LIPIDY OSOCZA
1. Triacyloglicerole
2. Cholesterol wolny i zestryfikowany
3. Fosfolipidy
4. Wolne kwasy tłuszczowe

Transport lipidów w środowisku wodnym (we krwi) jest możliwy po ich połączeniu się z
białkami (apoproteinami) w związki wielkocząsteczkowe zwane lipoproteinami.

LIPOPROTEINY

 sferyczne cząstki

- niestechiometryczne kompleksy białkowo-lipidowe
- rdzeń - triacyloglicerole i estry cholestrolu
- powierzchnia – cząsteczki amfipatycznych lipidów (fosfolipidy i cholesterol wolny)
i białek



oddziaływania pomiędzy cząsteczkami

– niekowalencyjne

- wiązania wodorowe
- siły van der Waalsa



następuje wymiana lipidów i apoprotein pomiędzy lipoproteinami osocza oraz
pomiędzy lipoproteinami i błonami komórkowymi

PODZIAŁ LIPOPROTEIN

Klasa/

Parametr

ChM

VLDL

IDL

LDL

HDL

Lp(a)

Gęstość

[g/mL]

<0,95

0,95-

1,006

1,006-1,019

1,019-

1,063

1,063-1,210

1,040-

1,130

Ruchliwość w

EF

start

prebeta

1

prebeta

2

beta

alfa

prebeta

Ś

rednica [nm]

>70

26-70

22-24

19-23

4-10

26-30

G ówne lipi

ł

dy egzogenne

TAG

endogenne

TAG

endogenne

TAG, estry

cholesterolu

estry

cholesterolu

fosfolipidy

estry

cholesterolu,

fosfolipidy

G ówne bia ka

ł

ł

A-I

B-48

C-I

C-II

C-III

E

B-100

C-I

C-II

C-III

E

B-100

E

B-100

A-I

A-II

E

(a)

B-100

Podział uwzględniający różnice gęstości poszczególnych frakcji lipoproteinowych –
uzyskany metodą ultrawirowania

 chylomikrony: 0,98 g/mL
 lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL): <1,006 g/mL
 lipoproteiny o pośredniej gęstości (IDL): 1,006- 1,019 g/mL
 lipoproteiny o małej gęstości (LDL): 1,019-1,063 g/mL
 lipoproteiny o dużej gęstości (HDL): 1,063-1,21 g/mL



Lp(a) – 1,040-1,130 g/mL

1

Podział uzyskany podczas elektroforezy (agaroza; pH 8,6):



α

-lipoproteiny (HDL)



pre-

β

-lipoproteiny (VLDL, IDL, Lp(a))



β

-lipoproteiny (LDL)



chylomikrony (ChM)

CHEMICZNY SKŁAD (%)PRAWIDŁOWYCH LIPOPROTEIN

Frakcja/

Skład (%)

ChM

VLDL

IDL

LDL

HDL

Triacyloglicerole

80-90

50-70

20-25

5-10

3-5

Cholesterol wolny

1-3

7-10

7-10

5-8

3-5

Estry cholesterolu

2-5

4-13

10-12

40-45

15-20

Fosfolipidy

3-7

15-20

15-20

20-22

20-30

Białka (apoproteiny)

1-2

8-12

18-20

20-25

45-55

APO(LIPO)PROTEINY

Apoproteina

Masa

cząsteczkowa

[Da]

Miejsce

syntezy

Stężenie w osoczu [g/L]

AI

28 300

Jelito, wątroba

1,0-1,2

AII

17 000

Wątroba, jelito

0,3-0,5

AIV

46 000

Wątroba, jelito, płuca,

śledziona

0,16

B-48

265 000

Jelito

B-100

550 000

Wątroba

0,7-1,0

CI

6500

Wątroba, jelito

0,04-0,06

CII

8800

Wątroba, jelito

0,03-0,05

CIII

8900

Wątroba, jelito

0,12-0,14

D

20 000

Mózg, wątroba, nerki, komórki

endothelium

E-2, E-3, E-4

39 000

Wątroba, mózg, płuca,

śledziona, mięśnie

0,025-0,100

Apoproteina

Funkcja

AI

Aktywator LCAT, ligand receptora HDL, rola strukturalna w HDL-ach

AII

Rola strukturalna, kofaktor HTGL, inhibitor LPL

2

AIV

Transport zwrotny cholesterolu, aktywator LCAT i LPL

B-48

Rola strukturalna

B-100

Ligand receptora apo B/E, rola strukturalna

CI

Kofaktor LCAT

CII

Aktywator LPL

CIII

Inhibitor apo-CII

D

Transport lipidów

E-2, E-3, E-4

Ligand receptora apo B/E i receptora LRP, transport cholesterolu

ENZYMY METABOLIZMU LIPOPROTEIN

Lipaza lipoproteinowa (LPL)

 glikoproteina (55 000)
 hydrolaza acyloglicerolu



występuje w: tkance tłuszczowej, mięśniach szkieletowych, mięśniu sercowym,
płucach, wątrobie, śledzionie



związana z powierzchnią komórek – głównie śródbłonka naczyniowego (za
pośrednictwem siarczanu heparanu)



aktywność w tkankach zależy od czasu jaki upłynął od posiłku oraz od wydzielania
hormonów (gł. insuliny)

- duża aktywność w tkance tłuszczowej po posiłku
- duża aktywność w mięśniach w okresie poresorpcyjnym



wstrzyknięcie heparyny powoduje:

