ROZDZIELCZA CZASOWO DETEKCJA FOSFORESCENCJI

TLENU SINGLETOWEGO

Cel ćwiczenia:

a) Detekcja tlenu singletowego poprzez pomiar charakterystycznej fosforescencji przy

1268 nm.

b) Wyznaczenie stałej szybkości wygaszania tlenu singletowego przez

α-tokoferol

i

β-karoten.

c) Pomiar wydajności kwantowej generacji tlenu singletowego przez porfirynę.

Wprowadzenie

W

stanie

podstawowym

cząsteczka tlenu ma dwa elektrony na dwóch orbitalach

antywiążących л a ich spiny są równoległe.
Całkowity spin S cząsteczki tlenu wynosi zatem ½ + ½ = 1, a liczba poziomów energetycznych
(multipletowość) w zewnętrznym polu magnetycznym wynosi 2S + 1 = 3. Oznacza to, że tlen
w stanie podstawowym jest trypletem

3

O

2

(

3

Σ

g

-

). Większość związków organicznych, z którymi

tlen mógłby reagować w komórkach to związki w stanie singletowym: wszystkie elektrony ich
cząsteczek mają spiny sparowane i wypadkowy spin każdej cząsteczki tych związków równy jest
zeru. Aby cząsteczka tlenu w stanie trypletowym utleniła inną cząsteczkę i uległa
dwuelektronowej redukcji, musiałaby przyjąć od utlenianej cząsteczki dwa elektrony. Zgodnie
z prawami mechaniki kwantowej, oba te elektrony musiałyby mieć równoległe spiny,
antyrównoległe w stosunku do spinów dwóch niesparowanych elektronów na antywiążących
orbitalach л

x

* i л

y

*. Innymi słowy, wymaga to, by utleniana cząsteczka była również w stanie

trypletowym, bądź też by nastąpiło odwrócenie spinu jednego z elektronów takiej cząsteczki (co
jest procesem silnie wzbronionym). Dlatego też możliwości reakcji cząsteczki tlenu są
ograniczone; W reakcjach z wieloma cząsteczkami, które mogą ulegać utlenieniu, tlen jest
znacznie mniej reaktywny niż by to wynikało z termodynamiki tych procesów. Tlen
cząsteczkowy staje się o wiele bardziej reaktywny po wzbudzeniu elektronowym do stanu
singletowego (

1

∆

g

,

3

Σ

g

+

). Podwyższenie reaktywności tlenu w stanie singletowym wynika

zarówno ze zniesienia zakazu spinowego w reakcjach z cząsteczkami w stanie singletowym, jak
i z nadmiaru energii, którą cząsteczka tlenu singletowego, jako elektronowo wzbudzona posiada.
Poziomy energetyczne tlenu w stanie singletowym wynoszą 92,4 kJ/mol i 159,6 kJ/mol
odpowiednio dla

1

∆

g

i

3

Σ

g

+

powyżej stanu podstawowego.

W układach biologicznych tlen singletowy (

1

O

2

) może być produkowany w wyniku

reakcji kwasu podchlorawego z nadtlenkiem wodoru lub w reakcjach fotouczulanych
(fotosensybilizowanych). W przypadku reakcji fotosensybilizowanych tlen singletowy
generowany jest w procesie transferu energii ze stanu trypletowego wzbudzonej cząsteczki
fotouczulacza (

3

S) na tlen cząsteczkowy w stanie podstawowym (

3

O

2

):

S + h

ν →

1

S

→

3

S

3

S +

3

O

2

→ S +

1

O

2

W układach skondensowanych czas życia cząsteczki tlenu w stanie

1

∆

g

jest około 10

4

razy

dłuższy niż w stanie

3

Σ

g

+

. Dlatego w typowych reakcjach chemicznych z udziałem tlenu

singletowego znaczenie będzie miał przede wszystkim stan

1

∆

g

i do cząsteczki tlenu w tym

właśnie stanie odnosi się nazwa „tlen singletowy” (

1

O

2

). Tak długi czas życia we wzbudzonym

stanie singletowym (10

-6

- 10

-1

s w zależności od rozpuszczalnika) wynika z reguł wyboru dla

przejść elektronowych według których przejście

1

∆

g

→

3

Σ

g

-

jest silnie wzbronione nie tylko ze

względu na to, że jest to przejście międzysystemowe pomiędzy stanami o różnej multipletowości
(przejście singlet

→ tryplet) ale również ze względu na reguły wyboru dotyczące parzystości

i symetrii.

