KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska

ZADANIA TEORETYCZNE

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

1

ZADANIE 1: H

odowle ciągłe

W ciągłych hodowlach drobnoustrojów po wstępnym namnożeniu mikroorganizmów

rozpoczyna się stałe zasilanie hodowli świeżą pożywką z jednoczesnym odbiorem płynu
hodowlanego, przy zachowaniu stałej objętości cieczy w fermentorze.
Ze

względu na sposób kontroli i kierowania procesem hodowli ciągłej wyróżniamy dwie główne

metody jej prowadzenia oparte na:

a) zasadzie turbidostatu-

ze stałym stężeniem biomasy

b) zasadzie chemostatu-

ze stałą szybkością rozcieńczania.

Na rysunku 1 przedstawion

o schemat układu do hodowli ciągłej drobnoustrojów. W reaktorze

tego typu zakłada się idealny stan wymieszania, w wyniku czego skład płynu hodowlanego i
temperatura są w każdym punkcie reaktora identyczne. Na rysunku 2 przedstawiono graficzną
interpretację zależności pomiędzy parametrami pracy fermentora, a więc produktywnością (Dx),
szybkością rozcieńczania (D), stężeniem biomasy (x) i stężeniem substratu (S). Produktywność
jest to masa drobnoustrojów przypadająca na jednostkę objętości i jednostkę czasu [kg/(l* h)].
Stężenie biomasy i substratu jest praktycznie niezmienne w szerokich granicach wartości
szybkości rozcieńczania. Zbliżając się do wartości D

max

układ staje się niestabilny i nawet

niewielkie zmiany wartości szybkości rozcieńczania mogą powodować znaczne zmiany stężenia
biomasy i substratu. Produktywność biomasy osiąga swoje maksimum w zakresie wysokich
wartości D, w granicach których układ nie wykazuje dostatecznej stabilności.

Rys. 1. Ogólny schemat bioreaktora (chemostat)

Rys. 2.

Stężenie substratu (S), biomasa (x) i produktywność (Dx) jako funkcje szybkości rozcieńczenia

dopływ

odpływ

dopływ powietrza

odpływ powietrza

pompa

pompa

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska

ZADANIA TEORETYCZNE

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

2

Podstawową różnicą hodowli ciągłej w porównaniu z hodowlą okresową jest brak fazowości
wzrostu. Hodowle ciągłe wykazują wiele zalet w porównaniu z procesami okresowymi:

a)

wyeliminowanie zmian warunków hodowli w czasie jej trwania

b)

możliwość prowadzenia hodowli w dowolnie długim czasie

c)

możliwość regulacji stanu fizjologicznego drobnoustrojów

d)

jednorodność składu fizycznego i chemicznego hodowli

e)

możliwość automatyzacji

f)

możliwość eliminacji oddzielenia komórek od medium.

Mimo tych korzyści procesy ciągłe nie są powszechnie wykorzystywane w praktyce
przemysłowej. Przykładowo nadają się lepiej do otrzymywania biomasy i metabolitów
pierwotnych, gorzej z produkcją metabolitów wtórnych.

Problemy z prowadzeniem hodowli ciągłych wiążą się również z innymi trudnościami:
a)

możliwością degeneracji szczepów lub opanowania hodowli przez mutanty o gorszych
własnościach technologicznych

b)

wypieraniem mikroorganizmów charakteryzujących się powolnym wzrostem przez
niepożądane drobnoustroje szybciej dzielące się

c)

problemami z utrzymaniem aseptycznych warunków

d)

niesprzyjającymi warunkami produkcji niektórych substancji wytwarzanych przez komórki nie
rosnące

e) tworzeniem przez drobnoustroje wiel

okomórkowych agregatów, kłaczków oraz zarastaniem

ścian fermentora i przewodów.

2A. HODOWLA CIĄGŁA – PRZYGOTOWANIE I PROWADZENIE

Założono hodowlę szczepu Acinetobacter sp. w pożywce mineralnej z dodatkiem 2 mM

2-metylofenolu

jako jedynego źródła węgla w reaktorze o objętości 1 litra. Hodowlę inkubowano

w temperaturze pokojowe

j ze stałą prędkością mieszania 130 rpm, przy napowietrzaniu 1,5

l/min.