- uwolnienie LPL do krwi
- zmianę wykorzystania kwasów tłuszczowych przez narządy



aktywatory: apo CII (na czczo na HDL-ach) i fosfolipidy (wiążą apo CII z
lipoproteiną)

Wątrobowa lipaza lipoproteinowa (HTGL/HL)

 glikoproteina
 syntetyzowana w wątrobie
 wiąże się z powierzchnią śródbłonka w zatokach wątroby



hydrolizuje triacyloglicerole w:

- IDL-ach
- remnantach chylomikronów
- HDL (przekształca HDL

2

w HDL

3

)

Acylotransferaza acylo-CoA:cholesterol (ACAT)



enzym mikrosomalny



katalizuje reakcję estryfikacji cholesterolu w obecności CoA i ATP



inhibitory:

- kwasy żółciowe
- czynniki blokujące grupy sulfhydrylowe

3



wykazuje swoistość w stosunku do różnych kwasów tłuszczowych – szybkość
estryfikacji maleje w zależności od rodzaju kwasu w kolejności:

oleinian>palmitynian>stearynian>linoleinian



aktywność ACAT zależy od zawartości cholesterolu w komórce

Hydrolaza estrów cholesterolu (esteraza cholesterolowa)

 w wątrobie, ścianie naczyniowej, nabłonku jelitowym, korze nadnerczy i jajnikach

(synteza hormonów steroidowych)



katalizuje odwracalną reakcję estryfikacji cholesterolu i hydrolizy estrów cholesterolu:

estry cholesterolu + H

2

O cholesterol wolny + kwas tłuszczowy

Acylotransferaza lecytyna:cholesterol (LCAT)

 sekrecyjny enzym osocza
 synteza w wątrobie
 związana z frakcją HDL
 katalizuje reakcję:

lecytyna + cholesterol ester cholesterolu + lizolecytyna

 powstają głównie estry cholesterolu i nienasyconych kwasów tłuszczowych (kwasu

linolowego, oleinowego, arachidonowego)

 aktywator: AI (CI)

BIAŁKO PRZENOSZĄCE ESTRY CHOLESTEROLU (CETP)

 glikoproteina
 posiada domeny wiążące triacyloglicerole, estry cholesterolu, fosfolipidy
 synteza – wątroba, nadnercza, trzustka, mięśnie, tkanka tłuszczowa, jelito cienkie,

serce i nerki

 odpowiada za transfer:
- estrów cholesterolu pomiędzy lipoproteinami osocza i ich wymianę na triacyloglicerole

(100%)

- fosfolipidów (w ok. 30%)

BIAŁKO PRZENOSZĄCE FOSFOLIPIDY (PTP)

 odpowiedzialne za 70 % transferu fosfolipidów pomiędzy lipoproteinami osocza:

- z lipoprotein bogatych w TAG na HDL-e
- z HDL

3

na VLDL-e i LDL-e

- z CETP z HDL na inne lipoproteiny

RECEPTORY UCZESTNICZĄCE W PRZEMIANACH LIPOPROTEIN OSOCZA

 receptor dla remnantów (LRP)

- w wątrobie
- rozpoznaje apo E

 receptor dla LDL (receptor apo B100/E)

- w wielu komórkach organizmu

4

- rozpoznaje apo B100 i apo E
- jego synteza jest ściśle uzależniona od zapotrzebowania komórki na cholesterol i

zawartości w niej estrów cholesterolu

 receptor SR-B1 (receptor zmiatający B1)

- w wątrobie i tkankach steroidogennych wiąże HDL za pośrednictwem apo AI i estry
cholesterolu są dostarczane do komórek
- w pozostałych tkankach pośredniczy w przenoszeniu cholesterolu z komórek do

HDL

3

(zwrotny transport choleterolu)

 transportery kasetowe wiążące ATP: ABCA1 i ABCG1

- rodzina białek transportujących z towarzyszącą hydrolizą ATP w celu związania
substratu (co umożliwia jego transport przez błonę)
- ABCG1 – pośredniczy w transporcie cholesterolu z komórek do HDL-i (np. z

makrofagów)

- ABCA1 – preferencyjnie ułatwia wypływ cholesterolu i fosfolipidów do cząstek

pre

β

-HDL lub apo AI przekształcanych następnie w dyskoidalne HDL i HDL

3

5

LIPOPROTEINA (a)



glikoproteina, białko ostrej fazy, zmodyfikowana cząstka LDL



apo (a) i apo B100 – połączone mostkiem dwusiarczkowym

 apo (a) – peptyd sygnałowy, domena proteazowa i struktury obwarzankowe (kringles)

utrzymywane przez 3 wiązania dwusiarczkowe (podobne struktury są w
plazminogenie, protrombinie, tkankowym i urokinazowym aktywatorze
plazminogenu)



zakres stężeń w osoczu 1-100 mg/dL (prawidłowe nie powinno przekraczać 30
mg/dL)



podobieństwo budowy apo (a) do plazminogenu może hamować procesy fibrynolizy
(działanie prozakrzepowe)

 pobudza regenerację i naprawę uszkodzonych naczyń



apo (a) występuje w izoformach:

- F (fast) – o ruchliwości elektroforetycznej większej niż apo B100
- B – o ruchliwości elektroforetycznej zbliżonej do apo B100
- S1, S2, S3, S4 (slow) o ruchliwości elektroforetycznej mniejszej niż apo B100

 u osób z małym stężeniem Lp(a) przeważają duże izoformy apo (a) S3 i S4
 u osób ze zwiększonym stężeniem Lp(a) przeważają izoformy małe F, B, S1, S2

