W

YSOKOSPRAWNA

C

HROMATOGRAFIA

C

IECZOWA

materiały do ćwiczeń seminaryjno-

laboratoryjnych z HPLC

G

d

a

ń

s

k

SPIS TRE

Ś

CI

Ć

wiczenie 1

Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych.

Dr in

ż

. B. Makuch, mgr in

ż

. J. Wilga

Ć

wiczenie 2

Walidacja metodyki analitycznej.

Dr M.

Ś

lebioda

Ć

wiczenie 3

Rozwi

ą

zywanie problemów chromatograficznych – problemy zwi

ą

zane z

dozowaniem próbki, kolumn

ą

, detektorem; dobór warunków rozdzielania w

układzie NP.-HPLC; chromatografia

ż

elowa w zastosowaniu do oznaczania

rozkładu masy molekularnej polimerów.

Prof. dr hab. in

ż

. M. Kami

ń

ski, mgr in

ż

. E. Gilgenast

Ć

wiczenie 4

Analiza jako

ś

ciowa i ilo

ś

ciowa zwi

ą

zków w próbkach (HPLC-DAD-MS).

Dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Ć

wiczenie 5

Oznaczanie anionów/kationów z wykorzystaniem chromatografii jonowej.

Prof. dr hab. in

ż

. B. Zygmunt

Ć

wiczenie 6

Oznaczanie anionów nieorganicznych w wodach ró

ż

nego pochodzenia z

wykorzystaniem izotachoforezy.

Mgr in

ż

. J. Curyło, prof. dr hab. in

ż

. W. Wardencki

Niniejsze materiały powstały dzi

ę

ki współpracy

wielu współpracowników i doktorantów

Katedry Chemii Analitycznej

oraz osób z ni

ą

zaprzja

ź

nionych.

Wszystkim serdecznie dzi

ę

kuj

ę

za pomoc w przygotowaniu

niniejszego kompendium.

Agata Kot-Wasik

ĆWICZENIE 1
D

OBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE FAZ ODWRÓCONYCH

Dr in

ż

. B. Makuch, mgr in

ż

. J. Wilga

Pani Bogumiła Makuch jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pani Joanna Wilga jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie
faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.

Rysunek 1. Li

ś

cie Ginkgo bilobae

Już przed wiekami odkryto, że liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki
flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają
pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krążenia krwi, a także w zaburzeniach pracy mózgu
spowodowanych zaburzeniami krążenia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią
obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.
Ekstrakty roślinne są złożonymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie różniących się
właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania może być procesem trudnym i
pracochłonnym. Na ogół bywa, że nie jest możliwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład
fazy ruchomej) i należy stosować gradient (zmiana skokowa bądź ciągła składu fazy ruchomej).
Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii
Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i można zaryzykować stwierdzenie, ż e90%
wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP – 18
tzn. żel krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.

W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:

a – zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,
b – zmianą pH fazy ruchomej,
c- zastosowanie pary jonowej,
e – zmiana typu fazy ruchomej.

W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <
iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4 – ry rozpuszczalniki w
różnych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być
regulowane składem fazy ruchomej.

Podstawowa zależność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obniża
wartość współczynnika retencji (k).

Bywają takie problemy rozdzielcze, które można rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie
ruchomej; można np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy założeniu stałej siły elucyjnej fazy
ruchomej korzysta się z prostej zależności:

S

T

=

ΣΣΣΣ

S

i

θθθθ

i

gdzie:
S

T

– całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,

S

i

– siła elucyjna rozpuszczalnika

θ

i – udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.

Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H

2

O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą

siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powyższej zależności otrzymując:

S

T

= S

MeOH

θθθθ

+ S

H2O

θθθθ

= 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82

Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy założeniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to
obliczenie jest następujące:
1,82 = 4,5 x X + 0 x X

→

ok. 40

czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).

Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadku
rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku
rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost
współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko
opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.

W układach RP mogą być stosowane również inne typy faz stacjonarnych np. RP – 8, rzadziej RP

– 2, jak również żel modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W każdym przypadku kolejność elucji
jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje
niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zależny od długości
łańcucha fazy związanej z żelem krzemionkowym.

WYKONANIE ĆWICZENIA

W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie
Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.

Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali

λ

= 330 nm.

Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:

-

LiChrospher RP-18

-

Kolumna cyjanowa

Wykorzystywane fazy ruchome:

-

MeOH : H

2

O (7:3 v/v)

-

MeOH : H

2

O (9:3 v/v)

-

MeOH: H

2

O (7:3 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(1%)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(1%)

-

MeOH: H

2

O (7:3 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(0,1%)

-

THF:H

2

O (4:6 v/v) z dodatkiem H

3

PO

4

(0,1%)

Parametry aparatury

•

Detektor UV/DAD L – 7450 firmy Merck HITACHI

•

Pętla dozująca 20

µ

l

•

Dozownik Rheodyne 7125

•

Pompa L – 6200 firmy Merck HITACHI

Notatki własne

ĆWICZENIE 2
W

ALIDACJA METODYKI ANALITYCZNEJ

Dr M.

Ś

lebioda

Pan Marek Ślebioda jest pracownikiem Perlan Technologies Polska Sp. z o.o.
ul. Puławska 303, 02-785 Warszawa;
www.perlan.com.pl

Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie uczestników z możliwością automatyzacji przygotowania, wykonania i
opracowania testów związanych z walidacją metody chromatograficznej. Przeprowadzone zostanie
wyznaczenia granicy oznaczalności (LOQ) i wykrywalności (LOD) kilku związków zawartych w
mieszaninie w oparciu o metodę krzywej wzorcowej. Ogólny opis wymagań dotyczących walidacji metod
chromatograficznych można znaleźć w odpowiednich artykułach ciał normalizujących ten proces. Skrót
zawarty jest w publikacji [1].

