laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2007

26

Streszczenie
Dwuczęściowy artykuł poświęcony jest ogólnej charakterystyce
bakterii Escherichia coli, a także metodom jej wykrywania w żyw-
ności. W pierwszej części omówione zostały właściwości bioche-
miczne tego mikroorganizmu na tle innych przedstawicieli rodziny
Enterobacteriaceae, a także podział szczepów chorobotwórczych
ze względu na mechanizm ich oddziaływania na organizm człowie-
ka. Druga część obejmuje obecnie stosowane metody detekcji tych
bakterii, a także zasięg występowania patogenów w żywności.

Summary
This two-part article presents the general characteristics of
a bacterium Escherichia coli, as well as the methods for its de-
tection in food. In the first part, the biochemical properties of this
microorganism compared with other Enterobacteriaceae bacteria
were discussed, the division of E. coli pathogenic strains for the
sake of the mechanism of pathogenicity and virulence factors was
showed. The second part includes currently applied methods for
E. coli detection and the range of occurrence in food.

Słowa kluczowe
Escherichia coli, serotyp O157, EHEC, podłoża chromogenne

Key words
Escherichia coli, serotype O157, EHEC, chromogenic media

Escherichia coli

Charakterystyka i wykrywanie w żywności – cz. II

dr inż. Paweł Satora

Katedra Technologii Fermentacji
i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza w Krakowie

Wykrywanie i identyfikacja bakterii E. coli

Normy wykorzystujące syntetyczne substraty chromogenne do wy-
krywania bakterii z gatunku E. coli wprowadzono po raz pierwszy
w 1990 roku w Stanach Zjednoczonych. Metody te szybko znalazły
swoje zastosowanie również w innych krajach. Procedury obejmowały
użycie dwóch aktywnych substratów: o-nitrofenylo-β-D-galaktopirano-
zydu (ONPG) oraz 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronianu (MUG).
Większość szczepów pałeczki okrężnicy (podobnie jak inne bakterie
z grupy coli) wytwarza enzym β-galaktozydazę, który hydrolizuje
ONPG, w wyniku czego uwalniają się żółty o-nitrofenol oraz galak-
toza. Jednocześnie bakterie E. coli (przyjmuje się, że 97% wszystkich
szczepów) charakteryzują się aktywnością innego enzymu β-gluku-

ronidazy, który rozkłada MUG, tworząc fluorescencyjny związek.
W rodzinie Enterobacteriaceae jedynymi innymi mikroorganizmami
zdolnymi do syntezy β-glukuronidazy są niektóre kultury z rodzaju
Salmonella, Shigella oraz Yersinia. Właściwości do rozkładu MUG
mogą dodatkowo również posiadać przedstawiciele innych rodzin
bakteryjnych, jak np. szczepy Staphylococcus. Ponieważ zastosowanie
wyżej wymienionych substratów jest skuteczną metodą wykrywania
bakterii E. coli, a oprócz tego odznaczają się dużą szybkością i czuło-
ścią, liczne firmy rozpoczęły produkcję podłoży zawierające ONPG
i MUG lub ich pochodne. Przykładem mogą być pożywki do testu
Colilert (Environetics), LST-MUG (Hach), Colitrack-plus (BioControl
Systems), LMX (Merck) i inne.

fot. Shutt

er

st

ock

27

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2007

27

Hydroliza z udziałem β-glukuronidazy wykorzystana została również

w nowszych podłożach zawierających inny substrat chromogenny,
tzw. X-Glu, czyli 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-glukopiranozyd. Pod
wpływem enzymu rozkłada się on do 5-bromo-4-chloro-hydroksyindolu
oraz glukozy, z których ten pierwszy ulega dalej przekształceniom
w niebieski barwnik – pochodną indygo. X-Glu stanowi składową agaru
chromogennego TBX, wykorzystywanego w horyzontalnej metodzie
oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich bakterii E. coli (PN-ISO
16649:2004).

W przypadku mniej specyficznych oznaczeń (NPL) wykorzystuje się

podłoża niezawierające w swoim składzie chromogenów. Przykładem
może być norma PN-ISO 7251:2006, zgodnie z którą do oznaczeń
wykorzystuje się bulion EC. W swoim składzie zawiera on laktozę
promującą wzrost jedynie laktozododatnich bakterii, zwłaszcza bakte-
rii z grupy coli, w tym E. coli. Równocześnie sole żółciowe eliminują
z posiewu bakterie Gram-dodatnie oraz te mikroorganizmy, które nie
są przystosowane do wzrostu w warunkach panujących w jelitach.
Wynikiem pozytywnym oznaczeń jest pojawienie się gazu powstają-
cego w wyniku metabolizowania laktozy. Oznaczenie przeprowadza
się w dwóch temperaturach 35°C i 44,5°C, przy czym w obu rozwijać
się mogą głównie komórki E. coli. Analiza potwierdzona może zostać
testem na zdolność do tworzenia indolu.

