozcieńczenia.

5. Wynik badań wpisać do tabeli 1. Wynik oznaczenia podać jako liczbę bakterii

psychrofilnych oraz liczbę bakterii mezofilnych w 1 cm

3

wody.

2

Tabela 1. Zestawienie wyników analizy bakteriologicznej wody do celów sanitarnych −

liczba bakterii psychrofilnych i mezofilnych.
BADANA PRÓBA: …………

Warunki hodowli

Oznaczenie

podłoże

temperatura

i czas

hodowli

Liczba

kolonii w

ilości

badanej

próby

Liczba

bakterii w

1 cm

3

wody

psychrofilnych

Ogólna

liczba

bakterii

mezofilnych

Wnioski:

………………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………..

II. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych

Metoda filtrów membranowych zalecana jest do badania wody zawierającej małe

ilości poszukiwanych bakterii, a więc wody przeznaczonej do picia i potrzeb

gospodarskich, może być również wykorzystana w badaniu wód zanieczyszczonych i
ś

cieków po uprzednim rozcieńczeniu tych próbek.

Wykrywanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych polega na

przesączeniu określonej objętości wody lub ścieków przez jałowy filtr i inkubacji na

określonym podłożu. Bakterie w trakcie sączenia zostają zatrzymane na filtrze, który

umieszcza się na pożywce wybiórczej, rozwijając się w czasie inkubacji tworzą na

powierzchni filtra kolonie o typowym wyglądzie.

Materiał: woda wodociągowa, rzeczna

Odczynniki i aparatura:

•

zestaw do filtracji membranowej;

•

płytki Petriego z podłożem Endo.

Wykonanie:

1. Przed użyciem aparat filtracyjny wysterylizować w autoklawie w temperaturze

120°C przez 15 minut.

2. Zmontować aparat filtracyjny (lejek umieścić w kolbie ssawkowej, połączonej z

pompą próżniową, jałową pęsetą nałożyć na porowatą płytkę filtr membranowy).

3. Wlać odpowiednią ilość badanej wody do lejka (dla wody kranowej 100 ml, dla

wód powierzchniowych 1 ml z dodatkiem 30 ml roztworu soli fizjologicznej).

4. Po przefiltrowaniu ściany lejka spłukać dokładnie ok. 20 ml jałowego roztworu soli

fizjologicznej.

3

5. Zamknąć kranik i wyjałowioną pęsetą przenieść filtr membranowy na płytkę

Petriego z podłożem Endo (powierzchnią z bakteriami ku górze), tak aby nie było

pęcherzyków powietrza pomiędzy filtrem i podłożem.

6. Płytki Petriego z filtrami umieścić w cieplarce dnem ku górze i inkubować 24 h w

37°C.

7. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie, tj. ciemnoczerwone z metalicznym

połyskiem (tzw. połysk fuksynowy). Jeżeli nie stwierdza się obecności typowych

kolonii, należy przeprowadzić badania potwierdzające.

III. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową (FP)

Metodę fermentacyjną probówkową (FP) stosuje się do wykrywania bakterii grupy

coli zarówno w wodzie przeznaczonej do spożycia, do potrzeb gospodarczych, jak
również w wodach powierzchniowych i ściekach. Oznaczenie oparte jest na zdolności

tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu (zmiana

zabarwienia pożywki z fioletowej na żółtą) oraz gazu (w rurkach Durhama

umieszczonych w probówkach).

Metoda FP pozwala na określenie najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL)

bakterii coli w 100 ml badanej próbki, wyznaczonej z tablic na podstawie rachunku
prawdopodobieństwa, oraz miana coli – najmniejszej objętości badanej wody lub
ś

cieków wyrażonej w ml, w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii coli.

Oznaczenie bakterii grupy coli wraz z identyfikacją Escherichia coli przeprowadza

się w kilku etapach, na które składają się badania wstępne, potwierdzające,

uzupełniające i ostateczne.

Materiał: woda wodociągowa, rzeczna

Odczynniki i aparatura:

•

podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową podwójnie stężone z rurkami

Durhama;

•

probówki z płynem do rozcieńczeń (po 9ml).

Wykonanie:

1. Przy pomocy jałowej pipety posiewać nie rozcieńczoną wodę wodociągową w

ilościach: 1 x 50 cm

3

oraz 5 x 10 cm

3

na podłoże laktozowe z purpurą

bromokrezolową podwójnie stężone. W probówkach powinny znajdować się rurki

Durhama, w których zbierać się będzie wytworzony CO

2

.

2. W przypadku spodziewanego większego zanieczyszczenia wody posiać mniejsze

jej objętości:

•

woda z wodociągów nie dezynfekowana, woda z basenu kąpielowego – 5

x 10 cm

3

, 1 x 1 cm

3

, 1 x 0,1 cm

3

•

woda z urządzeń na potrzeby własne – 2 x 10 cm

3

, 2 x 1 cm

3

, 2 x 0,1 cm

3

•

woda powierzchniowa – 2 x 0,1-0,0001 cm

3

(rozc. 10

-1

do 10

-4

)

Objętości 1 cm

3

wody oraz 1 cm

3

z rozcieńczeń od 10

-1

do 10

-4

posiewać na

podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową o stężeniu normalnym.

