W

YSOKOSPRAWNA

C

HROMATOGRAFIA

C

IECZOWA

materiały do ćwiczeń seminaryjno-

laboratoryjnych

Materiały zebrała i przygotowała do druku:

dr inż. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska

SPIS TRE

Ś

CI

Ć

wiczenie 1

Przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy – przygotowanie fazy
ruchomej, instalacja kolumny; zasady post

ę

powania dla efektywnego

stosowania aparatu.

Dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Ć

wiczenie 2

Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych.

Dr in

ż

. B. Makuch, mgr in

ż

. J. Wilga

Ć

wiczenie 3

Rozwi

ą

zywanie problemów chromatograficznych – problemy zwi

ą

zane z

dozowaniem próbki, kolumn

ą

, detektorem, pomp

ą

.

Prof. dr hab. in

ż

. M. Kami

ń

ski, mgr in

ż

. E. Gilgenast,

mgr in

ż

. G. Romanik

Ć

wiczenie 4

Analiza ilo

ś

ciowa zwi

ą

zków w próbkach.

Dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Ć

WICZENIE 1

P

RZYGOTOWANIE CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO DO PRACY

–

PRZYGOTOWANIE FAZY RUCHOMEJ

,

INSTALACJA KOLUMNY

;

ZASADY

POSTĘPOWANIA DLA EFEKTYWNEGO STOSOWANIA APARATU

.

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy. Przygotowanie aparatu
obejmuje przygotowanie fazy ruchomej, instalację kolumny chromatograficznej, przygotowanie detektora
i stabilizaja warunków chromatograficznych.

Schemat blokowy chromatografu cieczowego, którego elementy poddawane będą omówieniu i
przygotowaniu do pracy analitycznej przedstawiono na Rysunku.

Faza

ruchoma

Pompa

Nastrzyk

Kolumna

Detektor

Rejestrator

Termostat

Schemat blokowy chromatografu cieczowego

W celu przygotowania aparatu do pracy należy:

1.

przygotować fazę ruchomą,

2.

zainstalować kolumnę chromatograficzną,

3.

przygotować detektor ,

4.

przygotować wzorzec i próbkę do analizy,

5.

ustabilizować warunki chromatograficzne,

6.

zdiagnozować ewentualne problemy chromatograficzne.

ad.1

Fazą ruchomą w chromatografii cieczowej są pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- lub więcej

składnikowe mieszaniny. Faza ruchoma, która zostaje wprowadzona do kolumny to eluent, który
bezwzględnie musi być pozbawiony rozpuszczonego w cieczy powietrza (zaprezentowane zostaną różne
sposoby usuwania powietrza z fazy ruchomej: odgazowanie próżniowe, helem lub za pomocą
ultradzwięków). Rodzaj i stosunek ilościowy mieszaniny rozpuszczalników w fazie ruchomej ma bardzo
duży wpływ na proces chromatografowania. Omówione zostaną sposoby przygotowania faz ruchomych
składających się z dwóch (lub więcej) składników, zawierające dodatki (kwasy nieorganiczne, organiczne
i bufory). Przedstawiony zostanie sposób wymiany eluentu. Przez cały czas trwania wymiany eluentu
kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do
wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, że cały
aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy.
Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji „inject”.

Jeżeli, eluent poprzedni i następny wzajemnie się nie mieszają, a szczególnie gdy stosowane są roztwory
buforowe, lub eluenty zawierające substancje będące w stanie czystym fazą stałą, należy upewnić się, że
kolejna ciecz pompowana przez aparat nie spowoduje wytrącenia się stałego osadu wewnątrz
chromatografu, ani powstania emulsji. W takich przypadkach należy zastosować ciecz pośrednią, o której
wiadomo, że jest dobrym rozpuszczalnikiem składników poprzedniego i następnego eluentu, np. wodę
destylowaną, gdy ma być stosowany bufor zawierający sole nieorganiczne, albo tetrahydrofuran, aceton
lub dioksan, gdy poprzedni i następny eluent są cieczami bez dodatku substancji stałych, ale wzajemnie
się nie mieszają. Pomocne może być wprowadzenie strzykawką poprzedniego eluentu do następnego
zawartego w probówce w celu sprawdzenia czy nie powstaje osad lub emulsja;

Zawsze należy każdą ze stosowanych cieczy pośrednich przepłukać także kanał odniesienia detektora,
gdy detektor taki kanał posiada (np. w przypadku detektora refraktometrycznego);