6



Lp(a) nasila chemotaksję monocytów do blaszki miażdżycowej i aktywację płytek
krwi



Lp(a) jest pobierana przez receptory typu „scavenger”

LIPOPROTEINA X (LpX)

 u pacjentów z cholestazą wątrobową
 budowa – liposomy:

- podwójna warstwa fosfolipidowa (gł. lecytyny) – 66%
- wolny cholesterol – 25%
- białka (1/2 albumina) – 5%

 nie wykazuje właściwości aterogennych

LIPOPROTEINA

β

-VLDL



powstaje w osoczu:

- podczas stosowania diety bogatotłuszczowej
- w otyłości brzusznej
- w insulinooporności
- cukrzycy typu 2
- gdy wytwarzana jest izoforma apo E2

 gęstość <1,006 g/mL (VLDL)
 ruchliwość elektroforetyczna b-lipoprotein (LDL)
 zawartość

- 40% TAG + ok. 35% cholesterolu

 aterogenna

ZMODYFIKOWANE LDL

 utlenione LDL – retencja LDL i zaburzenie równowagi prooksydacyjno-

antyoksydacyjnej

- mm-LDL (wczesna faza modyfikacji)
- ox-LDL (późna faza modyfikacji)



insulinooporność i cukrzyca – podwyższone stężenia glukozy

- gli-LDL
- glioksy-LDL

7

APOPROTEINA E (Apo E)

 chylomikrony, VLDL, IDL, HDL
 rozpoznawana przez receptory: LRP i B/E
 osłania apo AI
 nasila aktywność białka CETP
 wykazuje polimorfizm (3 allele w jednym locus + modyfikacja potranslacyjna)



6 fenotypów: apo E 2/2, apo E 3/2, apo E 3/3, apo E 4/2, apo E4/3, apo E 4/4

Poszczególne izoformy wykazują różną siłę wiązania z receptorami LRP:

 izoforma apo E2

– wykazuje mniejsze powinowactwo do receptora LRP -> zmniejsza się zawartość

cholesterolu w komórkach wątroby -> zwiększa się ilość receptorów B/E

 izoforma apo E4

- wykazuje większe powinowactwo do receptora LRP -> zwiększa się zawartość
cholesterolu w komórkach wątroby -> zmniejsz się ilość receptorów B/E
- bierze udział w patomechanizmie choroby Alzheimera (powstają kompleksy apo E4 i

peptydu powstającego z białka prekursorowego amyloidu)

DYSLIPIDEMIE / DYSLIPOPROTEINEMIE
Klasyfikacja hiperlipoproteinemii według Fredricksona

Typ

Wygląd surowicy

CH

TAG

EF

ChT/TAG

I

mleczna

N/↑

↑↑↑

ChM

< 0,2

IIa

klarowna

↑↑↑

N

nadmiar LDL

> 1,5

IIb

klarowna,

opalizująca

↑↑

↑↑

nadmiar

LDL i VLDL

> 1,5

III

mętna

↑↑

↑↑

IDL

ok.1

IV

mętna

N/↑

↑↑↑

nadmiar VLDL

< 0,2

V

mleczna

↑↑

↑↑↑

ChM i nadmiar VLDL

0,15-0,6

KLASYFIKACJA HIPERLIPIDEMII
(wg Europejskiego Towarzystwa Miażdżycowego)

CH

mmol/L (mg/dL)

TAG

mmol/L (mg/dL)

Hipercholesterolemia izolowana:
- łagodna
- umiarkowana
- znaczna

5,2-6,5 (200-250)
6,5-7,8 (250-300)

> 7,8 (> 300)

<1,7 (150)
<1,7 (150)
<1,7 (150)

Hipertriglicerydemia izolowana:
- umiarkowana
- znaczna

<5,2 (200)
<5,2 (200)

2,3-4,6 (200-400)

>4,6 (>400)

Hiperlipidemia mieszana:
- umiarkowana

5,2-6,5 (200-250)

>7,8 (>300)

2,3-4,6 (200-400)

>4,6 (400)

8

- znaczna

HIPERCHOLESTEROLEMIA

Klasyfikacja

genetyczna

Pierwotna przyczyna

Zaburzenia metaboliczne

Typ

Pospolita hiper-
cholesterolemia

liczne czynniki genetyczne/
środowiskowe

nadprodukcja LDL i obniżony
katabolizm

IIa

Rodzinna złożona
hipelipidemia

nieznana

nadprodukcja apo B frakcji
VLDL i LDL

IIa

Rodzinna hiper-
cholesterolemia

liczne mutacje powodujące
upośledzenie funkcji lub brak
receptora komórkowego dla
LDL

upośledzony katabolizm LDL
i nadprodukcja LDL

IIa

HIPERTRIGLICERYDEMIA

Klasyfikacja

genetyczna

Pierwotna przyczyna Zaburzenia metaboliczne

Typ

Pospolita hiper-
triglicerydemia

czynniki genetyczne/
środowiskowe

nadprodukcja VLDL

IV

Rodzinna złożona
hiperlipidemia

nieznana

nadprodukcja apo B frakcji
VLDL i LDL

IV

Rodzinna
hipertriglicerydemi
a

nieznana

nadprodukcja TAG frakcji
VLDL i/lub upośledzony
katabolizm

IV

HIPERLIPIDEMIA MIESZANA

Klasyfikacja

genetyczna

Pierwotna przyczyna

Zaburzenia metaboliczne

Typ

Rodzinna złożona
hiperlipidemia

nieznana

nadprodukcja apo B frakcji
VLDL i LDL

IIb

Rodzinna hiper-
cholesterolemia

liczne mutacje powodujące
upośledzenie funkcji lub brak
receptora komórkowego dla
LDL

