1

DNAPointer® System

INSTRUKCJA OBSŁUGI

Numer katalogowy

105-100

BioVectis

2

Produkt DNAPointer® System przeznaczony do wykorzystania wyłącznie do celów

badawczych

Wszystkie znaki towarowe są wyłączną własnością ich przedstawiciela

Producent

BioVectis

ul. Pawińskiego 5 A blok D

02-106 Warszawa,

Poland

Tel. [phone]

Fax [phone]

e-mail:

[e-mail]

Zamówienia:

Tel. [phone]

Fax [phone]

e-mail:

[e-mail]

DNA Pointer® System

Rok budowy: 2010

Należy zachować oryginalne opakowanie do momentu zakończenia okresu gwarancji.

OSTRZEŻENIE

Urządzenie może być źródłem potencjalnie śmiertelnego napięcia i może być

obsługiwane tylko przez wykwalifikowany technicznie personel.

Proszę dokładnie przeczytać całą instrukcję obsługi przed uruchomieniem

urządzenia.

Urządzenie DNA Pointer jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii Europejskiej:

73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa

89/336/EEC Dyrektywa EMC

3

Metoda MSSCP (z ang. Multitemperature Single Strand Conformation
Polymorphism)

To End-User License Agreement (EULA)

Ograniczona umowa licencyjna dla zastosowań wyłącznie badawczych

End-User License Agreement (EULA) jest umową prawną między użytkownikiem/klientem i

właścicielem metody MSSCP (z ang. Multitemperature Single Strand Conformation

Polymorphism) oraz producentem DNAPointer® System firmą Krzysztof Kucharczyk Techniki

Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis).

Metodę MSSCP można używać tylko w systemie DNAPointer® System i tylko w celach

badawczych. Wszelkie komercyjne wykorzystanie metody wymaga dodatkowej umowy

licencyjnej pomiędzy Biovectis i użytkownikiem systemu.

Metoda w ramach procedury PCT (PCT/PL/01/00012) jest chroniona przez międzynarodowe

i krajowe prawa i traktaty. Metoda jest licencjonowana i nie podlega sprzedaży.

1. Przyznanie licencji. Niniejsza Umowa Licencyjna przyznaje Ci prawo do stosowania

metody MSSCP w badaniach naukowych tylko w jednej jednostce DNAPointer®

System.

2. Opis innych praw i ograniczeń. Metoda nie może być używana na innym urządzeniu

niż DNAPointer® System. Metoda jest licencjonowana z DNAPointer® System jako

jego integralna część. Na podstawie licencji użytkownika nie wolno wynajmować lub

dzierżawić metody MSSCP. Można przenieść na stałe wszystkie swoje prawa

wynikające z niniejszej Umowy Licencyjnej tylko jako sprzedaż lub przeniesienie

systemu, pod warunkiem, że zaprzestanie się używania metody MSSCP na

jakimkolwiek innym sprzęcie. Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o.

o. (Biovectis) może wypowiedzieć niniejszą Umową Licencyjną, jeśli postępowanie

użytkownika nie jest zgodne z warunkami niniejszej Umowy Licencyjnej. W takim

przypadku należy zwrócić właścicielowi metody wszystkie materiały i dokumentację

metody MSSCP.

3. Prawa autorskie. Wszystkie prawa własności oraz prawa autorskie do metody (w

tym, ale nie wyłącznie, zdjęcia lub teksty włączone do materiałów), załączone

4

materiały drukowane są własnością Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne

Sp.z o.o.(Biovectis).

4. Pomoc techniczna. Pomoc techniczną dla produktu, metody i systemu zapewnia

firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o. o.(Biovectis) lub jej

pełnomocnik. Jeśli mają Państwo jakiekolwiek pytania dotyczące niniejszej Umowy,

lub też potrzebują skontaktować się z Krzysztof Kucharczyk Techniki

Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis), proszę zapoznać się z danymi

teleadresowymi zawartymi w instrukcji użytkownika.

5

DNAPointer® System

GWARANCJA

Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o. o. (Biovectis) gwarantuje, że

dostarczony Państwu aparat DNAPointer® System został przetestowany i spełnia wszystkie

warunki specyfikacji. Niniejsza gwarancja jest ważna przez 12 miesięcy tylko wtedy, gdy

produkt i funkcje zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi.

Producent nie bierze odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z

nieprawidłowego korzystania z aparatu DNAPointer® System. Odpowiedzialność producenta

jest ograniczona do naprawy, wymiany urządzenia lub zwrotu kosztów zakupu. Krzysztof

Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. (Biovectis) zastrzega sobie prawo do zmiany

specyfikacji systemu bez wcześniejszego powiadomienia.

Proszę uważnie przeczytać w instrukcji obsługi przed rozpoczęciem korzystania z

systemu DNA Pointer® System.

POINTER DNA powinny być używane tylko przez osoby odpowiednio wykwalifikowane i

przeszkolone. Jeśli system DNA Pointer® System nie jest używany w sposób określony w

niniejszej instrukcji, ochrona niniejszej gwarancji może być naruszona.

6

Rozdział 1. Informacje podstawowe

1.1. Wprowadzenie

Urządzenie DNA Pointer® System jest narzędziem skutecznej analizy zmienności

genetycznej. System jest otwartą platformą dla kilku metod genetycznych w oparciu o

elektroforetyczne rozdzielanie kwasów nukleinowych:

• Single Temperature - SSCP

• MultiTemperature - MSSCP

• Gradient Temperature – Gradient temperatury w czasie

• Custom – dowolne połączenie powyższych metod

DNAPointer System jest szczególnie skuteczny w wykrywaniu mutacji punktowych w

analizowanych produktach PCR za pomocą wielotemperaturowego SSCP (MSSCP).

DNAPointer® System jest szczególnie przydatny przy analizie niejednorodnego materiału lub

analizie wysoce zmiennych regionów DNA. Analiza MSSCP pozwala na wykrycie

mniejszościowych wariantów genetycznych w różnorodnym materiale jak również pozwala

na wykrycie nowych mutacji punktowych.

Zalety Systemu DNA Pointer:

System DNA Pointer jest wyposażony w unikalny algorytm kontroli temperatury badanej

próbki, który gwarantuje:

• wysoki współczynnik wykrywania mutacji i SNP na poziomie 90-95%,

• wysoką powtarzalność wyników

• krótki czas analizy

DNA Pointer® System wyposażony jest w intuicyjne oprogramowanie sterujące procesem

elektroforezy.

Zastosowanie wymienionych powyżej metod w systemie DNA Pointer® System jest

szczególnie skuteczne, gdy do analiz używane są dedykowane i zoptymalizowane zestawy

chemiczne.

7

Rysunek 1.

DNA Pointer® System.

DNA Pointer® System składa się z dwóch podstawowych modułów:

1. DNA Pointer® System – jednostka główna (zawierająca wbudowany zasilacz

wysokonapięciowy)

2. Komputer PC Notebook z dedykowanym oprogramowaniem sterującym

1.2. Metoda MSSCP

DNA Pointer® System połączony z metodą MSSCP jest wyjątkowo skutecznym narzędziem

gwarantującym:

• Wyższy współczynnik wykrywania mutacji niż przy wykorzystaniu klasycznej metody SSCP.