Dezaktywacja tlenu singletowego do stanu podstawowego zachodzi na drodze

promienistej

− fosforescencji oraz bezpromienistej − przejścia międzysystemowego

z wydzieleniem ciepła.

Fosforescencja

1

O

2

→

3

O

2

+ h

ν

k

R

[

1

O

2

]

Dezaktywacja bezpromienista

1

O

2

→

3

O

2

+ ciepło

k

NR

[

1

O

2

]

Naturalny czas życia

τ

∆

0

związany jest ze stałymi szybkości tych obu procesów:

τ

∆

0

= (k

R

+ k

NR

)

-1

Fosforescencja tlenu singletowego charakteryzuje się maksimami przy 1270 nm (przejście

na najniższy poziom oscylacyjny (0,0)) i 1580 nm (przejście na pierwszy wzbudzony poziom
oscylacyjny (0,1)). W większości rozpuszczalników dominują przejścia bezpromieniste a k

R

silnie zależy od rodzaju rozpuszczalnika a w szczególności od jego polarności. Woda należy do
rozpuszczalników, w których k

R

jest najniższe i tylko jedna cząsteczka

1

O

2

na milion ulega

dezaktywacji na drodze fosforescencji. Szybkość dezaktywacji na drodze bezpromienistej
również zależy od rodzaju rozpuszczalnika. W obecności ciężkich atomów wzrasta

prawdopodobieństwo przejścia interkombinacyjnego do stanu podstawowego. Najdłuższe czasy
życia

1

O

2

obserwuje się w rozpuszczalnikach zawierających atomy chlorowców, natomiast wraz

ze wzrostem liczby atomów wodoru w cząsteczkach rozpuszczalnika

τ

∆

0

ulega skróceniu.

Najkrótsze wartości

τ

∆

0

przyjmuje w roztworach zawierających grupy hydroksylowe. I tak,

w wodzie

τ

∆

0

przyjmuje najniższą wartość,

τ

∆

0

= 3,3

µs podczas gdy podstawienie atomów

wodoru deuterem powoduje wydłużenie tego czasu życia do około 60

µs, a w przypadku

rozpuszczalnika pozbawionego atomów wodoru czas życia

1

O

2

jest o kilka rzędów wielkości

większy, np. dla C

2

F

3

Cl

τ

∆

0

= 0,1 s.

Wydajność kwantowa generacji tlenu singletowego

Φ

1O2

w reakcjach fotouczulanych

zależy od wydajności kwantowej przejścia interkombinacyjnego fotosensybilizatora

Φ

isc

≡

Φ

T

oraz od efektywności transferu energii z cząsteczki fotosensybilizatora w stanie trypletowym na
cząsteczki tlenu w stanie podstawowym f

T

Σ

.

Φ

1O2

= f

T

Σ

Φ

isc

f

T

Σ

określa jaka część stanów trypletowych fotouczulacza ulega dezaktywacji na drodze transferu

energii wzbudzenia na cząsteczki tlenu i może być wyrażona jako stosunek szybkości tego
procesu k

T

Σ

[O

2

] do sumy szybkości wszystkich procesów prowadzących do dezaktywacji:

gdzie

τ

T

i

τ

T

0

oznaczają czasy życia stanu trypletowego odpowiednio w obecności i pod

nieobecność tlenu. Widać zatem, że

Φ

1O2

zależy nie tylko od własności samego fotouczulacza

(

Φ

isc

) ale również od lokalnego stężenia tlenu, naturalnego czasu życia trypletu oraz lepkości

ośrodka. Wydajność kwantowa generacji

1

O

2

osiąga górną granicę

Φ

1O2

=

Φ

isc

o ile w ośrodku

występuje wysokie stężenie tlenu, a stała szybkości k

T

Σ

przyjmuje odpowiednio duże wartości,

tak, żeby w czasie życia stanu trypletowego doszło do jego oddziaływania z tlenem. Jeśli czas
życia stanu trypletowego cząsteczki fotosensybilizatora

τ

T

0

jest krótki i znajduje się on w ośrodku

lepkim lub przy małej dostępności tlenu, wówczas generacja tlenu singletowego jest procesem
mało wydajnym.