Podstawowe definicje

Granica wykrywalności jest zdefiniowana jako ilość (lub stężenie) analitu dająca odpowiedz y

DL

znacząco różną

(trzy odchylenia standardowe s

B

) od szumu tła y

B

:

(1)

B

B

DL

s

y

y

3

=

−

Pomimo możliwosci zastosowania obliczeń elektronicznych bezpośredni pomiar y

B

oraz s

B

jest zwykle w metodach

chromatograficznych niedogodny i niedokładny ze względu na małe wielkości mierzone. Wartość s

B

może być

zastąpiona przez oszacowanie błędu standardowego s

e

z krzywej regresji ilość analitu względem

odpowiedzi:

(2)

(

)

η

−

−

=

n

y

y

s

est

obs

e

2

gdzie

y

obs

jest wartością obserwowaną

y

est

jest wartością obliczoną z krzywej kalibracyjnej

n jest liczbą punktów kalibracyjnych

η

dla regresji liniowej wynosi 2

W punkcie odpowiadającym granicy wykrywalności y

DL

= A·C

DL

+ y

B

, gdzie C

DL

jest ilością analitu odpowiadającą

granicy wykrywalności oraz A jest czułością analityczna (nachyleniem prostej regresji). Łącząc
te równania otrzymuje się:

(3)

A

s

C

e

DL

3

=

Jako granicę oznaczalności można uważać najmniejszą ilość analitu, która daje się oznaczyć z wystarczającą
precyzją (dziesięć odchyleń standardowych s

B

). Stosując oszacowanie błędu na podstawie linii regresji można ją

obliczyć jako:

(4)

A

s

C

e

QL

10

=

Program obliczeniowy

Do projektowania walidacji, zbierania danych i wykonania obliczeń zastosowany zostanie automatyczny program
obliczeniowy Method Validation Pack [i] współpracujący z programem sterującym chromatografem. Po zebraniu
danych i ich ocenie można w programie Method Validation Pack wygenerować automatycznie raport końcowy
zawierający wyniki analizy statystycznej. Dostępne w programie wzorce walidacji pozwalają na szybką
konfigurację testów zgodnie z zaleceniami ICH Q2A/2B, USP, EP, DIN oraz FDA. Istnieje możliwość dołączenia
do raportu z walidacji elektronicznych wersji standardowych procedur operacyjnych oraz innych dokumentów
związanych z procesem walidacji. Sposób działania programu przedstawiony jest schematycznie na rysunku 1.

Rysunek 1. Wymiana informacji w programie Method Validation Pack

Sprz

ę

t i odczynniki

Aparatura

•

Zestaw do wysokosprawnej chromatografii cieczowej składający się z pompy gradientowej, automatycznego
podajnika próbek, termostatu kolumn i detektora UV-Vis [2].

•

Kolumna chromatograficzna ZORBAX Eclipse XDB-C8, dp=5µm, 4.6x150mm [3].

•

Zestaw sterujący zawierający programy ChemStation [4], ChemStore [5] oraz Method Validation Pack [6].

Odczynniki

•

Metanol, do HPLC

•

Woda, Mili-Q

•

Próbka testowa „Isocratic standard” [7] zawierająca 0.15%w/w ftalanu dimetylowego, 0.15%w/w ftalanu
dietylowego, 0.01%w/w bifenylu i 0.03%w/w orto-terfenylu w metanolu.

Metoda analityczna

Oznaczenia zostaną przeprowadzone przy pomocy izokratycznej metody chromatograficznej z detekcją UV-Vis.

•

Faza ruchoma:

metanol + woda (80+30)v/v

•

Przepływ fazy ruchomej:

1.5 ml/min

•

Temperatura:

25ºC

•

Objętość próbki:

5 µl

•

Detekcja:

254/10 nm (jednowiązkowa)

Przebieg

ć

wiczenia

Planowanie walidacji

Zakres badań, jakie podejmuje laboratorium w trakcie walidacji nowej, zmodyfikowanej lub nie stosowanej
dotychczas metody, zależy od istniejącego statusu metody i kompetencji laboratorium. W trakcie walidacji metody
trzeba zdefiniować parametry, granice akceptacji i częstotliwość rutynowych testów przystawalności lub bieżącej
kontroli jakości analitycznej metody. Należy także określić kryteria wskazujące, kiedy metoda jest poza granica
kontroli statystycznej. Laboratorium prowadzące walidacje metody powinno w pełni udokumentować kompletność
procesu walidacji.
W trakcie ćwiczenia pokazany zostanie sposób dołączania elektronicznych wersji dokumentów do raportu z
walidacji generowanego przez program Method Validation Pack. Jako przykładowy dokument zostanie użyty opis
metody chromatograficznej wydrukowany z programu sterującego ChemStation do pliku w formacie pdf.

Identyfikacja pików chromatograficznych

Podstawą działania programu Method Validation Pack jest rozpoznanie pików chromatograficznych związków, dla
których mają być prowadzone testy walidacyjne. W tym celu zostanie przeprowadzona analiza wzorca o
najmniejszym stężeniu (wzorzec 1). Chromatogram z tej analizy będzie podstawą do ustalenia parametrów integracji
i identyfikacji pików chromatograficznych. Szczegółowe instrukcje dotyczące sprzętu i programu poda prowadzący
ćwiczenie.

•

Należy uruchomić program ChemStation bez podłączenia do bazy danych:

•

Następnie należy wczytać metodę chromatograficzą MV_lab.m, wypełnić dane dotyczące próbki wpisując
katalog Grupa_x i nazwę pliku danych Test_x (gdzie x jest numerem grupy ćwiczeniowej).