Współczynnik wykrywania dla metody MSSCP wynosi 90-95% w porównaniu z 85-90% przy

SSCP.

• Krótki czas analizy

• Znacząca redukcja kosztów genotypowania (stosując elektroforezę natywną w żelach

poliakrylamidowych: nie ma potrzeby oznaczania fragmentów PCR, nie ma potrzeby

powtarzania elektroforez SSCP w różnych warunkach temperaturowych)

• Wysoką powtarzalność wyników dzięki wykorzystaniu modułu MULTIPOL do równoległego

wylewania do 8 żeli

8

• Równoczesną analizę i oczyszczanie próbki do dalszego wykorzystania np.

sekwencjonowania –(próbki DNA mogą być odzyskane z ssDNA uzyskanych po elektroforezie

w celu późniejszej analizy).

Rysunek 2.
Porównanie wyników za pomocą genotypu SSCP i MSSCP metody siedmiu wariantów eksonu
7 ludzkiego genu PAH. Siedem różnych wariantów eksonu 7 ludzkiego genu PAH było
multiplikowanych w reakcji PCR. Produkty amplifikacji zostały zdenaturowane (94



C, 5 min.)

i schłodzone na lodzie, a następnie nałożone na natywny żel PA w buforze TBE. Po
elektroforezie (około 60 minut) fragmenty ssDNA zabarwiono stosując barwienie srebrem
(Silver Stain kit) w czasie 40 minut. (A-C) Wyniki analizy SSCP próbek w różnych
temperaturach żelu: (A) 34



C, (B) 22



C, (C) 10



C. (D). Wyniki analizy MSSCP w zakresie

temperatur 34



/22



/10



C.

1.3. Specyfikacja

Tabela 1. DNAPointer System - dane techniczne

Parametr

Wartość

Rozmiar żelu

2 40 mm x 180 mm

9

Zakres kontroli temperatury

2°C do 65°C

Dokładność pomiaru temperatury

- 0.2°C w pełnej skali

Maksymalne napięcie elektroforetyczne

3000 VDC

Maksymalna moc elektroforezy

50 W

Maksymalny prąd elektroforezy

300 mA

Dokładność kontroli parametrów elektrycznych ± 1,5%

Upływność prądu powodująca odcięcie napięcia

elektroforetycznego

500



A

Zasilanie

220-240 VAC,

50-60 Hz, 600 W

Waga netto

26 kg

Wymiary (wxhxd ) mm

502 x 504 x 570 mm

UWAGA! Aparat ten jest przeznaczony tylko do użytku wewnętrznego.

Tabela 2. Warunki środowiskowe

Parametr

Wartość

Zakres temperatury otoczenia

4°C - 35°C.

Maksymalna wilgotność względna 80% w zakresie 4°C - 25°C

1.4. Zasady bezpieczeństwa

UWAGA!

• Urządzenie jest zdolne do wytworzenia potencjalnie śmiertelnego napięcia i może być

obsługiwane tylko przez wykwalifikowany personel.

• Przeczytaj całą instrukcję operacji przed użyciem.

• Podczas elektroforezy pokrywa komory elektroforetycznej ze względów bezpieczeństwa

powinna być zawsze zamknięta.

• Należy napełniać zbiorniki na bufor elektroforetyczny tylko do wyznaczonego poziomu

maksymalnego.

• Nie należy przenosić urządzenia, gdy jest uruchomione.

10

• Podczas elektroforezy bardzo niewielkie ilości różnych gazów są wytwarzane na

elektrodach w wyniku elektrolizy. Rodzaj gazu zależy od składu wykorzystanego buforu.

Urządzenie używać w sprawnie wentylowanym pomieszczeniu.

1.5. Informacje o zamawianiu

DNAPointer System

numer katalogowy 105-100

11

Rozdział 2. Opis głównych elementów systemu

2.1. Jednostka główna

DNAPointer ® System jest zaawansowanym, łatwym w użyciu systemem elektroforetycznym

o unikalnej zdolności do kontroli temperatury próbki z dokładnością do 0,2°C. W skład

systemu wchodzą: zintegrowany aparat do elektroforezy składający się z komory

elektroforetycznej wyposażonej w moduł wymiany ciepła oraz komputer z dedykowanym

oprogramowaniem. Temperatura w żelu jest kontrolowana podczas elektroforezy z

dokładnością do 0,2



C, poprzez kontakt zestawu szyb i żelu z blokiem wymiennika ciepła.

Podczas elektroforezy temperatura może być utrzymywana na stałym poziomie (SSCP), lub

zmieniać się liniowo (Gradient temperatury) lub zmieniać się krokowo (MSSCP). Precyzyjna

regulacja temperatury pozwala wykonywać powtarzalne elektroforezy i skuteczne wykrywać

mutacje. Całkowity czas elektroforezy w DNA Pointer® System zależy od aplikacji.

Rysunek 3.
DNA Pointer® System

12

2.2. Moduł wymiany ciepła

Moduł wymiennika ciepła pozwala na prowadzenie elektroforez w warunkach dużej mocy

(40-50 W) przy zadanej temperaturze. Zastosowanie wysoce wydajnych termomodułów

zapewnia doskonałą stabilizację temperatury próbek w żelu lub dynamiczną jej zmianę.

Moduł wymiany ciepła stabilizuje temperaturę żelu podczas elektroforezy w zakresie od 4°C

do 65°C z dokładnością 0,2°C.

2.3. Zasilacz wysokonapięciowy

Zasilacz wysokonapięciowy jest zintegrowany z systemem DNAPointer. Zapewnia do 50 W

mocy podczas elektroforezy. Zasilacz jest zaprogramowany i sterowany oprogramowaniem

DNAPointer.

2.4. Jednostka sterująca - Komputer PC

Jednostką sterującą jest komputer PC z systemem MS Windows, który dzięki

zainstalowanemu oprogramowaniu prowadzi elektroforezę oraz kontroluje wszystkie jej

warunki. Parametry elektroforezy projektowane są poprzez łatwy w obsłudze interfejs.

Profile elektroforezy można zapisywać i korzystać z nich przy kolejnych elektroforezach.

2.5. Oprogramowanie DNA Pointer® System software

Algorytm wprowadzony do oprogramowania pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury

Algorytm oparty na modelu rozpraszania ciepła pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury

próbki wewnątrz żelu, niezależnie od mocy zastosowanej w elektroforezie.

2.6. DNA Pointer® System Multipol – moduł równoległego wylewania żeli

DNA Pointer® System Multipol pozwala na jednoczesne przygotowanie do ośmiu

identycznych poliakrylamidowych żeli. Żele poliakrylamidowe powinny być przygotowane co

najmniej 18 godziny przed elektroforezą. Stosowanie tej zasady zapewnia wiarygodność

wyników i wysokie tempo wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu we

fragmentach DNA . Żele odpowiednio zabezpieczone przed wyschnięciem mogą być

przechowywane w Multipolu w temperaturze +4°C przez 1 do 2 tygodni. Aby zapobiec

13

wysuszeniu żeli należy Moduł Multipol szczelnie zamknąć, wlewając uprzednio do pudełka

kilka mililitrów buforu TBE.