Podstawowy problem związany z fazą ruchomą w HPLC: ciśnienie wskazywane przez wyświetlacz na
płycie czołowej pompy waha się więcej niż +/- 2 bary, a jednocześnie widać okresowe zasysanie małych
banieczek z przewodu ssawnego do pompy. Przyczyna: zapowietrzony eluent, albo eluent o zbyt
wysokiej prężności par, albo/i zatkany zanieczyszczeniami filtr ssawny pompy. (Uwaga! Eluent przed
użyciem musi być przefiltrowany przez filtr 0,45 um, jeżeli nie ma pewności, że wykonał to producent, a
także nie wolno dopuścić do powstania życia biologicznego w eluencie nietoksycznym dla bakterii i
grzybów - stosować 0.5 mM azydek sodu). Należy przedmuchać filtr ssawny pompy sprężonym
powietrzem w kierunku odwrotnym do kierunku przepływu cieczy, dodatkowo odpowietrzyć eluent i
postawić go powyżej poziomu głowicy pompy.

ad.2

Sposób połączenia kolumny z dozownikiem i detektorem powinien być taki, żeby

zminimalizować powstające ewentualne objętości martwe. W ten sposób zmniejsza się udział objętości
martwych stosunek rozmyciu pików chromatograficznych. Przez cały czas trwania wymiany eluentu
kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do
wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, że cały
aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy.
Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji „inject”.

Jeżeli klumna chromatograficzna podłączana jest do układu po raz pierwszy lub też nie była używana
przez dłuższy okres czasu należy - po podłączniu jej do układu chromatograficznego – zastosować
wzrastający przepływ fazy ruchomej (od najmniejszego do właściwego). Gwałtowne włączenie pompy
pompującej fazę ruchomą z dużym przepływem może zruszyć złoże upakowane w kolumnie
chromatgraficznej.
Przy rozpoczynaniu analizy chromatograficznej jedną z bardzo ważnych rzeczy jest ustalenie równowagi
kolumny chromatograficznej. Jak długo należy kolumnę stabilizować zależy od jej stanu, stężenia
składników fazy ruchomej oraz ich wskaźnika retencji. Ustalenie stanu równowagi jest uwarunkowane
przez prędkość, z którą składniki fazy ruchomej są transportowane do kolumny lub mogą z niej być
usunięte. Jeżeli stężenie dodatków organicznych w fazie ruchomej jest niskie, ustalenie równowagi
zajmie sporo czasu, np.: jeżeli kolumna wcześniej nie miała kontaktu z metanolem, a jego stężenie w
fazie ruchomej wynosi 1%, to potrzeba przepuścić przez kolumnę co najmniej 10-krotną jej objętość w
celu dostarczenia odpowiedniej ilości metanolu. Na Rysunku poniżej przedstawiono nieustabilizowaną
linię bazową świadczącą o zbyt krótkim czasie stabilizacji kolumny.

Czas [min]

In

te

n

s

y

w

n

o

ś

ć

[

j.

u

.]

Nieustabilizowana linia podstawowa ze wzgl

ę

du na zbyt krótki czas stabilizowania kolumny.

ad.3

Detektor należy włączyć na 15-20 minut przed rozpoczęciem analiz (wyjątek stanowi detektor

refraktometryczny, którego stabilizacja może zająć 24 godziny). Przed rozpoczęciem analiz
chromatograficznych detektor należy wyzerować. Jeżeli detektor UV, UV-VIS-DAD lub fluorescencyjny
nie daje się wyzerować w całym, albo w części zakresu pomiarowego, zaś balans detektora RI nie daje się
sprowadzić do jednej diody świecącej to należy podejrzewać, że uzyty został eluent o niedostatecznej
czystości, albo - co gorzej - na powierzchni wewnętrznej naczyńka przepływowego w detektorze
wydzieliła się emulsja, albo depozyt substancji stałej. Jeśli tak to należy wymieć eluent na inny - o
wyższej czystości, a jeżeli to nie pomaga, przepłukać naczyńko przepływowe odpowiedniego detektora
kolejno: dichlorometanem, acetonem, wodą, acetonem, toluenem i powrócić do stosowanego eluentu. W
razie potrzeby zastosować ciecz pośrednią. Jeżeli to nie pomaga zastosować dodatkowo płukanie 5% -
owym kwasem azotowym.