•

Otrzymany chromatogram powinien być zbliżony do przedstawionego na rysunku 2.

min

1

2

3

4

5

6

mAU

0

20

40

60

80

100

DAD1 A, Sig=254,4 Ref =550,100 (DEMO\005-0101.D)

0

.7

4

7

1

.0

2

1

2

.5

6

5

5

.8

3

7

Rysunek 2. Typowy chromatogram próbki „isocratic standard”

•

Należy przeprowadzić automatyczny dobór parametrów integracji pików chromatograficznych

Ze wzgl

ę

du na ramy czasowe, w trakcie

ć

wiczenia nie b

ę

d

ą

omawiane sposoby doboru parametrów integracji

i ich wpływ na wyniki ilo

ś

ciowe oznaczenia.

•

Do tabeli kalibracyjnej trzeba wprowadzić nazwy związków i odpowiadające im ilości.

•

Na koniec należy zapisać metodę chromatograficzną pod zmienioną nazwą: File -> Save as... -> Method ->
Grupa_x.m

Utworzenie pliku walidacji w programie Method Validation Pack

Przygotowanie testów walidacyjnych oraz dokumentacji zostanie wykonane w programie Method Validation Pack.
Poniżej opisane są skrótowo niezbędne kroki. Dokładnych wskazówek udzieli prowadzący ćwiczenie.

•

Należy uruchomić program Method Validation Pack podłączając się do bazy danych MV_lab.mdb jako
użytkownik admin (hasło admin).

•

W następnym kroku trzeba utworzyć nową walidację Grupa_x

•

Zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji można zmienić jej parametry ogólne. Po pierwsze należy
ustalić, czy wymagany jest podpis elektroniczny zgodnie z normą 21CFR 11? W ramach ćwiczeń to wymaganie
nie będzie stosowane.

•

Do projektu walidacji zostanie dołączony przykładowy dokument zewnętrzny (parametry metody
chromatograficznej wyeksportowane z programu ChemStation). W rzeczywistości powinny to być odpowiednie
dokumenty związane z walidacją, takie jak opis projektu, standardowe procedury operacyjne i inne. Program
Method Validation Pack dołączy je automatycznie do raportu końcowego i będzie przechowywał elektronicznie
powiązania dokumentów. W tym celu należy wybrać kolejno opcje: External Documents -> Add i wybrać z
katalogu Hpchem / 1 /Temp dokument Metoda.pdf.

•

Parametry testów statystycznych stosowanych podczas walidacji można dostosować wybierając opcję
Configuration i odpowiednią zakładkę. W trakcie ćwiczenia będą używane ustawienia domyślne.

•

W oknie dialogowym Properties można również wpisać domyślne nagłówki, które będą obowiązywały dla
całej walidacji, wybierając opcję Default Header Data.

W

ę

zły walidacji

Węzłami walidacji są nazwy związków obecnych w analizowanej mieszaninie, do których będą przyporządkowane
testy walidacyjne. Uwaga: nazwy węzłów muszą ściśle odpowiadać nazwom związków w tabeli kalibracyjnej
walidowanej metody zadeklarowanym poprzednio w programie ChemStation.

•

Węzeł można utworzyć zaznaczając prawym okiem myszy nazwę walidacji i wybierając opcję Add
Component...

•

Po wpisaniu nazwy węzła trzeba wybrać rodzaj testu walidacyjnego, czyli w tym ćwiczeniu Limit of detection /
quantitation

•

W kolejnych krokach można dodać następne węzły.

•

Szczegółowe planowanie każdego testu można rozpocząć po zaznaczeniu tego testu prawym okiem myszy i
wybraniu opcji Planning. W czasie ćwiczenia instruktor zasugeruje sposób wypełnienia pojawiającej się tablicy
dialogowej.

Ustawienia globalne

Przed przystąpieniem do eksportowania zadań z programu Method Validation Pack do programu ChemStation
sterującego sprzętem dobrze jest sprawdzić i skorygować ustawienia globalne dotyczące sposobu traktowania
danych źródłowych oraz wyglądu raportu.

•

Wybierając menu rozwijalne Utilities -> Options oraz odpowiednie zakładki można edytować ogólny sposób
działania programu Method Validation Pack. W trakcie ćwiczenia zostanie sprawdzony i odpowiednio
ustawiony sposób traktowania danych źródłowych w zakładce C/S (ChemStore).

Eksport badania do bazy danych

Ostatnim zadaniem podczas planowania walidacji jest eksport zadań do bazy danych, z której mogą być w
dogodnym czasie wczytane do programu ChemStation.

•

Po wybraniu opcji Create Study and MVS for ChemStation Plus w polu MVS Status uruchomiony zostanie
kreator eksportu badania. Odpowiednie kroki działania tego kreatora zostaną omówione w czasie ćwiczenia.

Import zadania do programu ChemStation

Przed rozpoczęciem wczytywania zadania do programu sterującego ChemStation użytkownik tego programu musi
być podłączony do odpowiedniej bazy danych.

•

W programie ChemStation należy wybrać Database Logon... , wybrać bazę danych MV_lab i wpisać hasło

•

Po podłączeniu do bazy danych można przeprowadzić import sekwencji wygenerowanej w programie Method
Validation Pack

•

Sekwencja jest wykonywana w programie ChemStation, a wyniki są zapisywane w bazie danych.

Import danych do programu Method Validation Pack

Program Method Validation Pack może pobierać wyniki oznaczeń z danych programu ChemStation, importować je
z różnych formatów plików oraz mogą one być wprowadzane ręcznie.
W trakcie ćwiczenia zostanie przeprowadzony:

•

Import danych uzyskanych po wykonaniu sekwencji w programie ChemStation

•

Import danych z pliku w formacie Excel

•

Ręczne uzupełnienie danych

Szczegóły poda prowadzący ćwiczenia
Raport z walidacji metody

W ramach ćwiczenia zostanie pokazany sposób generowania ogólnego lub częściowego raportu z walidacji metody
w programie Method Validation Pack

Literatura

1.

M. Ślebioda, Walidacja metod chromatograficznych, Perlan Technologies (2004)

2.

Agilent Technologies Inc., numer produktu G2184AA

3.

Agilent Technologies Inc., seria 1100

4.