DNA Pointer® System MULTIPOL zawiera:

1. Główne pudełko z ruchoma ścianką przednią

1 szt.

2. Śruby dokręcające

8 szt.

3. Arkusze folii

9 szt.

4. Pokrywę

1 szt.

5. Rurkę ze strzykawką

1 szt.

6. Zaworek

1 szt.

7. Uchwyt do podtrzymania korpusu strzykawki

1 szt.

Rysunek 4.
DNA Pointer® System MULTIPOL

2.7. DNA Pointer® System DryOut – moduł suszenia żeli PA

DNA Pointer® System DryOut jest to zestaw do ręcznego wygodnego i łatwego suszenia żeli.

Żele są suszone przez noc pomiędzy dwoma arkuszami folii półprzepuszczalnej pozwalającej

na odparowanie wody. Wysuszone żele są idealne do skanowania i mogą być

przechowywane przez bardzo długi okres bez utraty jakości.

14

Rysunek 5.
DNA Pointer® System DryOut

15

Rozdział 3. Rozpakowanie i instalacja

3.1. Rozpakowanie

Prosimy o zachowanie wszystkich materiałów opakowaniowych, aż do wygaśnięcia

gwarancji.

3.2. Lista elementów zestawu

Tabela 3. Lista elementów DNAPointer® System

Nr. kat.

Opis

Ilość

105-100

DNA Pointer® System jednostka główna

1 szt.

105-210

Komputer PC Notebook

1 szt.

200-101

Silver Staining Kit (15 żeli)

1 szt.

200-150

Bufor TBE 10x (pH 8,5)

1 litr

200-131

Poliakrylamidy mix 30% T, 3,3% C (29:1) + 15% glicerolu

100 ml

200-175

Ammonium Persulfate solution 10% (w/v)

5 ml

200-155

TEMED

1 ml

200-141

MSSCP

Bufor denaturujący A

5 ml

200-142

MSSCP Bufor denaturujący B

2 ml

200-145

Bufor obciążający (loading buffer) 6x

1 ml

105-111

Przekładki 0,5 mm (2 szt.)

1 zestaw

105-123

Grzebień 0,5 mm x 44 studzienki

1szt.

105-151

Zestaw szyb gr. 3 mm – szyba z nacięciem 1 szt. +

szyba pełna 1 szt. (240 x 197 mm)

1 zestaw

105-171

Stelaż do suszenia szyb

1 szt.

105-161

DNA Pointer® System Multipol

1 szt.

105-181

Pojemnik szklany do barwienia żeli PA z pokrywką (210 x 260 x 40

mm)

1 szt.

105-191

DNA Pointer® System DRYOUT + folie do suszenia (35 szt.)

1 zestaw

105-200

Oprogramowanie

DNA Pointer® System

1 szt.

16

105-195

DNA Pointer® System Instrukcja obsługi

1 szt.

3.3. Wybór miejsca pracy

Instalacji DNAPointer® System należy dokonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Nie

należy umieszczać Pointer DNA w miejsce w pobliżu elementów grzewczych. System

powinien zostać zainstalowany na płaskiej, równej powierzchni.

UWAGA!

Należy unikać zasłaniania otworów wentylacyjnych w obudowie jednostki

głównej DNA Pointer® System. Należy zapewnić możliwość swobodnej

wentylacji urządzenia.

3.4. Instalacja DNA Pointer® System

a) Ustaw DNAPointer® System jednostkę główną na równej powierzchni stołu lub blatu

roboczego.

b) Umieść w pobliżu jednostki główne komputer PC Notebook.

c) Podłącz przewód zasilający do gniazda zasilania znajdującego się na tylnej ściance

jednostki głównej DNAPointer® System. Drugi koniec kabla zasilającego podłącz do

sieci zasilającej.

d) Połącz kablem komunikacyjnym jednostkę główną DNAPointer® System (dokręć

nakrętkę przy nasadzie wtyczki portu komunikacyjnego) z komputerem PC

umieszczając wtyczkę USB w dowolnym porcie USB komputera.

e) Podłącz komputer PC za pomocą dołączonego zasilacza do sieci zasilającej.

17

Rysunek 6.
Widok z tyłu jednostki głównej DNA Pointer® System.

f) Włącz komputer PC i poczekaj, aż system operacyjny będzie gotowy do pracy.

g) Uruchom poprzez dwukrotne kliknięcie program Instacal (ikona na pulpicie

komputera) lub START/Wszystkie programy/ Measurement Computing/Instacal

(Rysunek 7).

Rysunek 7.
Ikona programu instalacyjnego Instacal.

h) Po prawidłowym podłączeniu jednostki głównej DNA Pointer® System do komputera

i uruchomieniu oprogramowania na ekranie komputera powinien pokazać się

komunikat jak na rysunku 8.

Rysunek 8.
Okno zgłoszenia jednostki głównej DNAPointer® System

i) Kliknij przycisk OK. Następnie prawym przyciskiem muszy naciśnij na zgłoszonej

karcie i wybierz Configure (Rysunek 9).

18

Rysunek 9.
Wybór okna konfiguracji.

j) Z rozwijanej listy No. Of Channels: wybierz opcję 8 Single Ended, kliknij OK i zamknij

program Instacal (Rysunek 10).

Rysunek 10.
Wybór trybu pracy „8 Sinle Ended”.

k) Uruchom oprogramowanie DNAPointer® System software.

19

UWAGA!

W celu zapewnienia prawidłowej pracy systemu zaleca się każdorazowo po

każdym uruchomieniu komputera lub po rozłączeniu kabla komunikacyjnego

ponowna instalację systemu za pomocą programu Instacal. Jeśli po

uruchomieniu programu Instacal karta komunikacyjna będzie widoczna

należy postępować wg kolejnych poniższych punktów instrukcji

l) Usuń kartę komunikacyjną poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na nazwie

karty i wybór polecenia Remove Board i zatwierdzenie OK (Rysunek 11). Następnie kliknąć

przycisk Refresh Boards (Rysunek 12) i postępować wg punktów od 8 do 11.

Rysunek 11.
Usuwanie karty komunikacyjnej.

20

Rysunek 12.
Refresh Boards.

3.5. Instalacja oprogramowania DNA Pointer® System

Oprogramowanie DNA Pointer® System software jest zainstalowane w komputerze

sterującym PC.

W przypadku potrzeby ponownej instalacji oprogramowania prosimy o kontakt z działem

technicznym firmy Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. Dane

teleadresowe zamieszczone są w rozdziale 12.

3.6. Wymagania sprzętowe.

Komputer PC:

1. Procesor 600 MHz lub szybszy (Intel, Intel Celeron, AMD)

2. Windows 2000, Windows XP, Windows Vista, Windows 7.

3. 256 MB pamięci RAM lub więcej.

4. 200 MB wolnego miejsca na dysku twardym.