Po zaszczepieniu pożywki monitorowano gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji

przy



= 600 nm

oraz stężenie 2-MP poprzez pomiar metodą z p-nitroaniliną. Pomiary

wykonywano co 45 minut. Jednocześnie co 45 minut pobierano określoną hodowli bakteryjnej i
oznaczano suchą masę bakterii metodą filtracji na sączkach membranowych. Wyniki
umieszczono w tabeli I.

Na posta

wie przyrostu biomasy w fazie wykładniczego wzrostu obliczono maksymalną

właściwą szybkość wzrostu



max,

szybkość rozcieńczania D (przyjąć wartość D na poziomie 50%



max

) oraz natężenie przepływu pożywki F, opierając się na poniższych informacjach:

Wzrost

nieograniczony drobnoustrojów przebiega zgodnie z kinetyką procesów auto-

katalitycznych (reakcja I rzędu), w których szybkość jest wprost proporcjonalna do stężenia
autokatalizatora. W hodowli autokatalizatorem są komórki drobnoustrojów (o łącznej masie x

1

),

można więc napisać:



x/



t =



* x

1

, stąd po przekształceniu



= (1/x

1

) *



x/



t

, a także:



x/



t =(x

2

-x

1

) / (t

2

- t

1

)

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska

ZADANIA TEORETYCZNE

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

3

gdzie:



x/



t -

szybkość wzrostu, kg /h



-

właściwa szybkość wzrostu, 1 /h

x

1

–ilość biomasy w bioreaktorze w czasie t

1

, kg

x

2

–ilość biomasy w bioreaktorze w czasie t

2

, kg

t

1

- czas pierwszego pomiaru biomasy, h

t

2

- czas drugiego pomiaru biomasy, h

W chemostacie wielkością stałą jest szybkość rozcieńczania D, czyli stosunek wartości
objętościowego natężenia przepływu pożywki do objętości pożywki w fermentorze.

D = F / V,

stąd po przekształceniu F = D * V

gdzie:
F -

objętościowe natężenie przepływu pożywki, dm

3

/h

V -

objętość pożywki w fermentorze, dm

3

D -

szybkość rozcieńczania, l/h

Ponieważ założono D na poziomie 50% więc:

F=0,5 *



max

* V

Wartość natężenia przepływu pożywki wyliczoną z powyższego wzoru ustawiono na

pompie dozującej pożywkę do biostatu i odbierającej jednocześnie płyn hodowlany.

Od momentu rozpoczęcia hodowli ciągłej w odstępach 20-cio minutowych oznaczano

gęstość hodowli poprzez pomiar absorbancji przy



= 600 nm oraz

stężenie 2-MP metodą

z p-

nitroaniliną. Wyniki umieszczono w tabeli II. Na zakończenie prowadzenia hodowli ciągłej

pobrano

20 ml hodowli do oznaczenia biomasy metodą filtracji w celu wyznaczenia

współczynnika wydajności biomasy (Y). Masa suchego sączka wynosiła 0,0987 g, a masa
sączka z bakteriami 0,1062 g.

W trakcie procesu ciągłego w fermentorze wartością stałą jest także współczynnik

wydajności biomasy Y, który wiąże szybkość wzrostu z szybkością zużycia substratu. Opisuje
on więc, jaką biomasę można otrzymać po dostarczeniu do fermentora jednostkowej masy
substratu. W praktyce współczynnik ten jest mniejszy od 1, ponieważ substrat zużywany jest nie
tylko do produkcji biomasy, ale także spalany w celu dostarczenia energii. Oblicza się go ze
wzoru:

Y = -



X /



S = - (X

2

– X

1

) / (S

2

– S

1

)

gdzie:
Y -

wydajność biomasy



X -

ilość biomasy powstałej w procesie, kg



S -

ilość substratu zużytego w procesie, kg

X

1

-

ilość biomasy w pożywce mineralnej, kg

X

2

-

ilość biomasy w odpływie, kg

S

1

-

ilość substratu w pożywce mineralnej, kg

S

2

-

ilość substratu w odpływie, kg

Na podstawie otrzymanych wyników oceń, czy hodowla ciągła została założona prawidłowo.
Czy można wyznaczyć współczynnik wydajności biomasy przy tak założonej hodowli.
Odpowiedzi uzasadnij.