Agilent Technologies Inc., numer produktu 993967-906

5.

Agilent Technologies Inc., numer produktu G2070AA

6.

Agilent Technologies Inc., numer produktu G2181BA

7.

Agilent Technologies Inc., numer produktu 01080-68704

Notatki własne

ĆWICZENIE 3
R

OZWIĄZYWANIE PROBLEMÓW CHROMATOGRAFICZNYCH

–

PROBLEMY

ZWIĄZANE Z DOZOWANIEM PRÓBKI

,

KOLUMNĄ

,

DETEKTOREM

;

DOBÓR

WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKŁADZIE

NP- HPLC;

C

HROMATOGRAFIA śELOWA W ZASTOSOWANIU DO OZNACZANIA

ROZKŁADU MASY MOLEKULARNEJ POLIMERÓW

Prof. dr hab. in

ż

. M. Kami

ń

ski, mgr in

ż

. E. Gilgenast

Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]
Pani Ewelina Gilgenast jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby
rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji
gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;
metodyka zastosowania chromatografii żelowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej
polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.

Streszczenie przebiegu ćwiczenia

1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /
eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:

-

doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,

-

dozowania bardzo małych i bardzo dużych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego
rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,

-

doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najważniejszych
detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),

-

problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /
minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w
cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów
proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika, „demiksja”
składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się
składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.

2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów
zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i
średnio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu
zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw. „czystości
pików”;

3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii żelowej do oznaczenia rozkładu masy
molekularnej polimeru - kalibracja „nisko-dyspersyjnymi” standardami polimeru, a następnie oznaczenie
rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy
styropianowej).

4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w
warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji – przykład
preparatywnego zastosowania HPLC w skali „modelowej”.

Materiały, aparatura, oprogramowanie

Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo – tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),
acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości „do HPLC” („HPLC grade”), albo „do elucji gradientowej”
(„gradient grade”);

Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu, „przeprowadzony”
do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-
heksane o stężeniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stężeniach ok. 0.1 g/ml.

Aparatura i wyposażenie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK – HITACHI serii LaChrom
(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN – 100 7 um, termostat kolumny,
detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie „HSM”; B) Chromatograf
cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy
zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem sprężonego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z
dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)
Chromatograf cieczowy serii „Elite” MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie
rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.

Przydatne w praktyce zależności obliczeniowe

1.

Rozdzielczość (R

S

) - uzależnia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności

układu chromatograficznego i jest wyrażona następującym równaniem:

2

2

1

1

4

k

k

N

R

S

+

−

=

α

α

2.

Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:

2

2

/

1

)

(

54

,

5

l

S

L

H

C

=

2

2

/

1

)

(

54

,

5

S

l

H

L

N

C

=

=

a

b

As

=

1

,

0

0

t

L

u

C

=

•

Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezależnie od
skali rozdzielania – równanie Knoxa

ν

ν

ν

C

A

B

h

teor

+

+

=

33

,

0

, gdzie

p

d

H

h

=

;

M

p

D

ud

=

ν

(dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)

Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do
obliczenia parametrów sprawności kolumny

Znaczenie symboli:

a, b – część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)

α

- współczynnik selektywności

As

0,1

– współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości

A, B, C – stałe dla konkretnej kolumny
D

M

– współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie

d

p

– średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny

h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej
H – wysokość wypełnienia równoważna półce teoretycznej
h

teor

– wartość h otrzymana z równania Knoxa

k

2

– współczynnik retencji substancji później eluowanej

l –

odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natężenia

przepływu eluentu)
L

C

– długość wypełnienia kolumny

N- liczba półek teoretycznych
R

S

– stopień rozdzielenia

S

1/2

– szerokość piku w ½ wysokości

t

0

– czas martwy kolumny

u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie

ν

- tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu

Uwagi i zalecenia

Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia także dla przedyskutowania z
prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania
HPLC.

Literatura

1.

Chromatografia cieczowa – praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk
2004

2.

Z. Witkiewicz – Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995

Notatki własne

ĆWICZENIE 4.
A

NALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI

HPLC-DAD-MS

dr in

ż

. A. Kot-Wasik

Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie oznaczenia zawartości analitów z grupy WWA obecnych w
próbkach środowiskowych z wykorzystaniem techniki HPLC-DAD lub/i HPLC-DAD-MS.

Charakterystyka oznaczanych związków

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) zaliczane są do tzw. trwałych zanieczyszczeń
środowiska (ang. Persistant Organic Pollutant’s – POP’s) i charakteryzują się wysoką trwałością,
toksycznością, i zdolnością do kumulacji. Związków tych jest ponad sto, lecz z uwagi na ich szkodliwość,
oddziaływanie na człowieka oraz wielkość dostępnych informacji, najczęściej oznaczanych jest 16. Są to:
acenaften, acenaftylen, antracen, benzo(a)antracen, benzo(a)piren, benzo(e)piren, benzo(b)fluoranten,
benzo(j)fluoranten, benzo(k)fluoranten, benzo(g,h,i)perylen, chryzen, dibenzo(a,h)antracen, fluoranten,
fluoren, fenantren, naftalen, piren i indeno(1,2,3-cd)piren.

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne są związkami zawierającymi od 2 do 13
skondensowanych pierścieni aromatycznych. Związki te charakteryzują się płaską budową, gdyż atomy
węgla wchodzące w skład pierścieni znajdują się w stanie hybrydyzacji sp2. To powoduje, że układ
aromatyczny jest trwały a reakcje chemiczne i biochemiczne prowadzące do jego utraty zachodzą z
trudem.

W miarę wzrostu ilości pierścieni w cząsteczce rośnie także stosunek C do H a co za tym idzie również
odporność cząsteczki na rozerwanie.

WWA wykazują zdolność do fluorescencji w zakresie promieniowania UV, co wynika z obecności
sprzężonych wiązań podwójnych między atomami węgla w pierścieniach.