5. Dodatek DotNetFX v.4

21

Rozdział 4. Metoda MSSCP

4.1. Zalecenia dla metody MSSCP

Multitemperature Single Stand Conformation Polymorphism (MSSCP) jest prostą i

niezawodną techniką elektroforezy, którą można wykorzystać do wykrywania mutacji

punktowych w kwasach nukleinowych. Najlepsze wyniki uzyskuje się analizując fragmenty

PCR o długości od 150 do 350 par zasad.

MSSCP wykorzystuje własności fizyczne kwasów nukleinowych. Pojedyncze nici kwasów

nukleinowych przyjmują charakterystyczną strukturę przestrzenną w warunkach natywnych.

Struktura ta zależy od sekwencji nukleotydów fragmentu DNA. Pojedynczy fragment nici

DNA zawierających mutację punktową przyjmie inną strukturę od typu dzikiego. Różniące się

od siebie struktury można rozdzielić za pomocą elektroforezy wykorzystując ich różną

mobilność elektroforetyczną. Technika MSSCP jest udoskonaleniem metody SSCP (Single

Strand Conformation Polymorphism), powszechnie stosowanej techniki wykrywania mutacji.

Głównymi parametrami fizycznymi wpływającymi na konformery ssDNA i na ich strukturę

przestrzenną są pH, siła jonowa i temperatura.

W wielotemperaturowym SSCP (MSSCP) separacja elektroforetyczna odbywa się w krokowo

zmienianej temperaturze. Zmiany temperatury w trakcie elektroforezy powodują zmianę

konformacji przestrzennej fragmentów ssDNA. Działanie takie zwiększa

prawdopodobieństwo, że cząsteczki ssDNA różniące się nawet jednym nukleotydem przyjmą

różne kształty w kolejnym kroku temperatury analizy MSSCP, a zatem zmienią swoją

mobilność elektroforetyczną w stosunku do poprzedniego kroku temperaturowego i ulegną

rozdzieleniu. Efekcie, wykrywalność mutacji techniką MSSCP w porównaniu do SSCP jest

znacznie wyższa. Metoda MSSCP daje wiarygodne wyniki we wszystkich eksperymentach,

gdzie znaczna liczba próbek badana jest pod kątem mutacji znanych i nieznanych. MSSCP

może być z powodzeniem stosowane w projektach exon re-sequencing

w celu ograniczenia

próbek przeznaczonych do ponownego sekwencjonowania.

Zaleca się aby podczas analizy MSSCP ilość nanoszonego DNA wynosiła 100-500 ng.

22

Referencje:

1. R. Kaczanowski, L. Trzeciak, K. Kucharczyk, Electrophoresis 2001, 22, 3539-3545.

2. Orita, M., Iwahana, H., Kanazawa, H., Hayashi K., Sekiya, T., Mat. Natl. Acad. Sci. USA

1989, 86, 2766-2770.

3. Hongyo, T., Buzard, GS, Calvert, RJ, Weghorst, CM, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 3637-

3642.

4. Murakami Y. Hayashi K., Sekiya, T., Cancer Res. 1991, 51, 3356-3361.

5. Sheffield, VC, Beck, JS, Kwitek, AE, Sandstrom, DW, Stone, EM, Genomics 1993, 16, 325-

332.

4.2. Protokół MSSCP

Protokół MSSCP zawiera sześć kroków, które są wymagane do poprawnego wykonywania

elektroforezy metodą MSSCP:

1. Amplifikacja interesującego obszaru za pomocą reakcji PCR.

2. Przygotowanie DNAPointer® System do elektroforezy

2.1. Wylanie żelu.

2.2. Zaprogramowanie profilu elektroforezy MSSCP.

2.3. Przeprowadzenie preelektroforezy.

3. Denaturacja próbek.

4. Naniesienie próbek na żel i przeprowadzenie elektroforezy.

5. Barwienie żelu.

6. Interpretacji wyników.

Wszystkie powyższe czynności są opisane w kolejnych rozdziałach instrukcji.

4.3. Amplifikacja DNA w reakcji PCR

Długość fragmentów DNA nie powinna przekraczać 150-350 par zasad. W przypadku

dłuższych fragmentów obserwujemy stały spadek efektywności wykrywania mutacji przy

użyciu metody MSSCP.

Produkty PCR wykorzystywane do analizy powinny być specyficzne. Niespecyficzne produkty

PCR tworzą dodatkowe prążki w profilu MSSCP co znacznie utrudnia interpretację wyników.

23

Rozdział 5. Przygotowanie systemu do elektroforezy

DNA Pointer® System to otwarta platforma oparta na elektroforetycznej separacji

DNA/RNA. Skład żelu elektroforetycznego uzależniony jest od zastosowanej metody.

Zalecamy stosowanie DNA Pointer® System Multipol do równoległej polimeryzacji do ośmiu

żeli, które mogą być przechowywane przez 1 do 2 tygodni w temperaturze +4°C.

Wykorzystanie modułu Multipol gwarantuje pełną polimeryzację żelu PA przed elektroforezą

oraz ich jednorodność. Przygotowanie żeli w DNA Pointer® System Multipol jest wygodne i

szybkie.

5.1. Wylewanie żeli poliakrylamidowych dla elektroforezy MSSCP

Procedura postępowania:

1. Przygotuj odpowiednią liczbę czystych, suchych zestawów szybowych – szyby należy

umyć wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu. Zaleca się przetrzeć płytki szklane 10%

roztworem EtOH przed zalaniem żelu.

2. Przygotuj roztwór akrylamidu zgodnie z dołączoną do zestawu instrukcją.

3. Odkręć śruby dociskające i zdejmij przednią ściankę w DNA Pointer® System Multipol.

4. Umieść pojemnik na płaskiej powierzchni (Rysunek 13).

Rysunek 13.
Pudełko Multipol umieszczone na płaskiej powierzchni.

5. Umieścić wewnątrz zestawy szybowe składające się z szyb, grzebieni i przekładek i

oddziel kolejne zestawy foliowymi arkuszami dystansowymi w następującej kolejności

(Rysunek 14):

24

a) Arkusz folii

b) Zestaw szybowy z grzebieniem i przekładkami

c) Arkusz folii

d) Kolejny zestaw szybowy z grzebieniem i przekładkami Itd.

Rysunek 14.
Złożenie zestawu DNA Pointer® System Multipol.

6.

Po umieszczeniu ostatniego zestawu szybowego należy umieścić ostatni arkusz folii,

nałożyć ściankę przednią i dokręcić ją za pomocą śrub dociskowych (Rysunek 15).

Rysunek 15.
Montaż ścianki

dociskowej.

7. Ustaw DNA

Pointer® System

25

Multipol w pozycji pionowej, umieść pokrywę na górnej powierzchni pojemnika i dokręć ją

śrubami (Rysunek 16).

Rysunek 16.

Montaż ścianki górnej DNA Pointer® System Multipol.

6. Podłącz rurkę ze strzykawką do króćca i napełnij pojemnik roztworem akrylamidu do

poziomu wyznaczonego przez krawędź górną włożonych szyb (Rysunek 17).

Rysunek 17.
Podłączenie rurki do króćca.