upośledzony katabolizm
LDL i nadprodukcja LDL

IIb

Rodzinna hiper-
triglicerydemia

nieznana

nadprodukcja TAG frakcji
VLDL i/lub upośledzony
katabolizm

IV

Zespół hiper-
chylomikronemii

brak/niedobór LPL lub jej
aktywatora apo CII

upośledzony katabolizm
ChM, czasem wtórne
upośledzone usuwanie
VLDL

I lub V

9

INNE RODZAJE KLASYFIKACJI DYSLIPIDEMII

 pierwotne i wtórne
 jednogenowe,wielogenowe, złożone

PIERWOTNE DYSLIPIDEMIE
Związane z zaburzeniami transportu lipidów egzogennych

 sitosterolemia (zwiększone wchłanianie steroli roślinnych)
 abetalipoproteinemia (brak syntezy VLDL i ChM)
 choroba Andersona (brak syntezy ChM)
 rodzinna hipertriglicerydemia (chylomikronemia) związana z niedoborem LPL



rodzinna hipertriglicerydemia (chylomikronemia) związana z niedoborem apo CII

 hiperlipidemia typu III (rodzinna dysbetalipoproteinemia) – izoforma apo E2 + inne

przyczyny

Związane z zaburzeniami transportu lipidów endogennych

 złożone hiperlipidemie (złożone podłoże genetyczne) – izoforma apo E4 (najczęściej)
 rodzinna złożona hiperlipidemia (nasilona sekrecja apo B100 i synteza VLDL w

wątrobie, wzrost aktywności apo CIII + inne)

 rodzinna hipercholesterolemia (upośledzona funkcja receptora dla LDL )
 rodzinny defekt apoproteiny apo B100
 dyslipidemia z nadprodukcją Lp(a)



hipobetalipoproteinemia

 brak aktywności lipazy wątrobowej

Związane z zaburzeniami drogi transportu zwrotnego cholesterolu do wątroby

 rodzinna hipoalfalipoproteinemia
 brak apo AI
 zmieniona budowa apo AI
 choroba tangierska (mutacje genu transportera ABCA-1)
 upośledzenie aktywności LCAT
 hiperalfalipoproteinemia związana z niedoborem CETP
 brak apo AII

Przyczyna

Podwyższona frakcja lipoprotein

HDL

Endokrynna, metaboliczna

- cukrzyca

LDL i/lub VLDL/ChM

↓

- niedoczynnośc tarczycy

LDL i/lub VLDL/ChM/IDL

↓

- choroba Cushinga

LDL i/lub VLDL

N

- akromegalia

VLDL

?

Nerkowa

- niewydolność nerek

IDL lub VLDL

↓

- zespó nerczycowy

ł

LDL i/lub VLDL/ChM

↓

W ątrobowa

- cholestaza

LDL (LpX)

↓

- alkoholizm

VLDL, ChM

N

10

Przyczyna

Podwyższona frakcja lipoprotein

HDL

Immunologiczna:

- toczeń rumieniowaty

ChM lub IDL

N

- gammapatie monoklonalne

LDL i/lub VLDL/ChM lub IDL

↓

Leki:

-

β

-blokery

VLDL, LDL

↓

- tiazydy

LDL i/lub VLDL

N/↓

- glikokortykoidy

VLDL i/lub ChM z/bez LDL

N/↓

- estrogeny

VLDL/ChM

N

- gestageny

LDL i VLDL

↓

WSKAZANIA DO PRZEPROWADZENIA BADAŃ LIPIDOWYCH

 ocena ryzyka wieńcowego



pierwotne dyslipoproteinemie (objawy: żółtaki, obwódka starcza, zmętnienie rogówki,
barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, hepatosplenomegalia)

 wtórne dyslipoproteinemie
 wyjaśnienie etiologii ostrego zapalenia trzustki
 profilaktyka
 kontrola leczenia obniżającego stężenie tłuszczów (dietetycznego, farmakologicznego)

i leczenia chorób wywołujących wtórne hipercholesterolemie

MATERIAŁ DO BADAŃ LIPIDOWYCH



krew żylna – krótkotrwały ucisk stazy



pacjent minimum 12-14 godzin na czczo (bez głodówek)



ostatni posiłek przed badaniem – z małą ilością tłuszczu, bez alkoholu (szczególnie
ważne podczas oznaczania stężenia TAG)



w ciągu 24 godzin przed pobraniem krwi nie wykonywać żadnej ciężkiej pracy
fizycznej



surowica lub osocze wersenianowe (1 mg EDTA na 1 mL krwi)



przechowywanie materiału – w szczelnie zamkniętych probówkach:

- do 4 dni w lodówce
- w temp. -20°C do 6 miesięcy
- w temp. -70°C do roku

Test zimnej flotacji

 ocena wyglądu surowicy/osocza (na czarnym tle)

- mętny wygląd – zależy od nadmiaru TAG (VLDL lub ChM)

 do wąskiej probówki nalewamy 2-5 mL surowicy i wstawiamy do lodówki na 12-18

godzin

 wynik:

- gęsty kożuszek - kożuszek

- mętna

11

na powierzchni

- mętna surowica surowica

- przejrzysta surowica

↑ChM - typ I ↑ ChM typ V ↑ VLDL – typ IV/IIB

↑ VLDL

OZNACZANIE CHOLESTEROLU CAŁKOWITEGO

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

! Krew nie może być zhemolizowana – hemoliza wpływa na stężenie cholesterolu w osoczu
(zwiększa)!

 w osoczu in vitro:

ChW : ChE = 1 : 3

 w erytrocytach

ChW : ChE = 4 : 1

Bilirubina w stężeniu powyżej 10 mg% wpływa na oznaczenie cholesterolu – przyjmuje się
poprawki zależne od stężenia bilirubiny:
- przy stężeniu bilirubiny >5mg% na każdy 1 mg% należy dodać 2,5 mg% cholesterolu

Metody kolorymetryczne oznaczania cholesterolu dzielimy na:



jednostopniowe – reakcja barwna(rutynowe)

 wielostopniowe

- czterostopniowe

ekstrakcja cholesterolu
zmydlanie
izolowanie
reakcja barwna

- trzystopniowe

ekstrakcja cholesterolu
zmydlanie
reakcja barwna

EKSTRAKCJA
Cholesterol jest związany z lipoproteinami – należy go z tych połączeń wyekstrahować
mieszaniną odczynników:

 etanolu i eteru – całkowita ekstrakcja cholesterolu
 etanolu i acetonu
 metanolu i chloroformu (mieszanina Folcha)

ZMYDLANIE
Hydroliza estrów cholesterolu za pomocą alkoholowego roztworu KOH (na ciepło) –
uzyskanie postaci wolnej cholesterolu
IZOLOWANIE

 najczęściej strącanie digitoniną

- powstają digitonidy
- stosunek molekularny cholesterolu do digitoniny 1:1
- podczas strącannia stosuje się nadmiar digitoniny (10:1)
- przed reakcją barwną należy pozbyć się digitonidów (pirydyną lub CH

3

COOH

REAKCJE BARWNE
A. Reakcja Liebermanna – Burcharda - najstarsza



do roztworu dodaje się mieszaninę bezwodnika CH

3

COOH i stężonego H

2

SO

4

12

Roztwór: cholesterol w chloroformie, kwasie octowym, dioksanie lub bezpośrednio
próbka surowicy/osocza

 reakcja L-B nie jest swoista dla cholesterolu – z odczynnikiem reagują także

bilirubina, witaminy, inne steroidy.

B. Kwas p-toluenosulfonowy



z bezwodnikiem CH

3

COOH, CH

3

COOH lodowatym i H

2

SO

4

C. Reakcja z FeCl

3

, CH

3

COOH lodowatym i H

2

SO

4

Referencyjna metoda oznaczania cholesterolu całkowitego

Metoda Abell-Kendalla (chemiczna 3-stopniowa):

 ekstrakcja: mieszanina alkoholu etylowego i eteru
 zmydlanie : alkoholowy roztwór KOH
 reakcja barwna: Libermanna-Burcharda

Metody enzymatyczne

HYDROLIZA

esteraza cholesterolowa

cholesterol zestryfikowany + H

2

O cholesterol + RCOOH

UTLENIENIE

oksydaza cholesterolowa

cholesterol + O

2

∆

4- cholestenon + H

2

O

2

OZNACZANIE



elektroda tlenowa – oznaczanie tlenu zużytego w tej reakcji



spektrofotometrycznie – pomiar powstałego D4- cholestenonu (l

max

- 240 nm)



reakcja Hanztscha – katalaza + metanol

- metanol utlenia się do aldehydu mrówkowego, który w obecności acetyloacetonu i

amoniaku daje barwny kompleks 3,5-diacetylo-1,4dihydrolutydyny (405-415 nm)



reakcja Trindera - kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną
w obecności fenolu (500-550 nm)

4-aminoantypiryna + fenol = odczynnik Trindera

peroksydaza

H

2

O

2

+ fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H

2

O

Metoda CHOD-PAP = oksydaza + odczynnik

cholesterolowa Trindera

 test optyczny

katalaza

H

2

O

2

+ etanol aldehyd octowy + 2H

2

O

dehydrogenaza aldehydu octowego

aldehyd octowy + NADP

+

kwas octowy + NADPH+H

+

13

Interferencje – metody enzymatyczne oznaczania cholesterolu
Interferują związki barwne lub uczestniczące w reakcji utleniania:



bilirubina o stężeniu powyżej 5 mg/dL (85,5

µ

mol/L) - dodaje się oksydazę bilirubiny

 kwas askorbinowy
 hemoglobina – stosuje się pomiar bichromatyczny
 inne sterole zawierające grupę –OH (np. sitosterol) mogą reagować z zastosowanymi

odczynnikami

Oznaczanie estrów cholesterolu

ChT – ChW = ChE

ChT – cholesterol całkowity
ChW – cholesterol wolny (oznaczony bez etapu zmydlania)
ChE – estry cholesterolu

Metoda rozcieńczeń izotopowych z wykorzystaniem spektrometrii masowej



metoda definitywna oznaczania cholesterolu (ID/MS)

Ch + Ch znakowany (1:1) -> hydroliza estrów -> ekstrakcja

z przekształceniem cholesterolu w etery (analiza GC/MS)

 oblicza się stosunek cholesterolu znakowanego do nieznakowanego i stężenie

cholesterolu w próbce

 bardzo wysoka czułość i precyzja

Zakresy wartości prawidłowych stężeń cholesterolu całkowitego

 zakres wartości prawidłowych trudny do zdefiniowania (odbiega od zakresu wartości

pożądanych = nie powodujących wzrostu ryzyka choroby niedokrwiennej serca)

- duża zmienność biologiczna (wiek, płeć, dieta, wahania

sezonowe, dobowe, faza cyklu menstruacyjnego, ciąża, zawał mięśnia sercowego,
zabiegi chirurgiczne)
- duża częstość hipercholesterolemii
- długi okres latencji do klinicznych objawów następstw hipercholesterolemii

 zakłada się zakres wartości pomiędzy 10 i 90 percentylem

Wiek

Stężenie cholesterolu całkowitego

[mg/dL]

[mmol/L]

> 40 r. ż.