Serotypy E. coli O157 wykazują większość typowych cech dla gatunku

E. coli, w przeciwieństwie do pozostałych serotypów nie fermentują
jednak sorbitolu w ciągu 24 godzin. Cecha ta została wykorzystana
w normie PN-EN ISO 16654:2002. Analizy opisujące wykrywanie
serotypu O157 w żywności i paszach są kilkuetapowe. Początkowo
bakterie z testowanej próbki namnaża się przez 6-8 godzin w bulionie
tryptonowo-sojowym wzbogaconym w nowobiocynę – antybiotyk
działający głównie na bakterie Gram-dodatnie. Następnie z zawiesiny
wychwytuje się komórki E. coli O157 przy użyciu cząstek magne-
tycznych spłaszczonych przeciwciałami przeciw temu serotypowi
i separatora magnetycznego. W trzecim etapie wyosobnione bakterie
przepłukuje się odpowiednim buforem, zawiesza w nim, a uzyskaną
zawiesinę wysiewa na dwie agarowe pożywki selektywne. Norma zaleca
stosowanie podłoża McConkeya z sorbitolem (SMAC) i dodatkowymi
czynnikami selektywnymi – cefiksimem i tellurynem potasu. Substancje
te ograniczają wzrost mikroflory (Proteus, Providencia, Morganella),
która wykazuje brak zdolności do fermentacji sorbitolu, podobnie

fot. Shutt

er

st

ock

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2007

28

Pożywka

Zastosowanie

Charakterystyka wzrostu

Skład

Agar

chromogenny

TBX

(Merck)

Pożywka do wykrywania i oznaczania liczby

bakterii Escherichia coli w żywności, paszy

i wodzie. Wzrost towarzyszącej mikroflory Gram-

-dodatniej jest hamowany dzięki zastosowaniu

wysokiej temperatury inkubacji 44°C, wstępna

inkubacja 37°C lub 30°C.

E. coli – małe kolonie, jasnoniebieskie lub niebieskozielone

Citrobacter freundii – małe bezbarwne kolonie

Enterobacter aerogenes – małe bezbarwne kolonie

Staphylococcus aureus – brak wzrostu

Pepton, sole żółciowe, X-Glu, agar

Bulion LMX

(Merck)

Pożywka przeznaczona do jednoczesnego

wykrywania E. coli i pałeczek z grupy coli

poprzez wykorzystanie specyficznego

działania β-galaktozydazy (grupa coli) oraz

β-glukuronidazy i tryptofanazy (E. coli)

w żywności metodą NPL.

E. coli – zmiana barwy na zielononiebieską, fluorescencja w UV

(336 nm), obecność indolu (odczynnik Kovacsa)

Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter

freundii – zmiana barwy na zielononiebieską, brak fluorescencji

Shigella flexneri – brak zmiany zabarwienia

Tryptoza, chlorek sodu, sorbitol,

tryptofan, K

2

HPO

4

, KH

2

PO

4

, sól

sodowa siarczanu laurylu, X-Gal,

MUG, 1-izopropylo-β-D-1-tio-

galaktopiranozyd

Test Colilert

Test wykorzystuje się do wykrywania bakterii

grupy coli i E. coli wskaźnikowe substraty

odżywcze ONPG i MUG.

E. coli – barwa żółta i fluorescencja

K. pneumoniae – barwa żółta i brak fluorescencji

Pseudomonas aeruginosa – brak barwy i fluorescencji

Odczynnik Colilert zawierający

OPNG, MUG

COLI ID

(bioMerieux)

Wybiórcze podłoże z zawartością

chromogenów służące do wykrywania, oceny

ilościowej i różnicowania β-D-glukuronidazo

pozytywnych pałeczek E. coli.

E. coli – kolonie różowo-fioletowe, 0,5-2,0 mm

Inne pałeczki coli – kolonie niebieskoszare, 0,5-2,0 mm

Inne bakterie Gram-ujemne – kolonie bezbarwne, 0,1-1,0 mm

bio-Gelytone, ekstrakt drożdżowy,

chlorek sodu, sole żółciowe,

mieszanina aktywatorów

i substratów chromogennych, agar

Tabela 1. Wybrane podłoża i testy stosowane w celu wykrycia i ilościowego oznaczenia bakterii E. coli

Technika badawcza

Przeznaczenie testu

Nazwa testu

Przybliżony

czas badania [h]

Dostawca

Test immunoenzymatyczny

(ELISA)

E. coli O157
E. coli O157

E. coli O157

E. coli O157:H7

Vidas E. coli O157

EHEC – Tek Incorporating Immunocapture Beads

Petrifilm – HEC

E. coli O157:H7 Visual Assay

25
18

28
28

bioMerieux UK Ltd.