26

8. Po wstępnej polimeryzacji żelu (około 1 h) odłącz rurkę i usuń z niej pozostałości

akrylamidu. Na powierzchnię polimeryzującycego akrylamidu nalej około 5 ml buforu TBE

0,5x i zamontuj pokrywę górną. Przechowuj żele przez okres od 1 do 2 tygodni.

5.2. Instalacja żelu w komorze elektroforetycznej

Procedura postępowania:

1. Wyjąć jeden zestaw szybowy ze spolimeryzowanym żelem i przepłucz zewnętrzne

powierzchnie szklane wodą dejonizowaną w celu pozbycia się pozostałości akrylamidu.

Należy zwrócić uwagę czy do szyby nie jest przyklejony bezbarwny arkusz folii.

2. Delikatnie wyjmij grzebień, upewniając się, że studzienki nie są uszkodzone. (Grzebień

można również usunąć po zalaniu zbiorników buforem)

3. Otwórz pokrywę jednostki głównej DNA Pointer® System.

4. Przesuń przedni panel dociskowy zwalniając zatrzaski, przekręcając je ruchem skrętnym

do środka aparatu i odciągając do siebie panel (Rysunek 18).

Rysunek 18.
Otwieranie przedniego panelu komory elektroforetycznej.

5. Umieść zestaw szybowy z żelem pomiędzy panelem dociskowym i płytą termiczną w taki

sposób by wycięcie w jednej z szyb zwrócone było na zewnątrz aparatu.

6. Dociśnij przedni panel dociskowy, przekręć zatrzaski ruchem skrętnym na zewnątrz a

następnie je zatrzaśnij.

27

5.3. Napełnienie zbiorników buforowych

W celu przygotowania buforu elektroforetycznego patrz załącznik. Na jedną elektroforezę

zużywany jest bufor elektroforetyczny w objętości około 400 ml. Należy zwrócić uwagę by

napełniając zbiorniki buforowe nie przekroczyć poziomu maksymalnego zaznaczonego na

zbiorniku wyżłobioną linią.

5.4. Czyszczenie studzienek przed elektroforezą

Przed elektroforezą należy pozbyć się ze studzienek ewentualnych pozostałości żelu PA. W

tym celu należy przemyć każdą studzienkę silnym strumieniem roztworu buforu TBE

używając 1 ml pipety lub strzykawki.

5.5. Programowanie profilu elektroforezy

Szczegółowy opis zaprogramowania profilu elektroforezy w DNA Pointer® System

przedstawiony jest w załączniku. Prosimy o zapoznanie się przed uruchomieniem

elektroforezy.

5.6. Preelektroforeza

Preelektroforeza pozwala na stabilizację żelu przed elektroforezą. Podczas preelektroforezy,

która trwa około 100 Vxh w temperaturze 20°C, 30 W usuwany jest nadmiar jonów z żelu.

Pozwala to na wykonywanie bardziej powtarzalnych rozdziałów kw. nukleinowych.

5.7. Przygotowanie próbek

Próbki powinny być wymieszane z buforem denaturującym w stosunku 1:2 lub wyższym. Do

analizy powinno wyć wykorzystywane od 100 do 500 ng DNA dla każdej próbki.

Procedura postępowania:

a) Wymieszanie próbki z buforem denaturującym

b) Denaturacja termiczna w temperaturze 95°C przez 5 min

c) Przełożenie próbek na lód I dodanie 1/6 objętości buforu denaturującego B

d) Nakładanie próbek na żel

28

UWAGA!

Dla grzebienia o ilości zębów 44 maksymalna objętość próbki (z buforami) powinna wynosić

10 uL.

Dla grzebienia o ilości zębów 33 maksymalna objętość próbki (z buforami) powinna wynosić

14 uL.

5.8. Elektroforeza

Proces elektroforezy w DNA Pointer® System po nałożeniu próbek i uruchomieniu procesu

nie wymaga uwagi. Rozdział odbywa się automatycznie i trwa około 1,5-2 godzin w

zależności od długości fragmentów DNA, gęstości i rodzaju użytego poliakrylamidu i

parametrów elektrycznych elektroforezy.

5.9. Usunięcie żelu

Po zakończeniu elektroforezy zasilacz przełącza się w tryb Gel Saver. Jest to końcowy etap, w

którym utrzymywane są warunki 30V i +4°C w celu zapobieżenia dyfuzji biernej próbek w

trakcie oczekiwania na działanie użytkownika. Po przejściu w tryb Gel Saver na ekranie

pojawia się odpowiedni komunikat.

Procedura postępowania:

a) Wyłącz tryb Gel Saver odpowiednim przyciskiem

b) Wybierz opcję New Electrophoresis jeśli zamierzasz prowadzić kolejną

elektroforezę lub zakończ działanie programu.

c) Wyłącz DNA Pointer® System poprzez wyłączenie wyłącznika głównego

d) Otwórz pokrywę

e) Usuń bufor elektroforetyczny poprzez otwarcie zaworów i zlanie buforu

wężykami.

f) Zamknij zawory

g) Oczyść zbiorniki buforowe wodą destylowaną zlewając wodę tak jak bufor

elektroforetyczny.

h) Otwórz przedni panel dociskowy komory.

i) Wyjmij zestaw szybowy z żelem w środku.

j) Pozostaw pokrywę aparatu DNA Pointer® System otwartą w celu osuszenia.

29

k) Delikatnie wydobądź żel rozkładając szyby. Umieścić żel w roztworze 10%

EtOH i rozpocznij procedurę barwienia (patrz załącznik dotyczący barwienia srebrem oraz

suszenia żeli).

l) Barwienie za pomocą Silver Stain Kit.

Uwaga! Aby utrzymać wysoką jakość barwienie srebrem nie wolno dotykać powierzchni

żelu.

m) Suszenie żelu w zestawie DNA Pointer® System DryOut.

n)

Skanowanie i analiza żelu.

30

Rozdział 6. Analiza żelu

W celu archiwizacji lub dalszej obróbki obrazu żelu należy żel zarchiwizować przy użyciu

dedykowanego systemu archiwizacji żeli KTE Video (nr kat. 134-190). Dalsza obróbkę obrazu

żelu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania GelScan (nr kat. 190-100)

Rysunek 19.
Analiza MSSCP mutacji punktowych w eksonie 1 genu ludzkiego KCNE1. Produkty PCR po
denaturacji zostały rozdzielone w 9% żelu poliakrylamidowym T w temperaturze 35-15-5°C.
Po elektroforezie żel barwiono Silver Stain Kit (nr kat. 200-101), suszono i skanowano.

31

Rozdział 7. Utrzymanie

7.1. Czyszczenie

Wszystkie części plastikowe DNA Pointer® System wykonane są z PMMA. Należy je czyścić

wodą z łagodnym detergentem. Nie należy używać rozpuszczalników organicznych (etanol,

kwasy) do czyszczenia części plastikowych. Ich grozi trwałym zniszczeniem części

plastikowych.