< 240

< 6,2

30-40 r. ż.

< 220

< 5,7

20-30 r. ż.

< 200

< 5,2

< 20 r. ż.

< 170

< 4,4

> 1 r. ż.

< 225

< 5,8

< 1 r. ż.

< 190

< 5,0

Przelicznik [mg/dL] na [mmol/L]: 0,026

14

Nieprawidłowe stężenia cholesterolu całkowitego
Wartości podwyższone:

 pierwotne hipercholesterolemie
 wtórne hipercholesterolemie - w przebiegu:

- przewlekła niewydolność nerek
- zespół nerczycowy
- przewlekłe choroby wątroby i dróg żółciowych (szczególnie pierwotna żółciowa
marskość wątroby)
- niedoczynność tarczycy
- cukrzyca (źle wyrównana)

 leki: gestageny (doustne środki antykoncepcyjne), glikokortykoidy, leki moczopędne
 złe nawyki żywieniowe

Wartości obniżone:

 poniżej 140 mg/dL (3,6 mmol/L)
 ciężkie choroby wyniszczające (nowotwory, przewlekłe zakżenia, operacje, urazy

wielonarządowe)

 nadczynność tarczycy
 niewydolność wątroby
 głodzenie

OZNACZANIE STĘŻENIA TRIACYLOGLICEROLI (TAG)

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

EKSTRAKCJA

 odczynnikiem Bloora (etanol:eter etylowy; 3:1 v/v)

- ekstrakcji ulegają także fosfolipidy
- suszenie ekstraktu i ważenie

ADSORPCJA

 usuwanie fosfolipidów – adsorpcja mieszaniną albuminy i zeolitu



usuwanie glukozy – adsorpcja mieszaniną Ca(OH)

2

i CuSO

4

ZMYDLANIE

 etanolowym roztworem KOH
 następuje uwolnienie glicerolu

REAKCJA BARWNA

 glicerol utlenia się pod wpływem kwasu nadjodowego do formaldehydu
 formaldehyd kondensuje z acetonem w obecności amoniaku – powstaje kompleks

barwny: 3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydyna (405 nm)

Metody fluorymetryczne

 3,5-diacetylo-1,4-dihydrolutydyna (DDL) – może być oznaczana metodą

fluorymetryczną

Metody enzymatyczne

HYDROLIZA

lipaza

triacyloglicerol + 3H

2

O glicerol + 3 kwasy tłuszczowe

OZNACZANIE GLICEROLU

 z wykorzystaniem testu optycznego

1.

kinaza glicerolowa

15

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + NAD

+

fosfodihydroksyaceton + NADH+H

+

2.

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian

pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H

+

mleczan + NAD

+

 z wykorzystaniem pomiaru kolorymetrycznego

1.

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + NAD

+

fosfodihydroksyaceton + NADH+H

+

diaforaza

NADH+H

+

+ barwnik tetrazoliowy formazan + NAD

+

Pomiar: 500 nm

2.

kinaza glicerolowa

glicerol + ATP

glicerolofosforan + ADP

oksydaza glicerolofosforanowa

glicerolofosforan + O

2

fosfodihydroksyaceton + H

2

O

2

peroksydaza

H

2

O

2

+ fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H

2

O

Pomiar: 500-550 nm (metoda z odczynnikiem Trindera, PAP)
Reakcja Trindera - kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną w
obecności fenolu (500-550 nm)

4-aminoantypiryna + fenol = odczynnik Trindera

Interferencje – metody enzymatyczne oznaczania TAG

 endogenny glicerol – w prawidłowych warunkach w niewielkich ilościach

(równowartość ok. 10 mg/dL TAG)

 zwiększenie stężenia glicerolu:

- cukrzyca
- stres (emocjonalny)
- dożylne podawanie leków zawierających glicerol
- przedłużone przechowywanie w temperaturze >-20°C

16

Metoda stałego odcinka czasu (fixed time method)
- oparta na rożnicy wartości pomiarów w dwóch punktach czasowych
- pozwala na eliminację błędu wynikającego z obecności glicerolu

Zakres wartości prawidłowych stężeń TAG
50 -180 mg/dL (0,55-2,0 mmol/L)
Przelicznik z [mg/dL] na [mmol/L]: 0,0114
Nieprawidłowe stężenia TAG
Wartości podwyższone:

 pierwotne hipertriglicerydemie
 wtórne hipertriglicerydemie – w przebiegu:

- cukrzyca
- dna moczanowa
- choroba Cushinga
- gammapatie monoklonalne
- toczeń rumieniowaty układowy
- choroby spichrzania glikogenu
- ciąża
- skłonność: otyłość, nadużywanie alkoholu, dieta bogatowęglowodanowa



leki: blokery receptorów b, tiazydy, glikokortykoidy, estrogeny (doustne leki
antykoncepcyjne)