Organon Teknika Ltd.

3M Healthcare Ltd.

TECRA Diagnostics UK

Immunochromatografia

(IC) – chromatografia na

immobilizowanych białkach

E. coli O157:H7
E. coli O157:H7
E. coli O157:H7

E. coli O157:H7
E. coli O157:H7

Reveal dla E. coli O157:H7

Reveal 8 dla E. coli O157:H7

VIP (Visual Immunoprecipitate Assay) dla EHEC

EIAFOSS E. coli O157 Pathstik

24

8

24

26
48

Neogen Corp.
Neogen Corp.

Bio Control Systems Inc.

Foss Electric

Celsis Ltd.

Reakcja łańcuchowa

polimerazy

(PCR)

E. coli O157

E. coli O157:H7

E. coli O157:H7

BAX

TM

dla E. coli O157

PROBELLA

TM

TaqMan

®

E. coli O157:H7 detection kit

24
24

24

Qualicon

Sanofi Diagnostics, Pasteur

PE Biosystems

Tabela 2. Wybrane metody służące do wykrywania i identyfikacji serotypu E. coli O157 w żywności

Środek spożywczy

n

c

Limit w 1 g

m

M

1. Produkty mięsne i drobiowe

(wędliny inne niż surowe i surowe parzone,

przetwory mięsne paczkowane, plasterkowane lub porcjowane)

5

2

10

2

10

3

2. Produkty owocowe, warzywne i owocowo-warzywne

a. owoce mrożone

b. owoce homogenizowane mrożone

w opakowaniach niehermetycznych

c. owoce suszone i nasiona łuskane

d. świeże lub blanszowane, chłodzone lub mrożone kiełki,

surówki warzywne do bezpośredniego spożycia

e. przyprawy, zioła przyprawowe w całości i rozdrobnione,

suszone oraz mieszanki przyprawowe

5

5
5

5

5

2

2
2

2

1

10

2

10

2

10

2

10

2

10

3

5x10

2

5x10

2

5x10

2

5x10

2

10

4

3. Wyroby garmażeryjne

(wyroby garmażeryjne i potrawy kulinarne gotowe (mięsne lub niemięsne,

podrobowe i galarety), sosy zimne, sałatki, majonez)

5

2

10

2

10

3

4. Przetwory zbożowe, pieczywo, makarony, wyroby ciastkarskie

5

2

10

2

10

3

5. Tłuszcze roślinne i mieszane, margaryna

5

2

10

2

10

3

6. Wyroby cukiernicze

sosy deserowe utrwalone (karmelowe, toffi, kakaowe itp.)

i polewy cukiernicze do lodów

5

2

10

2

10

3

7. Preparaty enzymatyczne

5

0

0 (25g)

-

8. Środki spożywcze specjalnego przeznaczenia żywieniowego

a. produkty instant dla niemowląt i małych dzieci do lat 3

b. herbatki instant owocowe lub ziołowe

5

5

0

1

0

10

-

10

2

9. Suplementy diety

5

0

0

-

Tabela 3. Maksymalne poziomy zanieczyszczeń E. coli w wybranych produktach żywnościowych

29

laboratorium przemysłowe

Laboratorium |

12

/2007

29

jak E. coli O157, i mogą zafałszować wynik oznaczenia. Na podłożu
SMAC sorbitolo-dodatnie bakterie tworzą kolonie lekko czerwona-
we, natomiast sorbitolo-ujemne – jasnoróżowe. Drugie z podłoży
pozostawia się do wyboru laboratorium. Ponieważ proces separacji
immunomagnetycznej nie gwarantuje otrzymania jedynie bakterii
serotypu O157, podejrzane kolonie przeszczepia się na agar odżywczy
w celu uzyskania czystej kultury i wykonuje badania potwierdzające,
obejmujące określenie zdolności wytwarzania indolu, oraz badania
serologiczne – aglutynację z surowicą anty-E. coli O157.

W wykrywaniu chorobotwórczych szczepów E. coli zastosowanie

znalazły również nowoczesne metody molekularne, takie jak testy
immunoenzymatyczne (ELISA), immunochromatografia oraz reakcja
łańcuchowa polimerazy (PCR) (tabela 2).