ad. 4

W chromatografie cieczowym próbka wprowadzana zostaje (pod ciśnieniem atmosferycznym) do

kolumny poprzez dozownik. W kolumnie panuje ciśnienie do kilkudziesięciu MPa. Dozowniki są
skonstruowane tak, aby nie było w nich przestrzeni „martwych”, nie przemywanych fazą ruchomą. Zły
dozownik lub złe dozowanie mogą być przyczyną pojawienia się źle rozdzielonych, szerokich i
niesymetrycznych pików.
Najczęściej w HPLC stosuje się objętości nastrzykiwanych próbek w zakresie od 1(5) do 150 µl. Jako
optymalną objętość próbki do nastrzyku ustalić można na 5-25µl (najmniej efektów uboocznych
związanych z niewłaściwym przygotowanie próbki). Bardzo ważną kwestią dotyczącą nastrzyku jest
skład jakościowy roztworu, w którym nastrzykiwane są anality. Dlaczego? Otóż, przy przepływie 0,5
ml/min – przeliczając przepływ na µl/s otrzymujemy 8,3µl/s – nastrzyk o wielkości 5µl – przy założeniu,
ż

e moment nastrzyku trwa sekundę – powoduje, że do układu chromatograficznego wprowadzamy

niemalże jeszcze raz taką objętość cieczy, jaka w danej chwili przepływa przez kapilary. Spowodować to
może znaczne zaburzenie składu ilościowego fazy, a to jak wiadomo ma bardzo duży wpływ na
parametry retencji analitów. Stąd też roztwór do nastrzyku powinien przygotowywany w fazie ruchomej
aby jak największym stopniu zapobiec niepożądanym zmianom wcześniej ustalonych parametrów.
Istnieje możliwość tzw. przeładowania kolumny. W zależności o tego, czy za duże okazało się stężenie
wprowadzanej próbki czy jej objętość, mówi się o przeładowaniu objętościowym lub stężeniowym. W
trakcie zajęć omówione zostaną takie problemy, jak obecność pików frontujących i ogonujących (patrz
rysunki poniżej).

Cz a s re te n c ji [m in ]

Czas retencji [min]

Notatki własne

Ć

WICZENIE 2

D

OBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH

Dr in

ż

. B. Makuch, mgr in

ż

. J. Wilga

Pani Bogumiła Makuch jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pani Joanna Wilga jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie
faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.

Rysunek 1. Li

ś

cie Ginkgo bilobae

Już przed wiekami odkryto, że liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki
flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają
pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krążenia krwi, a także w zaburzeniach pracy mózgu
spowodowanych zaburzeniami krążenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią
obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.
Ekstrakty roślinne są złożonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie różniących się
właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania może być procesem trudnym i
pracochłonnym. Na ogół bywa, że nie jest możliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład
fazy ruchomej) i należy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej).
Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii
Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i można zaryzykować stwierdzenie, ż e90%
wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP – 18
tzn. żel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.

W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:

a – zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,
b – zmianą pH fazy ruchomej,
c- zastosowanie pary jonowej,
e – zmiana typu fazy ruchomej.

W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <
iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 – ry rozpuszczalniki w
różnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być
regulowane składem fazy ruchomej.

Podstawowa zależność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniża
wartość współczynnika retencji (k).

Bywają takie problemy rozdzielcze, które można rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie
ruchomej; można np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy założeniu stałej siły elucyjnej fazy
ruchomej korzysta się z prostej zależności:

S

T

=

ΣΣΣΣ

S

i

θθθθ

i

gdzie:
S

T

– całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,

S

i

– siła elucyjna rozpuszczalnika

θ

i – udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.

Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H

2

O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą

siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyższej zależności otrzymując:

S

T

= S

MeOH

θθθθ

+ S

H2O

θθθθ

= 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82

Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy założeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to
obliczenie jest następujące:
1,82 = 4,5 x X + 0 x X

→

ok. 40

czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).

Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadku
rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku
rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost
współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko
opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.

W układach RP mogą być stosowane również inne typy faz stacjonarnych np. RP – 8, rzadziej RP

– 2, jak również żel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W każdym przypadku kolejność elucji
jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje
niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zależny od długości
łańcucha fazy związanej z żelem krzemionkowym.

WYKONANIE ĆWICZENIA

W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie
Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.

Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali

λ

= 330 nm.

Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:

-

LiChrospher RP-18

-

Kolumna cyjanowa

Wykorzystywane fazy ruchome:

-

MeOH : H

2

O (7:3 v/v)

-

MeOH : H

2

O (9:3 v/v)

-

MeOH: H

2

O (7:3 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(1%)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(1%)

-

MeOH: H

2

O (7:3 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(0,1%)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(0,1%)

Parametry aparatury

•

Detektor UV/DAD L – 7450 firmy Merck HITACHI

•

Pętla dozująca 20

µ

l

•

Dozownik Rheodyne 7125

•

Pompa L – 6200 firmy Merck HITACHI

Notatki własne

Ć

WICZENIE 3

R

OZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW CHROMATOGRAFICZNYCH

–

PROBLEMY

ZWIĄZANE Z DOZOWANIEM PRÓBKI

,

KOLUMNĄ

,

POMPĄ I DETEKTOREM

.

Prof. dr hab. in

ż

. M. Kami

ń

ski, mgr in

ż

. E. Gilgenast, mgr in

ż

. G. Romanik

Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]
Panie Ewelina Gilgenast i Grażyna Romanik są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale
Chemicznym Politechniki Gdańskiej;

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby
rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji
gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;
metodyka zastosowania chromatografii żelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej
polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.

Streszczenie przebiegu ćwiczenia

1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /
eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:

-

doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,

-

dozowania bardzo małych i bardzo dużych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego
rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,

-

doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najważniejszych
detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),

-

problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /
minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w
cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów
proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, „demiksja”
składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się
składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.

2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów
zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i
ś

rednio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu

zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. „czystości
pików”;

3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii żelowej do oznaczenia rozkładu masy
molekularnej polimeru - kalibracja „nisko-dyspersyjnymi” standardami polimeru, a następnie oznaczenie
rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy
styropianowej).

4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w
warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji – przykład
preparatywnego zastosowania HPLC w skali „modelowej”.

Materiały, aparatura, oprogramowanie

Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo – tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),
acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości „do HPLC” („HPLC grade”), albo „do elucji gradientowej”
(„gradient grade”);

Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, „przeprowadzony”
do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-
heksane o stężeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stężeniach ok. 0.1 g/ml.

Aparatura i wyposażenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK – HITACHI serii LaChrom
(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN – 100 7 um, termostat kolumny,
detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie „HSM”; B) Chromatograf
cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy
zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem sprężonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z
dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)
Chromatograf cieczowy serii „Elite” MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie
rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.

Przydatne w praktyce zależności obliczeniowe

1.

Rozdzielczość (R

S

) - uzależnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności

układu chromatograficznego i jest wyrażona następującym równaniem:

2

2

1

1

4

k

k

N

R

S

+

−

=

α

α

2.

Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:

2

2

/

1

)

(

54

,

5

l

S

L

H

C

=

2

2

/

1

)

(

54

,

5

S

l

H

L

N

C

=

=

a

b

As

=

1

,

0

0

t

L

u

C

=

•

Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezależnie od
skali rozdzielania – równanie Knoxa

ν

ν

ν

C

A

B

h

teor

+

+

=

33

,

0

, gdzie

p

d

H

h

=

;

M

p

D

ud

=

ν

(dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)

Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do
obliczenia parametrów sprawności kolumny

Znaczenie symboli:

a, b – część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)

α

- współczynnik selektywności

As

0,1

– współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości

A, B, C – stałe dla konkretnej kolumny
D

M

– współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie

d

p

– średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny

h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej
H – wysokość wypełnienia równoważna półce teoretycznej
h

teor

– wartość h otrzymana z równania Knoxa

k

2

– współczynnik retencji substancji później eluowanej

l –

odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natężenia

przepływu eluentu)
L

C

– długość wypełnienia kolumny

N- liczba półek teoretycznych
R

S

– stopień rozdzielenia

S

1/2

– szerokość piku w ½ wysokości

t

0

– czas martwy kolumny

u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie

ν

- tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu

Uwagi i zalecenia

Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia także dla przedyskutowania z
prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania
HPLC.

Literatura

1.

Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk
2004

2.

Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995

Notatki własne

Ć

WICZENIE 4.

A

NALIZA ILOŚCIOWA ZWIĄZKÓW W PROBKACH

dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego do oznaczenia
zawartości fluoksetyny w próbce.