W przypadku fotosensybilizatorów o wystarczająco długim czasie życia w stanie

singletowym (> 1 ns), tlen cząsteczkowy może wygaszać również stan singletowy na trzy
sposoby:

1) Dezaktywacja indukowana tlenem:

1

S +

3

O

2

→ S +

3

O

2

;

2) Indukowane tlenem przejście interkombinacyjne:

1

S +

3

O

2

→

3

S +

3

O

2

;

3) Transfer

energii:

1

S +

3

O

2

→

3

S +

1

O

2

.

f

k

O

k

k

k

O

k

O

k

O

k

O

T

T

P

isc

T

T T

T T

T T

T

Σ

Σ

Σ

Σ

Σ

Σ

=

+

+

=

=

+

[

]

[

]

[

]

[

]

[

]

3

2

3

2

3

2

0

3

2

0

3

2

1

τ

τ

τ

O ile dezaktywacja indukowana tlenem zazwyczaj nie ma większego znaczenia,

oddziaływanie tlenu ze wzbudzonymi stanami singletowymi sensybilizatora prowadzi do
zwiększenia

Φ

1O2

poprzez: 1) zwiększenie prawdopodobieństwa przejścia interkombinacyjnego

(a zatem zwiększa się populacja cząsteczek fotosensybilizatora w stanie trypletowym), 2) transfer
energii (jeśli tylko przerwa energetyczna pomiędzy wzbudzonym stanem singletowym
i trypletowym cząsteczki fotosensybilizatora jest większa niż 94,6 kJ/mol, czyli niż energia
wzbudzenia tlenu w stanie

1

∆

g

). W wyniku transferu energii generowany jest tlen singletowy oraz

stan trypletowy fotosensybilizatora, który może przekazać swoja energię wzbudzenia na następną
cząsteczkę tlenu, a zatem pochłonięcie pojedynczego fotonu może spowodować generację
dwóch cząsteczek

1

O

2

. Gdy w układzie zachodzi wygaszanie stanów singletowych przez tlen,

wówczas

Φ

1O2

zależy w sposób złożony od stężenia tlenu i może osiągać graniczną wartość

równą 2. Analogicznie jak w przypadku wygaszania stanów trypletowych fotouczulacza można
wprowadzić parametr f

S

Σ

. Ze względu na znacznie krótsze czasy życia stanów singletowych niż

trypletowych, w większości przypadków f

S

Σ

jest znacznie mniejsze niż 1.

Opis metody i jej wybranych zastosowań

Rozdzielcza czasowo detekcja fosforescencji tlenu singletowego w podczerwieni

stosowana jest w celu monitorowania fotosensybilizowanej generacji

1

O

2

oraz jego zaniku.

Ideowy schemat układu do monitorowania fosforescencji próbki po impulsie lasera
przedstawiony jest na Rys. 1. Próbka zawierająca fotouczulacz oraz tlen w znanym stężeniu
znajduje się w kuwecie fluorescencyjnej. Detektor germanowy ustawiony jest pod kątem 90

°

w

stosunku do wiązki wzbudzającego promieniowania laserowego. Pomiędzy próbką

a powierzchnią czynną detektora znajdują się odpowiednie filtry mające za zadanie
zminimalizować rozproszone promieniowanie lasera lub fluorescencję próbki. I tak, filtr
krzemowy absorbuje promieniowanie poniżej 1100 nm, natomiast filtr interferencyjny
przepuszcza wąski zakres spektralny promieniowania z maksimum transmisji przy 1270 nm.

Rys. 1. Schemat ideowy (A) oraz uproszczony schemat układu pomiarowego (B) do rozdzielczej czasowo detekcji

charakterystycznej fosforescencji

1

O

2

przy 1270 nm. P – kuweta fluorescencyjna z próbką; OPO – optyczny

oscylator parametryczny; ; Z- zwierciadła dichroiczne; M/D – mieszacz/podwajacz częstości; FD – fotodioda; F1 –

filtr szary do regulacji energii promieniowania i/lub filtr pochłaniający promieniowanie o niepożądanej długości fali;

L – soczewki formujące wiązkę lasera; F2 – filtr krzemowy obcinający promieniowanie o

λ< 1100 nm oraz filtr

interferencyjny z maksimum transmisji przy 1270 nm.