Tabela 1. Charakterystyka wybranych zwi

ą

zków nale

ż

ą

cych do grupy Wielopier

ś

cieniowych

W

ę

glowodorów Aromatycznych

Nazwa

Wzór sumaryczny

Masa

cząsteczkowa

Widmo (UV)

fl

u

o

re

n

C

13

H

10

166,2

fe

n

a

n

tr

en

C

14

H

10

178,2

a

n

tr

a

ce

n

C

14

H

10

178,2

p

ir

en

C

16

H

10

202,3

ch

ry

ze

n

C

18

H

12

228,3

b

en

zo

(a

)p

ir

en

C

20

H

12

252,3

Oznaczenie chromatograficzne zawartości WWA.

Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli
inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:

•

próbki wzorcowej, w której znane jest stężenie analitu;

•

próbki badanej.

W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych
związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.

Analiza jakościowa:

Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we
wzorcu

Na podstawie widma UV lub/i MS

Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch różnych długości fal

A

1

A

2

A

1

/A

2

= constans dla danego analitu

Analiza ilościowa

metoda wzorca zewnętrznego

W tym celu należy przygotować szereg rozcieńczeń

analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i

wyznaczyć zależność powierzchni piku od stężenia.

A następnie dokonać analizy chromatograficznej i
znaleźć wartość powierzchni piku dla badanego
analitu, po czym obliczyć stężenie (z krzywej
kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji

A/C = A

x

/C

x

gdzie, C

x

= C*A

x

/ A )

Rys. Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji o st

ę

ż

eniach 0.5, 1, 2.5 µg/mL.

metoda dodatku wzorca

Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilości (najkorzystniej znanej masy) substancji
oznaczanych (analitów) np. 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 i 0.5 mg/mL, zwykle jest to od 50 do 150% oczekiwanej
zawartości oznaczanej substancji. Na podstawie uzyskanych chromatogramów, wykreśla się krzywą
kalibracyjną, tj. zależność powierzchni piku analitu w funkcji ilości analitu dodanej do próbki. Następnie
przeprowadza się graficzną ekstrapolację krzywej kalibracyjnej do punkt przecięcia z osią odciętych i
odczytuje się wartość Cx.

metoda wzorca wewnętrznego

metoda normalizacji

Warunki analizy chromatograficznej

Parametry

Szczegóły

Faza ruchoma

A: H

2

O

B: ACN:MeOH

Gradient

Time

% A

% B

Przepływ: 0.8 mL/min

0

25

75

8

0

100

15

0

100

Temperatura

25

o

C

Objętość nastrzyku

20 µL

Detekcja

250 nm, 260 nm, 265 nm, 295 nm

Kolumna

LiChrospher RP-18e (5

µ

m)

y = 129,47x - 3,6134

R

2

= 0,9998

0

100

200

300

400

500

600

700

0

1

2

3

4

5

6

St

ę

ż

enie [C]

P

o

le

p

o

w

ie

rz

c

h

n

i

p

ik

u

[

A

]

Przebieg ćwiczenia:

Sporządzenie krzywych wzorcowych

Do sporządzenia serii rozcieńczeń poszczególnych związków w celu przygotowania krzywych
wzorcowych należy wykorzystać wzorce o stężeniu 10µg/mL. Do fiolek o pojemności 1.5mL,
wyposażonych w plastikowe zakrętki z centrycznym otworem oraz uszczelkę teflonową dodać za pomocą
mikrostrzykawki szklanej odpowiednio: 500, 250, 100, 50, 25, 10µL metanolowego roztworu mieszaniny
wzorców, a następnie każdą z fiolek uzupełnić do objętości 1mL za pomocą metanolu. Punkty
wyznaczające krzywe wzorcowe dla oznaczanych związków będą mieścić się w zakresie 0,1 - 5µg/mL.

Nastrzyknąć mieszaninę wzorcową (6 analitów) o najwyższym stężeniu;

Zidentyfikować związki;

Nastrzyknąć mieszaninę o niższym stężeniu;

Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stężenie na podstawie jednego punktu (z
analizy pierwszej);

Zastanowić się nad źródłami błędu;

Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywa kalibracyjną;

Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stężeniu traktując ją jako analizę próbki i policzyć stężenie na
podstawie dotąd otrzymanych wyników;

Zastanowić się nad źródłami błędów;

Uzupełnić krzywa kalibracyjna o kolejny punkt;

Powtórzyć schemat postępowania aż do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;

Oszacować granice wykrywalności/ oznaczalności

•

Z chromatogramu;

•

Z przedłużenia krzywej kalibracyjnej;

•

Z analizy kolejnych rozcieńczeń.

Wyznaczyć stężenie wybranych analitów w mieszaninie o nieznanym stężeniu.

Notatki własne

ĆWICZENIE 5
O

ZNACZANIE ANIONÓW

/

KATIONÓW Z WYKORZYSTANIEM

CHROMATOGRAFII JONOWEJ

.

Prof. dr hab. in

ż

. B. Zygmunt

Pan Bogdan Zygmunt jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej

Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie

Notatki własne

ĆWICZENIE 6.
O

ZNACZANIE ANIONÓW NIEORGANICZNYCH W WODACH RÓśNEGO

POCHODZENIA Z WYKORZYSTANIEM IZOTACHOFOREZY

.

mgr in

ż

. J. Curyło, dr hab. in

ż

. W. Wardencki

Pan Waldemar Wardencki jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pan Janusz Curyło jest jest doktorantem na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;

[e-mail]

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie oznaczenia zawartości anionów w próbkach wody pitnej i
powierzchniowej przy użyciu techniki izotachoforezy.

Izotachoforeza

Izotachoforezą nazywamy proces rozdzielania jonów (kationów lub anionów), które w polu

elektrycznym przy zastosowaniu odpowiedniego elektrolitu wiodącego i kończącego formują się w strefy
według ich zmniejszającej się ruchliwości i poruszają z jednakową prędkością.