Znaczenie E. coli w żywności

Szczepy niepatogenne E. coli ze względu na swoje właściwości oraz
zdolność do przeprowadzania fermentacji pseudomlekowej mogą
przyczyniać się do psucia różnych artykułów żywnościowych.
Występowanie tych mikroorganizmów wraz z bakteriami właściwej
fermentacji mlekowej podczas fermentacji surowców roślinnych
(np. kiszenie kapusty i ogórków) powoduje obniżenie końcowej
jakości produktu. Pałeczka okrężnicy może również wywoływać
różne wady mleka (oborowy smak i zapach, porozrywany skrzep),
masła (gorzki smak, oborowy zapach) oraz wczesne wzdęcia serów.
Ponadto bakterie te mogą zakłócać prawidłowy przebieg różnych
innych procesów fermentacyjnych.

Kałowe źródła skażenia żywności wciąż są istotnym czynnikiem

wpływającym na wybuchy infekcji związanych z E. coli, a zwłaszcza
z EHEC. Grupy żywności kojarzone ze zwiększonym ryzykiem infekcji
powodowanych przez chorobotwórczą pałeczkę okrężnicy można
ogólnie podzielić na cztery grupy:
– surowce lub produkty narażone na zanieczyszczenie pochodzące

z jelita grubego (np. mięso),

– produkty wytworzone z pominięciem etapu przetworzenia mogą-

cego zniszczyć drobnoustroje (np. gotowanie),

– produkty narażone na zanieczyszczenia po przetworzeniu,
– zanieczyszczone produkty sprzedawane jako gotowe do spożycia.

Przyczynami zatruć pokarmowych wywoływanych przez E. coli
były jak dotąd głównie hamburgery, mięso drobiowe, hot dogi,
fermentowane wędliny, surowe mleko i sery otrzymywane z surowe-
go mleka, jogurt, niepasteryzowane soki owocowe, cydr jabłkowy,
sałata liściasta, różnego typu surówki, majonez i sosy na bazie
majonezu oraz kiełki roślinne. Maksymalne dopuszczalne poziomy
zanieczyszczeń E. coli w wybranych produktach żywnościowych
przedstawia tabela 3.

‰

Piśmiennictwo
1. Bell C., Kyrkiades A.: Pathogenic Escherichia coli [w:] Blackburn C.W.,

McClure P.J.: Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis and control.
CRC Press, Cambridge 2002.

2. Betts G.D., Lyndon G., Brooks J.: Heat resistance of emerging foodborne

pathogens: Aeromonas hydrophila, Escherichia coli O157:H7, Plesiomonas
shigelloides and Yersinia enterocolitica. Campden Food & Drink Rese-
arch Association, Technical Memorandum nr 672, 1993, Chipping
Campden.

3. Bolton F.J., Crozier L., Williamson J.K.: Isolation of Escherichia coli

O157 from raw meat products. „Letters in Applied Microbiology”,
1996, 23, 317-321.

4. Czajkowska D.: Escherichia coli O157:H7 – chorobotwórczość i wykrywa-

nie w produktach spożywczych. Materiały z Seminarium „Współczesne
zagrożenia mikrobiologiczne w żywności na wszystkich etapach
produkcji i obrotu”, Warszawa – Miedzeszyn, 21-22 kwietnia
2005.

5. Doyle M.P., Schoeni J.L.: Isolation of Escherichia coli O157:H7 from

retail fresh meats and poultry. „Applied and Environmental Micro-
biology”, 1987, 53 (10), 2394-2396.

6. Geissler K., Manafi M., Amoros I., Alonso J.L.: Quantitative deter-

mination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with
chromogenic and fluorogenic media. „Journal of Applied Microbiolo-
gy”, 2000, 88, 280-285.

7. Manafi M.: New developments in chromogenic and fluorogenic culture

media. „Interantional Journal of Food Microbiology”, 2000, 60,
205-218.

8. PN-ISO 16649-2:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna

metoda oznaczania liczby ß-glukuronidazo-dodatnich Escherichia
coli. Część 2: Metoda płytkowa w temperaturze 44°C z zastosowa-
niem 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-ß-D-glukuronidu.

9. PN-EN ISO 16654:2002 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzon-

talna metoda wykrywania Escherichia coli O157.

10. PN-ISO 7251:2006 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna

metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby przypuszczalnych
Escherichia coli – Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby.

11. Venkateswaran K., Murakoshi A., Satake M.: Comparison of commer-

cially available kits with standard methods for the detection of coliforms
and Escherichia coli in foods. „Appl. Environ. Microbiol.”, 1996, 62,
7, 2236-2243.