Charakterystyka fluoksetyny

Produkcja, leków, choć tak pożyteczna dla ludzi i zwierząt, może stać się też dla nich zagrożeniem.
Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających,
stanowi poważny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są w
dalszej kolejności obecne w mierzalnych stężeniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jak
również wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków,
spożywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, a
także ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak już niebezpiecznego
zjawiska lekooporności.

Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitory
wychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych należy m.in. fluoksetyna, którą w
1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac®. Jedna
kapsułka np.: Prozac®, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mg
fluoksetyny.

Oznaczenie chromatograficzne.

Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli
inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:

•

próbki wzorcowej, w której znane jest stężenie analitu;

•

próbki badanej.

W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych
związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.

Analiza jakościowa:

Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we
wzorcu

Na podstawie widma UV lub/i MS

Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch różnych długości fal

A

1

A

2

A

1

/A

2

= constans dla danego analitu

Analiza ilościowa

metoda wzorca zewnętrznego

W tym celu należy przygotować szereg rozcieńczeń

analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i
wyznaczyć zależność powierzchni piku od stężenia.

A następnie dokonać analizy chromatograficznej i
znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego
analitu, po czym obliczyć stężenie (z krzywej
kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji

A/C = A

x

/C

x

gdzie, C

x

= C*A

x

/ A )

Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji

o st

ę

ż

eniach róznych st

ę

ż

eniach.

metoda dodatku wzorca

metoda wzorca wewnętrznego

metoda normalizacji

y = 129,47x - 3,6134

R

2

= 0,9998

0

100

200

300

400

500

600

700

0

1

2

3

4

5

6

St

ę

ż

enie [C]

P

o

le

p

o

w

ie

rz

c

h

n

i

p

ik

u

[

A

]

Warunki analizy chromatograficznej umozliwiaj

ą

cej oznaczenie zawarto

ś

ci fluksetyny

Elementy układu pomiarowego

Rodzaj elementu i parametry pracy

Chromatograf cieczowy

HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100

Składniki fazy ruchomej

A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H

2

O (0,1% TFAA)

Skład

40% MeOH : 60% H

2

O

Faza ruchoma

Prędkość przepływu

0.5 ml/min

Kolumna

Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5µm

Detektor

UV – 226nm

Wielkość nastrzyku

20µl

Czas trwania analizy

20 min

Przebieg ćwiczenia:

Przygotować wzorzec fluoksetyny o stężeniu 100mg/mL i nastrzyknąć.

W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU].

Ponieważ związek ten dobrze rozpuszcza się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski

tymże rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stężeniu 100µg/ml.

Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny

(maprotylina

jest tutaj wzorcem wewn

ę

trznym) wraz z widmami UV i MS.

220 240 260 280

300 320

340 360 380

mAU

0

50

100

150

200

250

DAD1, 9.541 (0. 6 mAU, Bln) of CHECKV15.D

DAD1, 12. 074 (1.0 mAU, - ) of CHECKV15.D

DAD1, 10. 474 (291 mAU, - ) of CHECKV15.D

Długo

ś

ć

fali [nm]

A

220

240 260 280 300 320

340 360 380

mAU

0

100

200

300

400

500

600

DAD1, 6.034 (1.5 mAU, - ) of CHECKV15.D

DAD1, 7.981 (4.1 mAU, - ) of CHECKV15.D

DAD1, 6.714 (686 mAU, - ) of CHECKV15.D

Długo

ś

ć

fali [nm]

B

Sporządzenie rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny;

Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposażonych w nakrętki z

tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stężeniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7,

0.3, 0.2, 0.02, 0.001 µg/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego

wprowadzić po 20µl każdego roztworu.

Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwyższym stężeniu;

Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o niższym stężeniu;

Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stężenie na podstawie jednego punktu (z

analizy pierwszej); zastanowić się nad źródłami błędu;

Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej

parametry;

Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stężeniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć

stężenie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad źródłami błędów;

Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt;

Powtórzyć schemat postępowania aż do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;

Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD

Wyznaczyć stężenie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stężeniu.

Notatki własne

Wszelkie prawa zastrze

ż

one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie cało

ś

ci lub fragmentów

niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo

ż

e by

ć

powielany ani rozpowszechniany

za pomoc

ą

urz

ą

dze

ń

elektronicznych, mechanicznych, kopiuj

ą

cych, nagrywaj

ą

cych i innych bez

pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jak

ą

kolwiek metod

ą

powoduje

naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.