Zasada izotachoforezy

Podczas jednorazowej analizy techniką izotachoforezy mogą być rozdzielane tylko jony o tym

samym znaku (kationy lub aniony). Elektrolit podstawowy dobiera się w taki sposób aby kation lub anion
elektrolitu wiodącego (L) i terminującego(T) miał odpowiednio najwyższą i najniższą ruchliwość (µ) w
stosunku do badanych analitów. Tak więc wymogiem rozdzielania metodą izotachoforezy jest aby
µ

L

>µ

anality

>µ

T

.

W przypadku przeprowadzania izotachoforezy anionu postępuje się następująco: przestrzeń

anodową i kapilarę napełnia się elektrolitem wiodącym, którego anion jest bardzo ruchliwy, kation zaś
posiada dużą pojemność buforową. Przestrzeń katodowa powinna zawierać elektrolit, którego anion ma
efektywną ruchliwość dużo niższą od ruchliwości wszystkich składników analizowanej próbki. Elektrolit
nazywa się elektrolitem zatrzymującym, (terminującym), a jego jon terminatorem. Próbkę wprowadza się
przez dozownik pomiędzy elektrolit wiodący i elektrolit terminujący. Następnie do elektrod przykłada się
odpowiednie napięcie, w wyniku czego przepływa prąd. W układzie takim wprowadzone jony po
niedługim czasie układają się w szereg sąsiadujących ze sobą stref wg malejącej ruchliwości, po czym
całość wędruje z jednakową prędkością do odpowiedniej elektrody.

Przebieg procesu rozdzielania przedstawia rysunek rys. 1. Górna część rysunku (a) przedstawia

elektrolit wiodący (L), wprowadzoną próbkę (aniony A i B, dla których µ

A

>µ

B

) i elektrolit terminujący

(T). Na odciętej odłożone jest położenie wewnątrz kapilary, a na rzędnej – stężenia składników. Kolejne
fragmenty rysunku obrazują stan rozdzielenia w następujących po sobie przedziałach czasowych.
Fragment (b) przedstawia strefę elektrolitu wiodącego przesuwającą się przez kapilarę w kierunku
przestrzeni anodowej. Stężenie składnika B ustala się na wartość, która zgodnie z prawem Kohlrauscha
odpowiada stężeniu elektrolitu wiodącego

B

Q

B

Q

A

A

B

A

c

c

µ

µ

µ

µ

µ

µ

+

+

⋅

=

gdzie µ

A, B, R

– ruchliwości jonów A

-

, B

-

i przeciwjonu Q

+













⋅

s

V

cm

2

, c

A, B

– stężenia jonów A

-

, B

-

.

Trzecia część rysunku (c) obrazuje dalszy stan rozdzielenia. Strefa „czystego” składnika A

znacznie się zwiększa i dalej powstaje strefa czystego składnika B o stężeniu odpowiadającym
poprzedzającej strefie.

W ostatnim etapie rozdzielania (d) ustala się stan równowagi stężeń jonów w poszczególnych

strefach. W ten sposób każdą strefę wewnątrz kapilary tworzy jeden rodzaj jonów, a stężenia w strefach
pozostają w równowadze zarówno ze strefą poprzedzającą jak i ze strefą elektrolitu wiodącego. Stężenie
w strefie elektrolitu terminującego również powinno być stałe. W idealnych warunkach prowadzenia
pomiaru (niezmienna średnica kapilary, stały poziom elektrolitu wiodącego) długości poszczególnych
stref są już dalej niezmienne. Strefy po osiągnięciu równowagi poruszają się ze stałą szybkością równą
szybkości poruszania się strefy wiodącej i stąd nazwa izotachoforeza, czyli elektroforeza przy stałym
poruszaniu się stref.

Rys. 1. Hipotetyczny model rozdzielania dwóch jonów metod

ą

izotachoforezy.

W praktyce opisany proces bywa zakłócany.

Dochodzi bowiem do przesuwania się stref, z dość
zdawałoby się błahych powodów, np. zmian pH
wskutek reakcji elektrodowych czy membranowych,
zmian temperatury, przenikania CO

2

przez teflonowe

ścianki

kapilary,

elektroosmozy

czy

wskutek

powstawania strumienia hydrodynamicznego.

Ze względu na to, że wszystkie strefy

posiadają różne efektywne ruchliwości jonów, w

każdej z nich wytwarza się własny gradient potencjału, który ustala jednakową szybkość poruszania się
stref zgodnie z zależnością

E

⋅

=

µ

ν

gdzie: ν – szybkość poruszania się strefy













s

cm

, –

efektywna ruchliwość jonów w strefie













⋅

s

V

cm

2

, E –

natężenie pola elektrycznego w strefie













cm

V

.

Rys.2. Model rozdzielania anionów (A, B, C,) metod

ą

izotachoforezy, temperatura (T), nat

ę

ż

enie pola

elektrycznego (E) i opór w poszczególnych strefach (R),
Q – przeciwjon.

Gradient potencjału w każdej pojedynczej strefie jest stały, ale wzrasta od jednej strefy do

drugiej. Przyrost gradientu potencjału wynika ze zmniejszających się ruchliwości jonów w kolejnych
strefach, zmniejszania się przewodnictwa tych stref (wzrostu oporu) oraz ze zmiany stężenia danego jonu
w rozpatrywanej strefie (rys. 2). Granice wytworzonych stref są niezwykle ostre, a to z powodu efektu
samokorygowania się układu izotachoforetycznego (rys. 3). Jeżeli wolniejszy jon A

przeniknąłby do

szybszej strefy L (tzn. o wyższej ruchliwości jonów) musiałby się w niej poruszać wolniej, gdyż w strefie
tej spadek potencjału jest niższy niż w strefie A, więc ruchliwość jonu A musiałaby być wyższa niż jest
faktycznie – i w tej sytuacji jon A automatycznie wraca do swojej strefy. Z drugiej strony, jeżeli jon L
dostałby się drogą dyfuzji do następującej po niej strefy A, byłby on przeniesiony do strefy L na skutek
wyższego gradientu potencjału, jaki panuje w strefie A

.

