1
ELEKTROFOREZA
Jest techniką analityczną, rzadko preparatywną, uŜywana przede wszystkim do wizualizacji
produktów PCR. Polega na rozdzielaniu mieszaniny związków chemicznych, najczęściej białek
lub DNA, na moŜliwie jednorodne frakcje poprzez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek
w polu elektrycznym wykorzystując ujemny ładunek tych cząsteczek (wędrówka do ANODY).
Elektoforezę moŜna przeprowadzić w warunkach denaturujących (Ŝele poliakrylamidowe,
el. pionowa), w których wyŜsze struktury zostają zniszczone, lub nie-denaturujących (Ŝele
agarozowe, el. pozioma), które nie niszczą tych struktur. Innym wariantem jest elektroforeza
kapilarna, w której wykorzystuje się rozdział substancji w bardzo cienkich rurkach o średnicy
20-150µm i długości do 100cm. Efekt rozdziału analizujemy wykorzystując odczyty czułego
detektora umieszczonego na końcu rurki w okolicy anody.
Ryc. 1 Schemat elektroforezy w Ŝelu poliakrylamidowym.
Ryc. 2. Schemat elektroforezy w Ŝelu agarozowym.
2
Ryc. 3. Schemat elektroforezy kapilarnej.
Agaroza (pochodna agaru) – polisacharyd o temp. topnienia 80
o
C. W postaci handlowej
zwykle ma postać białego proszku. Po zastygnięciu tworzy strukturę działającą jak „sito
molekularne” (ang. molecular sieve); małe i zwarte struktury przemieszczają się szybciej niŜ
większe, bardziej rozgałęzione. StęŜenie agarozy dobierane jest do długości rozdzielanych
cząsteczek DNA:
Migracja cząsteczek w Ŝelu zaleŜy od wielu czynników:
•
WyŜsze stęŜenie agarozy w Ŝelu (gęstsze usieciowienie) – spowolnienie migracji.
•
DuŜe cząsteczki – wolna migracja („superzwinięte” (ang. supercoiled) i koliste
cząsteczki DNA migrują w innym tempie niŜ formy liniowe DNA; jednoniciowe DNA
i RNA migrują w podobnym tempie, szybciej niŜ dwuniciowe DNA o tej samej
długości).
•
Mały prąd – spowolnienie migracji (przy niskich napięciach migracja jest liniowo
proporcjonalna do przyłoŜonego napięcia; Migracja jest odwrotnie proporcjonalna do
logarytmu długości rozdzielanego fragmentu).
•
Dodanie związku interkalującego do DNA – spowolnienie tempa migracji DNA
o ok. 15%.
•
Bufor - przewodnik prądu elektrycznego; nie moŜe niekorzystnie wpływać na kwasy
nukleinowe; zwykle zawiera EDTA, związek zapobiegający uaktywnieniu się nukleaz.
3
•
Stałe napięcie lub natęŜenie (najczęstsze napięcie: 20 – 150 V). Przy wyŜszym
napięciu, fragmenty dłuŜsze zaczną migrować proporcjonalnie szybciej niŜ krótsze.
WyŜsze napięcie jest ograniczone ze względu na zwiększone wydzielanie ciepła, co
niekorzystnie wpływa na jakość rozdziału DNA.
Wizualizacja prąŜków na Ŝelu odbywa się w świetle UV przy udziale barwnika fluoryzującego:
bromku etydyny (EtBr) – interkaluje pomiędzy sąsiednie pary zasad w dwuniciowym
DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze); ma silne
właściwości mutagenne i kancerogenne !!!
SYBR/MIDORI Green - 25- krotnie wyŜsza czułość barwienia dwuniciowego DNA
w stosunku do EtBr. Nietoksyczny.
Po wzbudzeniu światłem nadfioletowym barwnik intensywnie fluoryzuje, emitując światło
o fioletowym / zielonkawym / pomarańczowym zabarwieniu. UmoŜliwia to wykrywanie
bezpośrednio w Ŝelu w świetle lampy UV nawet kilkudziesięciu ng DNA.
MARKERY MASY MOLEKULARNEJ (drabinki) słuŜą określaniu wielkości cząstki DNA/RNA/białka
rozdzielanej na Ŝelu. Są to preparaty zawierające fragmenty cząsteczek (białek, RNA lub
DNA) o znanych wielkościach. Stosuje się róŜne markery w zaleŜności od gęstości Ŝelu oraz
wielkości poszukiwanej cząsteczki (pz).
BARWNIK OBCIĄśAJĄCY PRÓBKI – dodawany do produktu PCR, zwykle w proporcji 1:3,
ułatwia obserwację migracji próby w Ŝelu oraz uniemoŜliwia wypływanie próbek ze
studzienek.
Problemy mogące wystąpić podczas elektroforezy Ŝelowej:
1. Nanoszony roztwór DNA wycieka ze studzienki
•
DNA jest zanieczyszczone etanolem lub olejem mineralnym albo Ŝel nie jest
kompletnie zatopiony w buforze. UŜyć więcej barwnika obciąŜającego, albo
przygotować barwnik obciąŜający z TAE zamiast wody.
•
Zapomniano o obciąŜniku lub nie dodano go w ogóle. Dodać obciąŜnik.
2. Widoczne bardzo słabe lub niewidoczne prąŜki DNA w Ŝelu
•
Niewystarczająca ilość albo stęŜenie DNA nałoŜonego na Ŝel. Zwiększyć zawartość
DNA, ale pamiętać, aby nie przekraczać 50 ng DNA na ścieŜkę.
•
DNA zdegradowało. MoŜliwa kontaminacja nukleazami.
•
DNA „uciekło” z Ŝelu; przeprowadzić elektroforezę przez krótszy okres czasu,
zastosować niŜsze napięcie, albo uŜyć wyŜsze stęŜenie Ŝelu.
•
UŜyć światła UV o krótszej długości fali (254 nm), aby znacznie zwiększyć czułość.
•
Jeśli chcemy izolować DNA z Ŝelu do dalszych analiz (ligacja) zastosować światło UV
o długości 312 nm (zminimalizowanie degradacji DNA).
4
3. Widoczne rozmazane prąŜki DNA
•
DNA zdegradowało. MoŜliwa kontaminacja nukleazami.
•
NałoŜono za duŜo DNA na Ŝel. Zmniejszyć ilość DNA.
•
Udoskonalić warunki elektroforezy; nie przykładać napięcia powyŜej 20 V/cm
•
W czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniŜej 30ºC.
•
Skontrolować pojemność buforową (sprawdzić pH buforu przy anodzie i katodzie).
•
Zanieczyszczenie DNA białkiem. Zastosować ekstrakcje fenolem, przed elektroforezą,
w celu usunięcia nadmiaru białka.
4. Nieprawidłowa migracja prąŜków
•
Udoskonalić warunki elektroforezy; nie przykładać napięcia powyŜej 20 V/cm
•
W czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniŜej 30ºC.
•
Skontrolować pojemność buforową (sprawdzić pH buforu przy anodzie i katodzie).
•
DNA zdenaturowało.
Ryc. 4. Przykładowy Ŝel z opisem (DNA z kleszczy, PCR ze starterami na Borrelia burgdorferi
sensu lato). Widoczne ślady po za duŜej ilości dodanych starterów.
dorosłe
kleszcze
nimfy
kleszczy
kontrola pozytywna
marker masy
molekularnej
kontrola negatywna
próby Borrelia dodatnie