Uniwersytet Przyrodniczy

w Poznaniu

Wydział Nauk o Żywności i Żywieniu

Specjalność: Biotechnologia Żywności

Maciej Dados

Metody in vitro wprowadzania biomolekuł do komórek

Praca inżynierska wykonana

na kierunku Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Praca wykonana pod kierunkiem
dr Marcina Schmidta
w Katedrze
Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności

Poznań, rok 2010

2

Streszczenie

Maciej Dados

Metody in vitro wprowadzania biomolekuł do komórek

Wprowadzanie kwasów nukleinowych i białek do komórek hodowanych in vitro znajduje szerokie

zastosowanie w różnych dziedzinach nauk biologicznych i medycznych. Umożliwia zarówno
prowadzenie badań mających na celu analizę struktury, oraz funkcji genów, oraz innych procesów
zachodzących

wewnątrzkomórkowo,

jak

i

stwarza

możliwości

uzyskiwania

organizmów

modyfikowanych genetycznie. By zwiększyć wydajność tych działań opracowany został szereg metod,
wykorzystujących oddziaływania fizyczne, fizykochemiczne, oraz biologiczne. Jednakże proces
wprowadzania zawsze jest czynnikiem stresogennym dla komórek, stąd istnieje ryzyko mogące
prowadzić do zmiany w ekspresji wielu genów, oraz indukcji apoptozy. Opisane metody mają na celu, jak
największe ograniczenie toksyczności, czyli śmiertelności komórek poddanych wprowadzaniu, przy
możliwie najwyższej wydajności i powtarzalności.


Słowa kluczowe – transfekcja, transformacja, transdukcja.

Summary

Maciej Dados

In vitro methods for biomolecules introduction into cells

In vitro introduction of nucleic acids or proteins into cells finds wide utilization in many different

parts of biological and biomedical branches. It provides both, possibilities of acquire genetically modified
organisms (GMO), and to carry out genes expression or other intracellular processes analysis. To enhance
efficacy of these operations there has been developed methods of physical, physicochemical, and
biological, biomolecules introduction. However this process is stressful for cells, which may lead to
serious changes in expression of many genes and induction of apoptosis. Described methods aim for
minimal toxicity and mortality, and maximum efficacy, and repeatability in experiments.


Key words – transfection, transformation, transduction.

3

Spis treści

Wstęp .................................................................................................................................... 4

Rozdział I: Metody fizyczne ................................................................................................ 6

Mikroiniekcja ..................................................................................................................... 6

Elektroporacja .................................................................................................................... 7

Mikrowstrzeliwanie ........................................................................................................... 8

Infiltracja próżniowa .......................................................................................................... 9

Szok termiczny ................................................................................................................ 10

Rozdział II: Metody fizykochemiczne .............................................................................. 11

Fosforan wapnia ............................................................................................................... 12

DEAE-dekstran, polietylenoimina ................................................................................... 13

Lipidy kationowe ............................................................................................................. 14

Białka wnikające do komórek ......................................................................................... 16

Rozdział III: Metody biologiczne .................................................................................... 18

Agrobacterium tumefaciens ............................................................................................. 18

Wektory wirusowe ........................................................................................................... 20

Transdukcja bakteryjna .................................................................................................... 23

Podsumowanie.................................................................................................................... 26

Bibliografia ......................................................................................................................... 27

4

Wstęp

Postępujący rozwój technik biologii molekularnej umożliwia stosowanie coraz to bardziej

zaawansowanych metod badawczych, w tym wykorzystania komórek w hodowlach in vitro.

Wprowadzanie do ich wnętrza kwasów nukleinowych, czy białek umożliwia zarówno określenie

właściwości biochemicznych komórek – struktury i funkcji genów, analizę ekspresji genów, aktywności

sekwencji regulatorowych za pomocą genów reporterowych, jak i wykorzystanie komórek jako

bioreaktora dla uzyskiwania określonego bioproduktu. Dzięki umieszczeniu w komórce kwasów

nukleinowych możemy zatem zarówno określać funkcje genów poprzez analizę ich ekspresji,

jak i uzyskiwać organizmy modyfikowane genetycznie, które produkują w ten sposób ze zwiększoną

intensywnością pożądany metabolit, lub wykazują się zupełnie nowymi cechami. Cząsteczki

wprowadzane do komórek to także duże białka o na przykład przeciwciała

,

a nawet całe organelle.