Gdy w procesie analizy utrzymywany jest stały prąd, w wyniku istnienia różnych gradientów

potencjału poszczególnych stref, wytwarzają się w nich różne temperatury. Strefy posiadające jony o
wysokich ruchliwościach wytwarzają mniejsze ilości ciepła niż strefy o ruchliwościach niższych.
Ponieważ następujące po sobie strefy porządkują się z ich zmniejszającymi się ruchliwościami,
temperatura następujących po sobie stref wzrasta od jednej do drugiej strefy (rys. 3).

Rys. 3. Efekt samokorygowania si

ę

układu

izotachoforetycznego.

Detekcja

W technice izotachoforetycznej stosować

można

zarówno

detekcję

bezkontaktową

i

kontaktową. Rysunek 4 przedstawia schematy
detektorów stosowanych w izotachoforezie.

Rys. 4. Detektory stosowane w izotachoforezie.

Dobór parametrów pracy

W procesie analizy izotachoforetycznej jony można rozdzielić wtedy, gdy efektywne ruchliwości

kolejnych składników różnią się od siebie w wystarczający sposób. Efektywna ruchliwość jonów zależy
od stopnia dysocjacji i wartości pK, a dodatkowo od temperatury i wartości pH, jakie wytwarzają się w
poszczególnych strefach podczas przebiegu procesu. Na efektywną ruchliwość jonów wpływają, choć w

znacznie mniejszym stopniu takie czynniki jak solwatacja, efekt relaksacji, promień i ładunek jonów,
stała dielektryczna oraz lepkość użytych rozpuszczalników. Rozdzielanie jonów można przeprowadzić
różnymi sposobami.:

-

na zasadzie różnic w absolutnych ruchliwościach jonowych, wartość pH układu dobiera się tak,
aby wszystkie jony były całkowicie zdysocjowane.

-

wykorzystując różnice w wartościach pK składników, wartość pH układu dobiera się w taki
sposób, aby większość jonów nie była całkowicie zdysocjowana, a tym samym powiększa się
różnice w wartościach efektywnych ruchliwości jonów.

-

stosując zmianę rozpuszczalnika, zwykle z wody na metanol. Sposób ten bywa stosowany, jeżeli
rozdzielane jony posiadają prawie jednakowe ruchliwości jonowe i niewiele różniące się od
siebie wartości pK

-

wykorzystując możliwość tworzenia przez rozdzielane jony związków kompleksowych z jonami
elektrolitu wiodącego.

Przykładowe elektrolity stosowane do rozdzielania kationów:

Jon wiodący

Przeciwjon

pH

Jon zatrzymujący

0,010 M HNO

3

-

1,9

0,01 M TRIS

0,010 M HCl

-

2,0

0,01 M LiCl

0,010 M k. sulfonowy

HCl

2,4

0,01 M LiCl

0,010 M KOH

k. askorbinowy

4,1

0,01 M LiCl

0,005 – 0,010 M

CH

3

COOK

k. octowy

4,0 – 5,5

0,01 M TRIS lub β- alanina

0,005 – 0,01 M KOH

k. kakodylowy

6,3 – 7,0

0,01 M kreatinina z dodatkiem 0,005 M HCl

do pH 5

0,01 M KOH

dijodotyrozyna

7,4

0,01 M TRIS

0,005 M Ba(OH)

2

glutamina

9,25

0,02 M trietylenodiamina

0,005 M Ba(OH)

2

0,015 M walina

9,9

0,02 M TRIS z dodatkiem HCl do pH 8,3

Przykładowe elektrolity stosowane do rozdzielania anionów:

Jon wiodący

Przeciwjon

pH

Jon zatrzymujący

0,005 M HCl

0,001 M NaCl

2,25

0,005 M k. bursztynowy lub 0,01 M k.

mrówkowy

0,007 M HCl

gliceryno-glicyna

2,9

0,005 M k. kapronowy

0,005 – 0,010 M HCl

β- alanina

3,0 – 4,2

0,01 M k. kapronowy

0,010 M HCl

histydyna

5,7 – 7,0

0,01 M k. kakodylowy lub k. kapronowy lub k.

fenylooctowy lub MES

0,010 M HCl

imidazol

7,4

0,005 k. askorbinowy

0,005 M gliceryno-glicyna

TRIS

8,4

0,01 M glicyna, Ba(OH)

2

, pH 9

0,010 M HCl

TRIS

8,50

0,01 M EPPS z TRIS, pH 8,5

0,005 – 0,010 M HCl

ammediol

8,4 – 9,6

0,005 – 0,010 M glicyna lub fenol lub β-

alanina

Analiza jako

ś

ciowa i ilo

ś

ciowa

Wynikiem analizy izotachoforetycznej jest wykres przedstawiający zmiany wartości sygnału

detektora w czasie – izotachoforegram. Rysunek 5 przedstawia przykładowy izotachoforegram
mieszaniny kationów uzyskany przy pomocy detektora konduktometrycznego.

Aby dokonać analizy jakościowej nieznanej próbki na podstawie uzyskanego izotachoforegramu

należy zidentyfikować poszczególne strefy odpowiadające szukanym analitom. Na podstawie wysokości

(h) stref w stosunku do linii podstawowej (RSH – relative step height, RSH = h/H) i przez porównanie z
wzorcami analitów możliwe jest przeprowadzenie analizy jakościowej.

W oparciu o długość (L) zidentyfikowanych stref i

na

podstawie

wcześniej

sporządzonych

krzywych

kalibracyjnych

możemy

dokonać

analizy

ilościowej

badanych związków w próbce.