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska

ZADANIA TEORETYCZNE

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

4

Tabela I

Czas,

min

A

600

A

550

Rozc.

V hodowli, ml

masa sączka, g masa sączka + bakterie, g

0

0,114

0,250

10

20

0,0859

0,0862

45

0,125

0,220

10

22

0,0988

0,0990

90

0,156

0,198

10

21

0,0904

0,0928

135

0,185

0,141

10

20

0,0897

0,0901

180

0,255

0,100

10

18

0,0971

0,1008

225

0,325

0,052

5

19

0,0936

0,1019

270

0,401

0,019

1

20

0,0901

0,0987

315

0,419

0,006

1

21

0,0892

0,0978

360

0,433

0,003

1

20

0,0979

0,1082

405

0,407

0,009

1







Tabela II

Czas,

min

A

600

A

550

Rozc.

0

0,408

0,257

2

20

0,411

0,223

2

40

0,395

0,301

1

60

0,336

0,358

1

80

0,301

0,151

2

10

0,298

0,118

2

120

0,258

0,351

1

140

0,201

0,258

1

160

0,198

0,408

1

180

0,135

0,397

1

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska

ZADANIA TEORETYCZNE

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

5

ZADANIE 2:

Wyznaczanie wzrostu bakterii metodą płytkową – zadanie teoretyczne

Prowadzono hodowle periodyczne szczepu Bacillus subtilis

. w pożywce mineralnej

z dodatkiem wybranego substratu aromatycznego przez okres 12

godzin. Co godzinę

wykonywano szereg rozcieńczeń w soli fizjologicznej i z odpowiednich rozcieńczeń wysiewano
po 100



l hodowli na płytki agarowe. Po upływie 24 godzin liczono wyrosłe kolonie. Wyniki

przedstawiono w tabeli IIIa i IIIb.

Uzupełnij tabele wykonując odpowiednie obliczenia, narysuj krzywą wzrostu szczepu

Bacillus subtilis

w pożywce mineralnej z dodatkiem wybranego substratu aromatycznego oraz

oblicz liczbę podziałów, częstość podziałów i wiek osobniczy szczepu Bacillus subtilis w tych
warunkach prowadzenia hodowli.

Tabela IIIa

Czas

prowadzenia

hodowli, h

Rozcieńczenie

CFU

CFU/1 ml

Średni CFU/1 ml

Log CFU/ 1 ml

0

10

-2

305

10

-3

95

10

-4

35

1

10

-2

388

10

-3

101

10

-4

36

2

10

-4

278

10

-5

99

10

-6

37

3

10

-5

305

10

-6

188

10

-7

39

4

10

-6

248

10

-7

101

10

-8

12

5

10

-6

259

10

-7

159

10

-8

11

6

10

-6

277

10

-7

143

10

-8

29

KATEDRA BIOCHEMII

Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska

HODOWLA CIĄGŁA

DROBNOUSTROJÓW-

PRZYGOTOWANIE

PODSTAWY

BIOTECHNOLOGII

6

Tabela IIIb

Czas

prowadzenia

hodowli, h

Rozcieńczenie

CFU

CFU/1 ml

Średni CFU/1 ml

Log CFU/ 1 ml

7

10

-6

297

10

-7

159

10

-8

29

8

10

-8

420

10

-9

289

10

-10

57

9

10

-10

257

10

-11

45

10

-12

5

10

10

-10

214

10

-11

87

10

-12

12

11

10

-10

201

10

-11

55

10

-12

16

12

10

-10

197

10

-11

55

10

-12

15