Jednakże biomolekuly nie mogą swobodnie wnikać do komórek, dlatego w celu osiągnięcia wysokiej

wydajności konieczne korzystanie jest z czynników ułatwiających im przenikanie do wnętrza komórek.

Opracowanych zostało wiele metod wprowadzania biomolekuł do wnętrza komórek.

Podstawowymi czynnikami determinującymi zasadność stosowania danej metody są:

•

wydajność, czyli stosunek ilości komórek do których skutecznie wprowadzony został produkt

do ogólnej liczby komórek poddawanych eksperymentowi

•

toksyczność, a zatem stopień w jakim metoda wprowadzania przyczynia się do zniszczenia

komórki, gdyż wprowadzania często wiąże się z dezintegracją błony komórkowej, stąd transfekcja

jest dla komórek czynnikiem stresowym wiele z nich ginie na drodze apoptozy, stąd dążenia

do uzyskiwania maksymalnie nietoksycznych metod

•

uniwersalność – to czynnik zależny od rodzaju linii komórkowych poddawanej badaniom. Istnieją

zarówno

metody

o

szerokim

spektrum

zastosowań

(Gen

Gun,

elektroporacja),

jak i dobrane do konkretnego gatunku komórek. Ponieważ optymalizacja parametrów

to niezwykle czasochłonny etap, istotny jest dobór metody zgodnej ze stopniem specjalizacji

badań (czy badaniom podlega jedna, czy wiele różnorodnych linii komórkowych, czy badanych

jest wiele, czy nieliczne komórki). Ograniczeniom podlega ponadto rodzaj wprowadzanego

materiału – wielkość cząsteczki, oraz inne jej właściwości takie jak ładunek czy hydrofobowość

5

•

wpływ na aktywność genomu

•

koszt

Istotnym zagadnieniem jest także cel wprowadzania biomolekuł do komórki. W niektórych

przypadkach (np. gdy wprowadzane jest białko) istotne jest ich umieszczenie jedynie w cytoplazmie

gdzie mogą spełniać swe funkcje. Natomiast w przypadku DNA, czy RNA ważny może okazać się

transport do jądra komórkowego, oraz integracja wprowadzonego materiału z genomem gospodarza.

Proces ten nazywany jest transfekcją stałą. Ten rodzaj transfekcji umożliwia obserwację transgenu

również w kolejnych pokoleniach komórek. Jest zatem szczególnie pożądany, gdy celem jest terapia

genowa, czy analiza ekspresji genów. Gdy nie ma miejsca integracja z macierzystym DNA mówi się

o transfekcji przejściowej. W takiej sytuacji wprowadzony materiał łatwo może ulec degradacji

enzymatycznej, lub metylacji. Pewna jego część zostaje także utracona przez kolejne podziały

komórkowe. Zarówno w transfekcji stałej jak i przejściowej możliwa jest obserwacja produktów ekspresji

wprowadzanych genów.

Niniejsza praca stanowi przegląd najważniejszych metod stosowanych w celu wprowadzania

biomolekuł do komórek. Opisane metody poza ich podstawowym wykorzystaniem w stanie in vitro,

z powodzeniem mogą być stosowane także in vivo. Przyjęto podział z ich podziałem na metody fizyczne,

fizyko-chemiczne, oraz biologiczne.

6

Rozdział I:

Metody fizyczne

Metodami fizycznymi wprowadzania biomolekuł do komórek nazwać można te, w których

nie występuje żaden związek chemiczny, który umożliwiał, lub ułatwiałby proces wprowadzania.

Cząsteczki dostają się do wnętrza komórki tylko dzięki oddziaływaniom fizycznym – mechanicznym,

elektrycznym czy dyfuzyjnym. Do tej grupy metod zalicza się mikroiniekcję, elektroporację,

mikrowstrzeliwywanie,

a także infiltrację podciśnieniową, oraz metodę z wykorzystaniem szoku cieplnego.