3. Posiane próbki inkubować w temperaturze 37°C przez 24-48 h.

4. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama lub

występowanie pęcherzyków gazu w podłożu przy lekkim wstrząsaniu, a także

4

zmianę barwy z fioletowej na żółtą. Zmiany te wskazują na wzrost bakterii i

fermentację laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu.

Za wynik ujemny przyjmuje się brak gazu i zakwaszenia podłoża.

Obecność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub braku

zakwaszenia uznaje się za wynik wątpliwy, wymagający dalszego potwierdzenia.
Jako wynik podać miano oraz NPL bakterii coli.

IV. Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli

Badanie potwierdzające – posiew na podłoże Endo – dokonuje się ze wszystkich

dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego, uzyskanych po 24 i 48 h.

Wykonanie:

1. Za pomocą jałowej ezy pobrać niewielką ilość materiału z hodowli na podłożu

laktozowym z purpurą bromokrezolową i posiać na podłoże Endo.

2. Inkubować w temperaturze 37°C przez 24 h.

3. Za wynik dodatni uważa się wzrost gładkich, ciemnoczerwonych koloni z

charakterystycznym metalicznym (fuksynowym) połyskiem.

4. Niektóre szczepy bakterii grupy coli rosną na pożywce Endo w postaci jasno lub

ciemnoróżowych kolonii, z ciemniejszym środkiem bez charakterystycznego

połysku. Obecność tych nietypowych kolonii, przyjmuje się za wynik wątpliwy,

wymagający dalszych badań.

Badania te polegają na:

•

ponownym stwierdzeniu zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji

laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy)

•

wybarwieniu komórek metodą Grama

•

wykonaniu testu na osydazę cytochromową (pojawienie się

intensywnego niebieskiego zabarwienia po dodaniu odczynnika na

oksydazę, świadczy o obecności tego enzymu i jednocześnie wyklucza

obecność bakterii grupy coli, które są oksydazoujemne. Gatunki z rodzaju
Aeromonas (Pseudomonas aeruginosa) mogą również wytwarzać kwas i
gaz z laktozy, jedynie pozytywna reakcja na oksydazę odróżnia je od

bakterii grupy coli)

V. Badania identyfikujące Escherichia coli metodą szeregu IMViC

W przypadku konieczności ostatecznego potwierdzenia występowania Eschericia coli w
wodzie, przeprowadza się następujące testy biochemiczne:

•

stwierdzenie zdolności bakterii do wytwarzania indolu (I) z tryptofanu (wynik

dodatni),

•

reakcja z czerwienią metylową (M) (wynik dodatni),

•

reakcja Voges-Proskaura (V), stwierdzająca obecność acetylometylokarbinolu

(wynik ujemny),

•

zdolność wykorzystywania cytrynianu (C) jako jedynego źródła węgla (wynik

ujemny).

5

Badania identyfikujące Eschericia coli rozpoczyna się od wyizolowania czystych kultur z
pożywki Endo. Hodowlę prowadzi się w temp. 37°C. Reakcje na indol, z czerwienią

metylową i odczyn Voges-Proskaura przeprowadza się w probówkach, w których

nastąpił wzrost bakterii, objawiający się zmętnieniem pożywki.

1. Wykrywanie indolu

Wytwarzanie indolu sprawdza się po 24-godzinnej inkubacji w wodzie peptonowej z
tryptofanem, dodając do hodowli po ściance probówki kilka kropli odczynnika Ehrlicha.

Pojawienie się czerwonego zabarwienia na granicy płynów świadczy o obecności indolu,

czyli o wyniku dodatnim.

2. Reakcja z czerwienią metylową

Do hodowli (3,4-dniowej) na podłożu Clarka dodaje się 2 krople czerwieni metylowej.

Wystąpienie wyraźnie czerwonej barwy wskazuje na zakwaszenie pożywki w wyniku

rozkładu glukozy. Świadczy to o dodatnim wyniku reakcji. Kolor żółty określa wynik

ujemny, a kolor pomarańczowy lub jasnoczerwony – wynik wątpliwy.

3. Reakcja Voges-Proskaura

Przeprowadzenie tej reakcji pozwala stwierdzić obecność acetylometylokarbinolu.

Wykonuje się ją po 24-godzinnej hodowli na pożywce Clarka, dodając do hodowli
0,6 ml roztworu 6% α-naftolu rozpuszczonego w alkoholu absolutnym. Po dokładnym

wymieszaniu dodać 0,4 ml 40 % KOH oraz 2 ml roztworu kreatyny. Zawartość probówki

miesza się ponownie i wstawia do cieplarki na 30-45 minut. Wystąpienie intensywnego

różowego lub czerwonego zabarwienia w górnej części płynu oznacza wynik dodatni,

czyli obecność acetylometylokarbinolu. W przypadku wyniku ujemnego pożywka nie

zmienia barwy lub jest zabarwiona na kolor lekko różowy.

4. Zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla.

Badania to przeprowadza się na pożywce Simmonsa. Hodowle inkubuje się przez

72 h. Brak wzrostu i zmiany zabarwienia ocenia się jako wynik ujemny, co jest cechą

charakterystyczną dla Eschericia coli. Natomiast wzrost na pożywce oraz alkalizacja
podłoża powodująca zmianę zabarwienia na niebieską określa się jako wynik dodatni,

charakterystyczny dla innych pałeczek grupy coli.