Po każdej elektroforezie należy przepłukać górny i dolny zbiornik buforowy wodą

destylowaną w celu usunięcia resztek żelu PA oraz buforu elektroforetycznego. Po płukaniu

należy pozostawić aparat z otwartą pokrywą przednią do wyschnięcia.

W okresach 6-miesięcznych należy kontrolować poziom płynu chłodniczego. W razie

potrzeby należy go uzupełnić wodą destylowaną z dodatkiem glikolu etylenowego.

7.2. Awarie systemu

Żadna część DNA Pointer® System nie może być serwisowana przez osoby nie przeszkolone.

W razie konieczności urządzenie powinno zostać przekazane do autoryzowanego serwisu lub

do producenta.

32

Rozdział 8. Wsparcie techniczne

8.1. Dane teleadresowe - kontakty

Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o.o.

ul. Pawińskiego 5A/D

02-106 Warszawa, Polska

Tel.: [phone]

Tel.: [phone]

Fax: [phone]

Email:

[e-mail]

33

Rozdział 9. Sprzęt i akcesoria

DNA Pointer® System Akcesoria

Tabela 4. Akcesoria

Numer

katalogowy

Opis

105-161

Multipol DNA Pointer – zestaw do wylewania kilku żeli jednocześnie

105-151

Szyby DNAPointer® (szkło float)

105-171

Statyw do suszenia szyb

105-181

Pojemnik szklany przezroczysty z pokrywą

105-111

Przekładki teflonowe gr. 0,5 mm

105-112

Przekładki teflonowe gr. 1,0 mm

105-121

Grzebień teflonowy 0,5 mm/24 studzienek

105-122

Grzebień teflonowy 0,5 mm/33 studzienki

105-123

Grzebień teflonowy 0,5 mm/44 studzienki

105-124

Grzebień teflonowy 1,0 mm/24 studzienek

105-125

Grzebień teflonowy 1,0 mm/33 studzienki

105-126

Grzebień teflonowy 1,0 mm/44 studzienki

152-102

Kable połączeniowe

105-191

Dryout Zestaw do suszenia żeli

34

Rozdział 10. Procedury dodatkowe

10.1. Ekstrakcja ssDNA z żelu.

Podczas elektroforezy MSSCP konformery ssDNA są rozdzielane i mogą być ekstrahowane z

żelu a następnie używane jako matryca do sekwencjonowania metodą Sangera.

10.2. MSSCP Starter Kit

MSSCP Starter Kit jest dedykowanym zestawem odczynników chemicznych przeznaczonym

do genotypowania metodami MSSCP i SSCP. Zoptymalizowany zestaw zawiera wszystkie

materiały niezbędne do przygotowania i uruchomienia metod MSSCP i SSCP systemie DNA

Pointer® System. Zestaw zawiera roztwór akrylamidu, katalizatory polimeryzacji, bufor

elektroforetyczny TBE oraz bufory denaturujące do przygotowania próbki. Odczynniki

zapewniają wysoki współczynnik wykrywania SNP, wysoką jakość rozdziałów i ich

powtarzalność.

10.3. Przygotowanie roztworu akrylamidu do wylania żelu

Czułość MSSCP i SSCP jest uzależniona od typu żelu stosowanego do elektroforezy.

Zazwyczaj używane są żele poliakrylamidowe o stężeniu 6-10% akrylamidu i stężeniu

bisakrylamidu 1,5-5%. Glicerol w stężeniu 3-5% jest powszechnie stosowany jako dodatek do

żelu i zazwyczaj poprawia czułość wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.

Żele do techniki MSSCP przygotowywane są w buforze TBE. Zalecamy stosowanie żeli

przygotowanych z użyciem 0,75x TBE oraz buforów elektroforetycznych o stężeniu 0,5x TBE.

Zalecamy przygotowywanie żeli za pomocą zestawu DNA Pointer® System Multipol.

UWAGA! Żel poliakrylamidowy powinien być przygotowany co najmniej 18 godzin przed

elektroforezą. Rekomendujemy przygotowanie 4 lub 8 żeli w zestawie DNAPointer® System

Multipol. Zabezpieczone żele mogą być przechowywane w temperaturze+4°C przez 1 do 2

tygodni. Aby zapobiec wysuszeniu żelu należy wlać około 5 ml 1x TBE lub 0,75x TBE na górę

każdej żelu i owinąć go szczelnie folią lub pozostawić w szczelnie zamkniętym pudełku DNA

Pointer® System Multipol.

Stężenie żelu zależy od wielkości badanego fragmentu PCR. Stężenie żeli stosowanych w

35

MSSCP wynosi od 6% dla fragmentów PCR dłuższych niż 300 bp do 10% dla fragmentów

krótszych niż 150 bp.

Tabela 5. Przygotowanie 10%T, 3,3%C, 5% glicerolu w 0,75x TBE dla DNA Pointer® System

Multipol.

4 żele

8 żeli

10x TBE buffer

12 ml

24 ml

Roztwór akrylamidu

(30% T, 3,3 %C 15%

glycerol)

53,3 ml

106,6 ml

APS 10% (w/v)

1,12 ml

2,24 ml

H

2

O

93,42 ml

186,84 ml

TEMED

160



l

320 µl

10.4. Przygotowanie buforu elektroforetycznego TBE

Zalecamy stosowanie 0,5x TBE jako buforu do elektroforezy.

Aby przygotować 400 ml 0,5x TBE należy zmieszać 20 ml 10x TBE z 380 ml dejonizowanej

wody (miliQ 18,4 MOhm)

10.5. Zestaw Silver Stain Kit

Zestaw do barwienia Silver Stain Kit to zestaw odczynników chemicznych do barwienia żeli

poliakrylamidowych MSSCP. Zoptymalizowany zestaw do barwienia srebrem zapewnia

powtarzalne nieradioaktywne wykrywanie kwasów nukleinowych lub białek w żelu

poliakrylamidowym w sposób szybki, wygodny i wydajny. Zestaw wykrywa już 10 pg DNA z

minimalnym tłem. Barwienie trwa ok. 40 min.

10.6. Wizualizacja DNA w MSSCP z Silver Stain Kit

Silver Stain Kit zawiera:

1. Utrwalacz - 125 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Roztwór srebra - 15 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

3. Wywoływacz A - 1000 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

36

4. Wywoływacz B - 3 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

UWAGA!

Pojemniki przeznaczone do barwienia srebrem powinny być dokładnie oczyszczone. Do

barwienia zalecamy stosowanie tylko dejonizowanej wody 18,4 mOhm lub wody

destylowanej.