Mikroiniekcja

Mikroiniekcja to metoda polegająca na bezpośrednim wstrzyknięciu za pomocą cienkiej szklanej

igły materiał do wnętrza komórki docelowej. Komórka do której wprowadzone mają zostać cząsteczki

pozostaje unieruchomiona na pipecie pomocniczej, a za pomocą szklanej, ostro zakończonej igły

o średnicy od 0,5 do 5 µm przebita zostaje błona komórkowa, a materiał zostaje wtłoczony do wnętrza

komórki. Technika ta umożliwia także bezpośrednie umieszczenie materiału w jądrze komórkowym,

co ma szczególne znaczenie przy wprowadzaniu DNA. Możliwa jest wtedy integracja trans genów

z genomem komórki, jednakże skutek taki jest trudny do osiągnięcia [1].

Mikroiniekcja może być wykonywana za pomocą specjalnego mikromanipulatora połączonego

z odwróconym mikroskopem. Hydrauliczne połączenie ze strzykawką umożliwia bardzo precyzyjne

ruchy ograniczając do minimum ryzyko uszkodzenia komórki. Istnieją trzy systemy aparaturowe

do prowadzenia mikroiniekcji: manualny w którym zarówno położenie pipety, jak i ciśnienie konieczne

do wstrzyknięcia substancji wprowadzanej obsługiwane jest ręcznie. System jest sprzężony z pojedynczą

strzykawką. Półautomatyczny – w którym nadal konieczne jest ręczne naprowadzanie igły na komórkę,

jednakże wartość ciśnienia i czas iniekcji kontrolowany jest automatycznie poprzez pojedynczy przycisk,

na podstawie określonych wartości [2]. Układ automatyczny – komórki mogą zostać immobilizowane

w określonych punktach matrycy, określone zostają punkty startu natomiast iniekcja zostaje

przeprowadzona za pomocą mikrorobotów. System podlega kontroli komputera, który przemieszcza

strzykawkę w odpowiednie miejsca na matrycy dokonując iniekcji. Mikroiniekcja jest zatem

7

kontrolowana z poziomu komputera. W tym wypadku uzyskuje się bardzo wysokie wydajności, możliwe

jest nakłuwanie 15 embrionów na minutę, przy 99% skuteczności i 98% przeżywalności [4]. Oczywiście

koszt prowadzenia eksperymentu wzrasta wraz ze wzrostem automatyzacji procesu.

Metoda ta, gdy wykonywana jest w sposób manualny, wymaga jednak dużych nakładów pracy

i wysokich kwalifikacji operatora, gdyż każda komórka musi zostać nakłuta, a zatem nie jest praktyczna

gdy istotna jest analiza wielu komórek, jednakże charakteryzuje się wysoką efektywnością gdyż

substancje wprowadza się w ściśle określone miejsce w komórce. Ponadto zaletą mikroiniekcji jest

oszczędność wprowadzanego materiału. Wystarczą objętości rzędów 10

-12

– 10

-15

litra na komórkę.

Technika ta charakteryzuje się niskim stopniem uszkodzenia komórek, ponadto nie odnotowuje się

odpowiedzi wynikających ze stresu komórki jak ma to miejsce w przypadku innych technik [2]. Nie ma

ograniczeń co do wprowadzonego materiału, a zatem metoda ta może być stosowana do wprowadzania

zarówno dużych i małych białek, oraz kwasów nukleinowych. W trakcie jednego eksperymentu możliwe

jest też wprowadzenie kilku cząsteczek, jako że komórka może być nakłuwana wielokrotnie bez wpływu

na jej kondycję.

Mikroiniekcja wykorzystywana była do analizy cytometrycznej białek mikroszkieletu – aktyny,

miozyny, tubuliny, ale przede wszystkim w celu wprowadzania DNA do oocytów w celu uzyskiwania

organizmów modyfikowanych genetycznie, oraz w celu zapłodnienia in vitro.