Oznaczanie stężenia cholesterolu frakcji HDL
Metody strąceniowe

 precypitacja lipoprotein VLDL, IDL, Lp(a), LDL, ChM

- za pomocą polianionów (heparyna, siarczan dekstranu, fosforowolframian)
reagujących z dodatnio naładowanymi grupami lipoprotein
- w obecności kationów dwuwartościowych reakcja ulega przyśpieszeniu
- precypitacja 10-15 minut -> wirowanie 45 000g; 1 minuta lub 1500g; 30 minut

 w supernantancie: cholesterol HDL (oznaczany metodą enzymatyczną)

Najczęściej stosowane mieszaniny polianionów z dwuwartościowymi kationami:



heparyna z Mn

+2



siarczan dekstranu z Mg

+2

(najlepszy przy wysokich stężeniach TAG)



kwas fosforowolframowy z Mg

+2



glikol polietylenowy 20 000 (wytrąca także HDL

2

)

!Gdy stężenie TAG>400 mg/dL precypitacja jest utrudniona – należy zastosować
wirowanie, filtrację lub rozcieńczenie badanej próbki osocza!

Metody bezpośrednie
Oznaczenie cholesterolu we frakcji HDL – metodą enzymatyczną z zastosowaniem:

 przeciwciał poliwalentnych przeciwko apo-B
 czynników kompleksujących

- cyklodekstryna – opłaszcza lipoproteiny (głównie z apo-B, HDL
są opłaszczone w niewielkim stopniu) = osłania cholesterol we frakcjach poza HDL
przed enzymami uczestniczącymi w reakcji
- specyficzny detergent usuwa cyklodekstrynę z frakcji HDL

17

Oznaczanie stężenia cholesterolu frakcji LDL
Metody pośrednie
1. Wzór Friedewalda
– oznaczenie stężenia cholesterolu całkowitego (ChT), triacylogliceroli (TAG), cholesterolu
frakcji HDL (Ch-HDL)-> podstawienie do wzoru:

TAG

Ch-LDL = ChT – Ch-HDL –

[mg/dL]

5

TAG

Ch-LDL = ChT – Ch-HDL –

[mmol/L]

2,2

Wzór Friedewalda nie powinien być stosowany, gdy:

 stężenie TAG przekracza 300 mg/dL (400 mg/dL)
 surowica zawiera znaczące ilości chylomikronów

- nie zostały pobrane na czczo
- u pacjentów z dysbetalipoproteinemią

2. Oznaczanie lipoprotein

β

- metoda ultrawirowania z precypitacją polianionami

(metoda referencyjna)

- osocze wersenianowe (2 mL) z roztworem burowym o gęstości 1,006 g/mL (1 mL)
poddajemy wirowaniu (105 000 x g, 18 godzin, 10°C)
- uzyskujemy rozdział:

VLDL,

β

-VLDL, ChM (warstwa flotująca)

osocze

LDL, HDL (infranatant) + Lp(a), IDL

- infranatant - mieszany, rekonstytuowany do znanej objętości
- oznaczenie cholesterolu w infranatancie
- obliczenie stężenia cholesterolu frakcji LDL i VLDL:

[Ch-LDL] = [Ch frakcji o gęstości >1,006 g/mL] – [Ch-HDL]
[Ch-VLDL] = [ChT] - [Ch frakcji o gęstości >1,006 g/mL]

3. Elektroforeza lipoprotein



metoda półilościowa



pozwala uwidocznić różnice w szybkości wędrówki lipoprotein (wskazuje na
zmiany lub defekty genetyczne nie dające się ocenić innymi metodami) – np. szerokie
pasmo

β

, odpowiadające flotującym b-lipoproteinom jest charakterystyczne dla

hipelipidemii typu III.



nośnik: bibuła, octan celulozy, agaroza, żel poliakrylamidowy



barwienie:

- czerwień olejowa O w 40-55% etanolu (najczęściej stosowana)
- czerń sudanowa B
- czerń amidowa

18



(lub) wytrącenie w żelu za pomocą polianionów

 ocena densytometryczna

Metody bezpośrednie



selektywna precypitacja z:

- siarczanem poliwinylu
- heparyną w niskim pH



metody wykorzystujące mieszaninę przeciwciał poliklonalnych przeciwko apo-AI i
apo-E związanych z żywicą, które wiążą i usuwają VLDL, IDL, HDL



metody z homogennymi reagentami - pomiar stężenia cholesterolu LDL (metodą
enzymatyczną) po zamaskowaniu cholesterolu związanego z frakcjami innymi niż
LDL (przeciwciała poliklonalne przeciwko apo-AI i apo-E)

Zakresy wartości stężeń cholesterolu frakcji HDL i LDL

Ryzyko choroby

wieńcowej

Cholesterol LDL

Cholesterol HDL

[mg/dL]

[mmol/L]

[mg/dL]

[mmol/L]