Czas życia tlenu singletowego

τ

w danym rozpuszczalniku można wyznaczyć z analizy

kinetyki zaniku intensywności fosforescencji w czasie. W tym celu do danych doświadczalnych
dopasowuje się krzywą eksponencjalną:

I(t) = I

0

exp(-kt)

gdzie I

0

jest początkową intensywnością fosforescencji ekstrapolowaną do czasu zakończenia

błysku lasera, natomiast k =

τ

-1

jest stałą szybkości zaniku intensywności fosforescencji.

W warunkach gdy w próbce znajduje się dodatkowo substrat Q, reagujący z

1

O

2

na drodze

reakcji chemicznej lub wygaszania fizycznego, wówczas pomiar obserwowanej szybkości zaniku
fosforescencji (k) w zależności od stężenia substratu pozwala na wyznaczenie

stałej szybkości

gaszenia k

Q

będącej sumą stałych szybkości wszystkich oddziaływań substratu z

1

O

2

natury

zarówno chemicznej jak i fizycznej:

k([Q]) =

τ

-1

+ k

Q

[Q]

Wydajność kwantową generacji tlenu singletowego

Φ

1O2

przez badany związek można

wyznaczyć metodą porównawczą przy pomocy detekcji fosforescencji

1

O

2

. W tym celu stosuje

się standard - fotosensybilizator o znanej

Φ

1O2

w stężeniu odpowiadającym identycznej

absorbancji przy długości fali impulsu wzbudzającego jak próbka ze związkiem o nieznanej

Φ

1O2

. W ten sposób zapewnia się warunki, w których liczba fotonów pochłoniętych przez

obydwie próbki będzie identyczna. Aby wyznaczyć

Φ

1O2

przeprowadza się pomiar początkowych

intensywności fosforescencji I

0

dla obu próbek przy różnych energiach impulsu wzbudzającego.

Jest to konieczne gdyż w przypadku gdy generowane jest odpowiednio duże stężenie stanów
trypletowych w próbce będą one ulegać dezaktywacji w wyniku oddziaływania tryplet-tryplet, a
co za tym idzie ich czas życia będzie krótszy i mniejsze prawdopodobieństwo transferu energii na
cząsteczkę tlenu. Co więcej, przy większych energiach impulsów może dochodzić do procesów
dwufotonowych. Do obliczeń bierze się pod uwagę jedynie te początkowe intensywności
fosforescencji I

0

, które w sposób liniowy rosną wraz ze wzrostem energii lasera. Stosunek

nachyleń obu prostych jest równy stosunkowi wydajności kwantowych obu próbek.

Wykonanie ćwiczenia

1.

Pomiar stałej szybkości wygaszania tlenu singletowego przez

β

-karoten i

α

-tokoferol

Odczynniki:
Roztwory wyjściowe tetra-fenylo-porfiryny,

α-tokoferolu (c

TOC

= 5

×10

-3

M) i

β-karotenu (c

CAR

=

5

×10

-5

M) w benzenie.

Materiały:
Kwarcowe kuwety spektrofotometryczne i fluorescencyjne
Pipety i końcówki

Aparatura:
Spektrofotometr diodowy
Układ do detekcji rozdzielczej-czasowo fosforescencji przy 1270 nm

a) Zmierz widma absorpcji roztworów porfiryny,

α-tokoferolu i β-karotenu w benzenie.

b) Wybierz długość fali promieniowania wzbudzającego tak aby absorbancja porfiryny przy tej

długości fali mieściła się w zakresie 0,05-0,20, natomiast wkład absorpcji wygaszaczy był
możliwie najmniejszy.

Długośc fali promieniowania wzbudzającego:

λ

ex

= ......... nm

Absorbancja porfiryny przy

λ

ex

w 1 cm kuwecie:

A = ............

Początkowa objętość

próbki:

V

0

= ..............

µl

c) Zmierz kinetykę powstawania i zaniku luminescencji emitowanej przez próbkę po impulsie
lasera. Dopasuj do punktów pomiarowych zaniku intensywności emisji I w czasie t krzywą
eksponencjalną:

I(t) = I

0

exp(-kt)

d) Dodaj do próbki

α-tokoferol (np. 1% objętości V

0

) i powtórz krok c).

e) Powtarzaj pomiary zwiększając za każdym razem stężenie

α-tokoferolu dopóki nie

zaobserwujesz wyraźnego skrócenia czasu życia fosforescencji

1

O

2

.

f) Powtórz kroki c-e stosując jako wygaszacz

β-karoten.