Procedura barwienia:

Czas [min]

(dla żelu gr. 0,5 mm)

Denaturacja

10% EtOH - 110 ml

3-5 min

Usunięcie roztworu za pomocą pompki

Utrwalacz

8 ml + 212 ml of H2O

2 min, powtórzyć 2 razy

Usunięcie roztworu za pomocą pompki

Srebrzenie

1 ml roztworu srebra dodać do 110 ml wody

10 min

Usunięcie roztworu za pomocą pompki

Płukanie (powtórzyć 3 razy)

H

2

O, 110 ml

5 sekund

Usunięcie roztworu za pomocą pompki

Wywołanie

60 ml Wywoływacz A dodać do 240 ml wody,

dodać 132



l Wywoływacza B bezpośrednio

przed użyciem

Optymalna temperatura wody to 18 °C

Pierwszy raz 3 min lub do

zaciemnienia roztworu, drugi

raz i trzeci raz do pojawienia

się prążków

Usunięcie roztworu za pomocą pompki

Zatrzymać reakcję kiedy prążki są wyraźne I

zadowalające poprzez dodanie 100 ml 10%

kwasu octowego

10 min

Usunięcie roztworu za pomocą pompki

Przemycie w wodzie (3 razy)

Pierwszy raz – 15 sekund

37

Drugi I trzeci raz po 10 min

Uwagi ogólne:

1. Wszystkie płukania są wykonywane ze 110 ml roztworu.

2. Należy unikać dotykania żelu nawet przez rękawice.

3. Wytrzymałość mechaniczna żelu jest obniżona podczas barwienia, należy traktować go

delikatnie.

4.Najlepszą ostrość zostaje osiągnięta po płukaniu w kwasie octowym lub po wysuszeniu.

Uwagi

1. Wszystkie czasy inkubacji wizualizacji prążków są zoptymalizowane dla 0,5 mm grubości

żelu. Zwiększenie grubości żelu o 100% powinno wydłużyć czas barwienia o 100%.

2. Roztwór srebra powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.

3. Aby zwiększyć kontrast barwienia i zmniejszyć poziom tła należy zmienić roztwór

każdorazowo kiedy pojawia się ciemny osad.

4. Należy zatrzymać reakcję, gdy osiągnięta została odpowiednia intensywność prążków

(zwykle 5-10 min).

Literatura:

1. Wray, W., T. Boulikas, V.P. Wray i R. Hancock. 1981 roku.

Barwienie srebrem białka w żelu poliakrylamidowym. Anal. Biochem 118: 197-203.

10.7. Suszenie żelu

W zestawie DryOut żele suszone są w dwóch arkuszy folii w temperaturze pokojowej. Po

wysuszeniu żele mogą być przechowywane bez utraty jakości przez długi czas.

Zestaw DryOut obejmuje:

1. ramki 2 szt.

2. stolik

3. Folię do suszenia 35 szt.

4. Zaciski 8 szt.

Procedura:

38

1. Arkusz folii zwilżyć wodą.

3. Na stoliku umieścić jedną z ramek.

4. Umieścić połowę nasączonej folii na stoliku, tak aby folia obejmowała całą ramkę.

5. Umieścić żel na folii a następnie zalać go niewielką ilością wody.

6. Przykryć żel drugą połową folii upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza

pomiędzy obiema warstwami folii.

7. Nałożyć na folię z żelem drugą ramkę, a następnie spiąć ramki zaciskami (po 2 zaciski po

każdej stronie).

8. Umieścić statywy w pionie. Pozwolić na wypływ wody z pomiędzy plastrów folii.

9. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc (Rysunek 20).

Rysunek 20.
Suszenie żelu.

Ważne: Przed suszeniem żelu należy przepłukać żel w wodzie w celu usunięcia kwasu
octowego, który mógłby spowodować pękanie żelu podczas suszenia.
Suszone żele mogą być przechowywane w dzienniku laboratorium przez długi czas bez
utraty jakości.
Żele grubsze niż 1,5 mm lub z koncentracją poliakrylamidu wyższą niż 10% powinna być
zanurzona przed suszeniem przez 10-15 min w roztworze 50-65% MeOH (v/v) + 5% glicerol,
aby zapobiec ich pękaniu podczas suszenia.

39

Rozdział 11. Oprogramowania DNAPointer

11.1. Uruchamianie aplikacji

Rysunek 21. Ikona programu

Uruchomienie aplikacji następuje poprzez dwukrotne kliknięcie na ikonę o nazwie
dnapointer.exe znajdującą się na pulpicie komputera sterującego (Rysunek 21)
Po uruchomieniu zostanie przez 3 s wyświetlony ekran powitalny (Rysunek 22). Następnie
program przejdzie do okna logowania.

Rysunek 22. Ekran powitalny

11.2. Okno logowania

Okno logowania pozwala użytkownikowi na zalogowanie się do programu po uprzednim
wyborze własnego konta z rozwijanej listy. Przyciśnięcie przycisku Login zatwierdza wybór i
przenosi użytkownika do okna wyboru profilu. Każde konto użytkownika przechowuje w
swojej własnej przestrzeni użytkownika dane dotyczące utworzonych profili elektroforezy
(Rysunek 23).

Formularz New User: pozwala na dodanie nowego użytkownika. Utworzenie nowego konta
użytkownika zatwierdzane jest przyciskiem Add user.
Przycisk Delete user zatwierdza polecenie usunięcia konta użytkownika wybranego na liście
User. Przycisk Exit program powoduje wyjście z programu.

40

Rysunek 23. Okno logowania

11.3. Okno wyboru trybu pracy

Okno wyboru trybu pracy pozwala na wybór jednej z dwóch opcji:

1. New - tworzenie nowego profilu elektroforezy
2. Existing - korzystanie z wcześniej utworzonego profilu elektroforezy

Po wybraniu jednej z dwóch opcji program przenosi użytkownika do kolejnego okna.
Przycisk Back przenosi użytkownika do poprzedniego okna.
Przycisk Sernice Panel zarezerwowany jest dla serwisu. Okno serwisowe zabezpieczone jest
hasłem i użytkownik nie ma do niego dostępu.

Rysunek 24. Okno wyboru trybu pracy

11.4. Okno wyboru profilu elektroforezy

Okno wybory profilu elektroforezy pozwala użytkownikowi na wybór jednej z czterech opcji
(Rysunek 25):

1. One Temperature - tworzenie profilu elektroforezy SSCP
2. Multitemperature - tworzenie profilu elektroforezy MSSCP
3. Gradient - tworzenie profilu elektroforezy o liniowo zmiennej temperaturze w

czasie

41

4. Custom - tworzenie profilu elektroforezy łączącej w jednym procesie cechy

elektroforezy SSCP lub MSSCP z Gradientową

Po wybraniu jednej z czterech opcji program przenosi użytkownika do formularza
projektowania profilu. Przycisk Back przenosi użytkownika do poprzedniego okna.
Okno wyboru profilu elektroforezy dla obu opcji z punktu B.5 jest takie samo.

Rysunek 25. Okno wyboru profilu elektroforezy

11.5. Profil - One Temperature

Okno projektowania profilu elektroforezy One Temperature pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy SSCP.

Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy.

Parametry Preelektroforezy:

1. Power [W] - moc preelektroforezy
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach

Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania
próbek.

Parametry fazy zagęszczania próbek:

1. Voltage [V] - napięcie
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [min] - czas wyrażony w minutach

Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy
właściwej.

Parametry fazy właściwej elektroforezy:

1. Power [W] - moc preelektroforezy
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach

42

Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver

Parametry fazy gel saver:

1. Voltage [V] - napięcie
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [min] - nieskończoność

Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile
(Rysunek 26)

Rysunek 26. Okno projektowania profilu One Temperature (SSCP)

11.6. Profil - Multitemperature

Okno projektowania profilu elektroforezy Multitemperature pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy MSSCP.

Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy.

Parametry Preelektroforezy:

1. Power [W] - moc preelektroforezy
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach

Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania
próbek.

Parametry fazy zagęszczania próbek:

1.

Voltage [V] - napięcie

2.

Gel Temp[C] - temperatura żelu

3.

Duration[min] - czas wyrażony w minutach

43

Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy
właściwej. Po wprowadzeniu parametrów i naciśnięciu przycisku Add Step 2 sekcja zmieni
nazwę na Electrohoresis phase #2 umożliwiając wprowadzenie parametrów dla drugiego
kroku elektroforezy MSSCP, a przycisk zmieni nazwę na Add Step 2. Możliwe jest
zaprogramowanie do 9 kroków elektroforezy MSSCP.

Parametry fazy właściwej elektroforezy:

1. Power [W] - moc preelektroforezy
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [Vxh] -

czas wyrażony w woltogodzinach

Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver

Parametry fazy gel saver:

1. Voltage [V] - napięcie
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [min] - nieskończoność

Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile
(Rysunek 27)

Rysunek 27. Okno projektowania profilu Multitemperature (MSSCP)

11.7. Profil – Gradient

Okno projektowania profilu elektroforezy Gradient pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy o gradientowo zmiennej temperaturze w czasie.

Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy.

Parametry Preelektroforezy:

44

1. Power [W] - moc preelektroforezy
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach

Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania
próbek.

Parametry fazy zagęszczania próbek:

1. Voltage [V] - napięcie
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [min] - czas wyrażony w minutach

Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy
właściwej.

Parametry fazy właściwej elektroforezy:

1. Duration[min] - czas wyrażony w minutach
2. Start Temp [C] - temperatura początkowa
3. End Temp [C] - temperatura końcowa
4. Power [W] - moc preelektroforezy
5. Gradient [C/min] - gradient

Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver

Parametry fazy gel saver:

1. Voltage [V] - napięcie
2. Gel Temp[C] - temperatura żelu
3. Duration[min] - nieskończoność

Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile
(Rysunek 28).

45

Rysunek 28. Okno projektowania profilu Gradient

11.8. Profil – Custom

Okno projektowania profilu elektroforezy Custom pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy o cechach elektroforezy zarówno gradientowej jak i stałej lub schodkowej
(MSSCP lub SSCP).

Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy.

Parametry Preelektroforezy:

1.

Power [W] - moc preelektroforezy

2.

Gel Temp [C] -

temperatura żelu

3.

Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach

Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania
próbek.

Parametry fazy zagęszczania próbek:

1.

Voltage [V] - napięcie

2.

Gel Temp [C] - temperatura żelu

3.

Duration [min] - czas wyrażony w minutach

Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy
właściwej. Wprowadzenie odpowiednich parametrów pozwala na zaprojektowanie etapu
elektroforezy o charakterystyce temperatury gradientowej jak i stałej. Przycisk Add Step
pozwala na dodanie kolejnego kroku jak to miało miejsce w przypadku tworzenia profilu
elektroforezy Multitemperature

Parametry fazy właściwej elektroforezy:

1. Duration [min] - czas wyrażony w minutach
2. Start Temp [C] - temperatura początkowa
3. End Temp [C] - temperatura końcowa
4. Power [W] - moc preelektroforezy
5. Gradient [C/min] - gradient

Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver

Parametry fazy gel saver:

1. Voltage [V] - napięcie
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [min] - nieskończoność

Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile.

11.9. Zapisywanie profilu elektroforezy

Po utworzeniu profilu elektroforezy należy ją zapisać w pamięci komputera za pomocą
formularza. Należy nadać profilowi specyficzną nazwę i nacisnąć przycisk Save (Rysunek 29).

46

Rysunek 29. Okno projektowania profilu Gradient

11.10. Preelektroforeza

Po zapisaniu profilu pojawia się okno przygotowujące do Preelektroforeza. Należy wypełnić
kolejne polecenia:

1. Zainstalować żel w komorze elektroforetycznej
2. Wlać do zbiorników bufor elektroforetyczny
3. Zamknąć pokrywę aparatu
4. Włączyć zasilanie aparatu włącznikiem na tylnej ściance jednostki głównej

Rysunek 30. Okno uruchomienia elektroforezy

47

Rysunek 31. Okno główne programu

W oknie głównym programu wyświetlanych jest szereg informacji przydatnych
użytkownikowi:

1. Preelectrophoresis time left – czas pozostały do końca Preelektroforeza czyli do

momentu w którym możliwe będzie naniesienie próbek a żel.

2. Gel Temp[C] – temperatura próbek w żelu.
3. Linie wykresu:

a. Cienkie linie wykresu oznaczają zaprojektowany teoretyczny przebieg

zmiennych w czasie parametrów

i. Linia czarna- zaprojektowany wykres temperatury

ii. Linia czerwona – zaprojektowany wykres mocy elektroforezy

iii. Linia niebieska - zaprojektowany wykres napięcia elektroforezy

b. Grube linie wykresu oznaczają rzeczywisty przebieg parametrów w czasie

i. Linia czarna- rzeczywisty wykres temperatury

ii. Linia czerwona – rzeczywisty wykres mocy elektroforezy

iii. Linia niebieska - rzeczywisty wykres napięcia elektroforezy

Widoczny w oknie głównym przycisk Pause jest aktywny tylko w momentach kiedy
przerwanie elektroforezy jest możliwe. Pozostaje nieaktywny kiedy czynności system
wykonać nie może.

Po prawej stronie przy krawędzi znajdują się dwie skale. Czerwona skala dotyczy mocy
elektroforezy. Niebieska skala dotyczy napięcia elektroforezy.
Po lewej stronie przy krawędzi znajduje się jedna czarna skala. Można za jej pomocą
odczytać wartość temperatury w danej chwili.

48

Kiedy Preelektroforeza dobiegnie końca wyświetlany jest odpowiedni komunikat (Rysunek
32).

Rysunek 32. Okno informujące o zakończeniu Preelektroforeza

Po nałożeniu próbek cały proces przebiegnie automatycznie i nie będzie wymagał uwagi
użytkownika.
Należy zastosować się do poleceń zawartych w komunikacie:

1. Otworzyć pokrywę aparatu
2. Nałożyć próbki na żel
3. Zamknąć pokrywę
4. Uruchomić elektroforezę

11.11. Elektroforeza

Rysunek 33. Faza zagęszczania próbek

49

Rysunek 34. Faza Elektroforezy #1 - 35°C

Rysunek 35. Faza Elektroforezy #2 - 15°C

50

Rysunek 36. Faza Elektroforezy #3 - 5°C

Rysunek 37. Zakończanie elektroforezy

Rysunek 38. Gel Saver

11.12. Wyjście z programu

Możliwe jest zatrzymanie elektroforezy w trakcie jej trwania. Należy to zrobić pauzując
proces przyciskiem Pause ( nie zawsze jest aktywny) a następnie wybierając z belki górnej
poleceń polecenie Quit.