Kobiety

normalne

< 160

< 4,2

> 65

> 1,7

podwyższone

> 180

> 4,7

< 45

< 1,2

Mężczyźni

normalne

< 160

< 4,2

> 55

> 1,5

podwyższone

> 180

> 4,7

< 35

< 0,9

Wartości docelowe leczenia hipolipemicznego

Wynik badania

Ryzyko zawału

Docelowa wartość cholesterolu

LDL

Rozpoznana choroba
wieńcowa

Bardzo wysokie

< 100 mg/dL

Cholesterol > 300 mg/dL i
więcej niż jeden dodatkowy
czynnik ryzyka

Wysokie

< 130 mg/dL

Cholesterol 200-300 mg/dL i
jeden dodatkowy czynnik
ryzyka

Dość duże

< 155 mg/dL

Czynniki wpływające na stężenia cholesterolu frakcji LDL i HDL

LDL

HDL

Aktywność fizyczna

↓

↑

19

Brak aktywności fizycznej

↑

↓

Glikokortykoidy, androgeny,

β

-blokery, leki moczopędne

↑

↓

Estrogeny

N/↑

↑

Gestageny

↑

↓

Czynniki ryzyka choroby wieńcowej

 palenie papierosów
 nadciśnienie
 hipercholesterolemia
 niskie stężenie cholesterolu HDL
 płeć męska (w okresie pomenopauzalnym ryzyko u kobiet jest takie samo jak u

mężczyzn)

 cukrzyca
 wczesna choroba wieńcowa u bliskich krewnych
 choroba naczyń obwodowych i mózgowych u krewnych
 otyłość

Układ odniesienia dla wyników laboratoryjnych

 interpretacja stężeń lipidów i frakcji lipoproteinowych – ocena ryzyka zagrożenia

miażdżycą i chorobą niedokrwienna serca (wartości decyzyjne)



zalecane wartości decyzyjne: cholesterol całkowity < 200 mg/dL

Poziom

LDL

[mg/dL]

HDL

[mg/dL]

kobiety

HDL

[mg/dL]

mężczyźni

Pożądany

< 135

> 66

> 58

Graniczny

135-175

66-42

58-35

Wysokiego
ryzyka

> 175

< 42

< 35

Lipidowe czynniki ryzyka choroby wieńcowej

 cholesterol całkowity / cholesterol HDL > 5
 cholesterol LDL / cholesterol HDL > 4
 duże stężenie TAG przy niskim stężeniu cholesterolu HDL
 obecność małych gęstych LDL

Oznaczanie apolipoprotein
Metody:

 radioimmunologiczne
 immunoenzymatyczne
 immunodyfuzja radialna (metoda referencyjna)
 immunoturbidymetryczne

Zakresy wartości prawidłowych stężenia apolipoprotein

20

Apoproteina

Zakres normy [mg/dL]

Apo B100

50-130

Apo CI

110-205

Apo E

3-5

Apo CII

3-8

OZNACZANIE STĘŻENIA FOSFOLIPIDÓW

Metody chemiczne
I. 1. Ekstrakcja – odczynnikiem Bloora (etanol + eter etylowy), eterem naftowym,
izopropanolem, odczynnikiem Folcha (chloroform + metanol)
2. Hydroliza – uwolnienie fosforu i utlenienie fosforu organicznego do nieorganicznego
(HClO

4

, HNO

3

+ H

2

O

2

)

3. Reakcja barwna – reakcja fosforu nieorganicznego z molibdenianem amonu ->
fosfomolibdenian amonu -> reakcja z Zn

+2

do błękitu molibdenowego (660 nm)

II. 1. Wytrącanie fosfolipidów z białkami (TCA)

2. Utlenienie fosforu organicznego do fosforu nieorganicznego (HClO

4

)

3. Reakcja barwna

Metody enzymatyczne

 lecytyna – główny fosfolipid osocza
 fosfolipazy

- A

1

– uwalnia resztę acylową w pozycji

α

- A

2

– uwalnia resztę acylową w pozycji

β

- C – uwalnia resztę fosfocholiny
- D – uwalnia resztę choliny

1.

fofataza alkaliczna

fosfocholina + H

2

O cholina + P

i

kinaza choliny

cholina + ATP

fosfocholina + ADP

kinaza pirogronianowa

ADP + fosfoenolopirogronian

pirogronian + ATP

LDH

pirogronian + NADH+H

+

mleczan + NAD

+

2.

oksydaza choliny

cholina + 2O

2

+ H

2

O

betaina + H

2

O

2

H

2

O

2

+ fenol + 4-aminoantypiryna barwnik chinoiminowy + 2H

2

O

Pomiar: 500-550 nm (metoda z odczynnikiem Trindera, PAP)

Znaczenie kliniczne oznaczania fosfolipidów

 zakres wartości prawidłowych w osoczu

21

- fosfor fosfolipidów 6-11 mg/dL
- stężenie fosfolipidów 150-300 mg/dL
- stosunek cholesterol/fosfolipidy ≈ 0,98 (wzrasta z wiekiem do ok. 1,4)

 zwiększone stężenie fosfolipidów

- miażdżyca naczyń
- niewydolność wątroby
- cukrzyca



oznaczanie lecytyny w płynie owodniowym – ocena dojrzałości układu
oddechowego płodu

- stężenie > 5,1 mg/dL – prawidłowe dojrzewanie
- stężenie 4,7-5,1 mg/dL – zaburzenia dojrzewania

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (WKT)



ocena poheparynowej aktywności lipolitycznej osocza (aktywność LPL)



znaczenie w hiperlipoproteinemii typu I i V

 metoda miareczkowa

- ekstrakcja izopropanolem i heptanem
- miareczkowanie mianowanym roztworem NaOH wobec
wskaźnika (błękit tymolowy)



prawidłowe stężenie WKT w surowicy: 0,2-0,8 mmol/L



zwiększone stężenie WKT: cukrzyca, głodzenie, adrenalina, hormon wzrostu

22