Szybkość zaniku fosforescencji

k (s

-1

)

∆

V

Q

(

µl)

V

Q

(

µl)

Q

≡ α-tokoferol

Q

≡ β-karoten

∆

V

Q

– dodana objętość roztworu wygaszacza do próbki

V

Q

– całkowita objętość roztworu wygaszacza w próbce

g) Wyznacz stężenie wygaszaczy w poszczególnych próbkach:
h) Narysuj wykresy przedstawiające zależność stałej szybkości zaniku

1

O

2

k od stężenia

wygaszaczy

[Q]. Do punktów pomiarowych dopasuj prostą i wyznacz nieznane paramtery:

τ

-

naturalny czas życia tlenu singletowego w benzenie; k

Q

- stałą szybkości oddziaływania tlenu

singletowego z wygaszaczem Q.

k ([Q])=

τ

-1

+ k

Q

[Q]

2. Wyznaczanie wydajności kwantowej generacji tlenu singletowego metodą pośrednią.
Odczynniki:
Roztwory wyjściowe tetra-fenylo-porfiryny (TPP) stosowanej jako standard oraz wybranej
pochodnej porfiryny (PORF) o nieznanej

Φ

1O2

.

Materiały:
Kwarcowe kuwety fluorescencyjne
Pipety i końcówki
Zestaw filtrów szarych wraz z widmami transmisji i danymi liczbowymi

Aparatura:
Spektrofotometr diodowy
Układ do detekcji rozdzielczej-czasowo fosforescencji przy 1270 nm

a) Zmierz widma absorpcji próbek TPP oraz PORF. Dobierz długość fali promieniowania

wzbudzającego

λ

ex

w ten sposób by absorbancja przy

λ

ex

była jednakowa dla obu próbek i

mieściła się w zakresie 0,05 - 0,10 (jeśli to konieczne rozcieńcz próbki).

Długość fali promieniowania wzbudzającego:

λ

ex

= .......... nm

Absorbancja przy

λ

ex

w 1 cm kuwecie:

A = ............

b) Wybierz zestaw 6-10 filtrów pozwalający zmieniać natężenie promieniowania

wzbudzającego w zakresie od kilku do 90% dla wybranej

λ

ex

.

c) Zbierz kinetyki zaniku fosforescencji emitowanej przez próbki po impulsie lasera przy

różnych energiach impulsu wzbudzajacego dla obu próbek.

d) Dla wszystkich zmierzonych kinetyk dopasuj do punktów pomiarowych zaniku

intensywności emisji I w czasie t krzywą eksponencjalną:

[ ]

Q

c V

V

V

Q Q

Q

=

+

0

I(t) = I

0

exp(-kt)

i wyznacz początkową wartość intensywności fosforescencji I

0

ekstrapolując krzywą

eksponencjalną do czasu zakończenia błysku lasera. Wyniki wpisz do tabelki.

Początkowa intensywność fosforescencji I

0

(V)

Energia

lasera

(%)

TPP

PORF

e) Narysuj wykres zależności I

0

od energii impulsu wzbudzającego E(%) dla TPP i PORF. W

obszarze liniowego wzrostu I

0

(E) dopasuj do puntków doświadczalnych proste i wyznacz

współczynniki ich nachylenia a

TPP

i a

PORF

. Oblicz wydajność kwantową generacji tlenu

singletowego przez PORF korzystając ze związku:

Φ

PORF

=

Φ

TPP

×

a

PORF

/a

TPP

gdzie

Φ

TPP

= 0,63 w benzenie w równowadze z powietrzem (Bonnett et al., Photochem.

Photobiol. 48: 271-276, 1988).

Literatura:
Paszyc, S.: "Podstawy fotochemii", PWN, Warszawa, 1992.
Sarna, T.: Udział tlenu singletowego i wolnych rodników w reakcjach fotouczulanych
i zjawiskach fotodynamicznych. Zagadnienia Biofizyki Współczesnej 14(1): 5-30, 1989.
Bartosz, G.: "Druga twarz tlenu" PWN, Warszawa, 1995.