Ogólnie mówiąc wartość sygnału detektora dla danej

strefy (wysokość strefy - h) jest informacją jakościową, a
długość strefy (L) jest informacją ilościową.

Rys. 5. Przykładowy izotachoforegram mieszaniny kationów,
uzyskany za pomoc

ą

detektora konduktometrycznego.

Aparatura

1.

Zbiornik elektrolitu zatrzymującego (TE);

2.

Blok nastrzykowy, A, B, C pozycje
robocze pętli dozowniczej, w pozycji C
możliwy jest nastrzyk mikrostrzykawką;

3.

Kolumna wstępnego rozdzielania (160
mm

×

800

µ

m śr. wew.);

4.

Detektor koduktometryczny;

5.

Blok rozgałęziający;

6.

Blok zatrzymujący;

7.

Membrana półprzepuszczalna;

8.

Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE);

9.

Kolumna analityczna (160 mm

×

300

µ

m

śr. wew.);

10.

Detektor konduktometryczny

11.

Detektor UV;

12.

Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE);

13.

Membrana półprzepuszczalna;

LE/CE zasobniki z elektrolitem wiodącym dla

kolumny wstępnego rozdzielania i
analitycznej.

Rys. 6. Schemat izotachoforegrafu model ItaChrom EA 101.

Obsługa aparatu

Przygotowanie aparatu do pracy:

1.

Zmontować układ analityczny wg schematu na rys. 6

2.

Podłączyć przewody wysokiego napięcia

3.

Podłączyć detektory konduktometryczne

4.

Połączyć światłowodami detektor spektrofotometryczny z celką pomiarową

5.

Sprawdzić poprawność połączeń

6.

Przepłukać układ wodą dejonizowaną

7.

Ustawić zawór nastrzykowy w pozycję A

8.

Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 2 i kolumnę analityczną

9.

Napełnić elektrolitem wiodącym zbiornik CE 1, blok buforujący i kolumnę wstępnego
rozdzielania

10.

Napełnić zbiornik elektrolitu zatrzymującego

11.

Usunąć z układu pęcherzyki powietrza

12.

Włączyć aparat

13.

Uruchomić program komputerowy sterujący aparatem

14.

Wprowadzić odpowiednią metodę analityczną

Po wykonaniu wyżej wymienionych czynności aparat jest gotowy do pracy.

Przeprowadzanie analiz

1.

Sprawdzić poprawność przygotowania aparatu do pracy

2.

Analizowaną próbkę umieścić w strzykawce

3.

Wsunąć strzykawkę do dozownika, gdy zawór dozujący znajduję się w pozycji A

4.

Przekręcić zawór w pozycję C

5.

Zamknąć przezroczystą pokrywę aparatu

6.

Uruchomić analizę w programie komputerowym

7.

Do zakończenia analizy nie otwierać drzwiczek aparatu

8.

Po zakończeniu analizy przekręcić zawór dozujący w pozycję B na 1 s. i dalej w pozycję A

9.

Przepłukać i napełnić kolumny elektrolitem wiodącym zaczynając od kolumny analitycznej
(dolnej)

Aparat jest gotowy do kolejnej analizy.

Ć

wiczenie

Izotachoforetyczne oznaczanie anionów w wodach pitnych i powierzchniowych
Opis wykonania ćwiczenia:

1.

Zapoznać się z budową i zasadą działania aparatu do izotachoforezy

2.

Przygotować aparat do analizy uwzględniając uwagi prowadzącego zajęcia

3.

Wykonać pomiary dla roztworów wzorcowych poszczególnych anionów

4.

Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem jakościowym

5.

Przygotować roztwory kalibracyjne

6.

Wykonać pomiary dla roztworów kalibracyjnych

7.

Zanalizować uzyskane izotachoforegramy pod kątem ilościowym i jakościowym.

8.

Sporządzić krzywe wzorcowe

9.

Wykonać analizę próbek rzeczywistych

10.

Określić zawartość poszczególnych jonów w próbkach rzeczywistych, wyciągnąć
wnioski z uzyskanych izotachoforegramów

Literatura
1.

S.-G. Hjalmarsson, A. Baldesten, A critical review of capillary isotachophoresis, Anal. Chem., July 1981, 261
352.

2.

I. Miedziak, A. Waksmundzki, Izotachoforeza, aparatura, zasada pomiaru i zastosowanie, Wiad. Chem., 2 (368)
1978, 71-92.

3.

STN 75 747430, Kvalita vody. Izotachoforeticke stanovenie chloridov, dusicanov, siranov, dusitanov, fluoridov a
fosforecanov vo vodach

4.

STN 75 7431, Kvalita vody. Izotachoforetickie stanovenie amoniaku, sodika, draslika, vaonika a horicika vo
vodach

5.

Noty aplikacyjne Villa Labeco

6.

M. Hutta, D. Kaniansky, E. Śimunićova, V. Zelenska, V. Madajova, A. Śiśkova, Solid phase extraction for sample
preparation i trace analysis of ionogenic compounds by capillary isotachophoresis, J. Radioanal. and Nuclear
Chemistry, 163 (1992) 1, 87-98

7.

F. M. Everaerts, J. l. Beckers, T. P. E. M. Verheggen, Isotahophoresis. Theory, Instrumentation and Applications,
J. Chrom. Library, Vol.6, 1976

8.

P. Boćek, M. Deml, P. Gebauer, V. Dolnik, Analytical Isotachophoresis, VCH 1988

9.

http://www.pg.gda.pl/chem/Dydaktyka/Analityczna/

→

Techniki elektromigracyjne

Notatki własne

Wszelkie prawa zastrze

ż

one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie cało

ś

ci lub fragmentów

niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo

ż

e by

ć

powielany ani rozpowszechniany

za pomoc

ą

urz

ą

dze

ń

elektronicznych, mechanicznych, kopiuj

ą

cych, nagrywaj

ą

cych i innych bez

pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jak

ą

kolwiek metod

ą

powoduje

naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.