Elektroporacja

Idea metody wprowadzania biomolekuł do komórek za pomocą elektroporacji opiera się

na założeniu, że pod wpływem impulsu elektrycznego błona komórkowa ulega perforacji. Proces ten jest

jednak odwracalny. W zależności od przyłożonego napięcia i czasu trwania impulsu (kilka milisekund)

błona ma zdolność do tworzenia w swej strukturze porów, które jednak po pewnym czasie zamykają się,

a błona powraca do stanu wyjściowego. Pod wpływem elektroporacji w poprzek błony tworzy się

gradient napięcia ok. 0,5 – 1 V. A zatem cząsteczki posiadające ładunek elektryczny, do których zaliczają

się kwasy nukleinowe czy białka, przechodzą do wnętrza komórki na drodze podobnej jak ma to miejsce

w przypadku elektroforezy [5].

Komórki w zawiesinie wprowadza się do kuwety z wbudowanymi w ścianki elektrodami, przez

które przepuszcza się prąd o wysokim napięciu. Uzyskany dzięki rozładowaniu kondensatora impuls

elektryczny powoduje rozerwanie fosfolipidowej błony komórkowej tworząc w niej pory. Wartość

napięcia koniecznego dla skutecznego wytworzenia porów o pożądanej średnicy zależy od wielkości

komórki i wynosi od 10 do 100 kV/cm. Mimo iż napięcie konieczne do utworzenia porów w błonie

8

wynosi jedynie 300 – 400 mV konieczne stosowanie jest tak znacznych napięć ze względu na odległość

elektrod od komórek. W przypadku komórek ssaczych stosuje się kuwety o 0,4 cm przerwie między

elektrodami [6]. Wytworzenie porów zwiększa przewodnictwo elektryczne błony, umożliwiając w ten

sposób przedostanie się do wnętrza komórki cząsteczek nieobojętnych elektrycznie.

Elektroporacja jest wykorzystywana w celu wprowadzenia substancji do komórek nisko

podatnych na inne metody wprowadzania, gdyż wysoki procent komórek może zostać zniszczony

w trakcie eksperymentu na skutek zbyt rozległych uszkodzeń błony. Uszkodzenia komórek są szczególnie

nasilone w przypadku nieodpowiedniego dobrania parametrów procesu takich jak wartość napięcia, czy

czas trwania impulsu elektrycznego, stąd metoda ta wymaga każdorazowej szczegółowej i często

pracochłonnej optymalizacji dla każdego rodzaju komórek [7

].

Stąd istnieje konieczność wykorzystania

wyspecjalizowanego i często kosztownego sprzętu.

Kolejnym ograniczeniem w stosowaniu tej metody jest fakt iż transport poprzez błonę do wnętrza

komórki odbywa się w sposób niespecyficzny. Nie ma możliwości pełnego kontrolowania jakie

substancje wnikają do wnętrza komórki, a jakie są z niej być może tracone. Może dojść do zachwiania

równowagi elektrolitycznej i śmierci komórki [8].

Do zalet elektroporacji zaliczyć można jej uniwersalność, gdyż jest na nią podatne wiele linii

komórkowych zarówno bakterii, grzybów, protoplastów roślinnych jak i komórek zwierzęcych.

Stosując elektroporację osiąga się również wysokie wydajności – rzędu 80 % dla wprowadzania

DNA do E. coli [6]. Ponadto stwarza ona możliwość wprowadzania cząsteczek o dużych wymiarach

– wprowadzane mogą być także kosmidy, czy sztuczne chromosomy [7].

Mikrowstrzeliwanie

Mikrowstzeliwanie to metoda opracowana w celu wprowadzanie molekuł do komórek roślinnych,

obecnie wykorzystywana jest jednak także do transfekcji linii komórek, a nawet tkanek zwierzęcych

również in vivo.

Podstawowym narzędziem używanym do mikrowstrzeliwania jest tak zwana strzelba genowa.

Umożliwia ona rozpędzenie kulek metalu obojętnego (złoto, wolfram) opłaszczonych wprowadzanym

materiałem do prędkości umożliwiających penetrację komórki. Rozpędzenie kulek możliwe jest na kilka

sposobów między innymi poprzez wykorzystanie sił magnetycznych, elektrostatycznych, wyładowania

elektryczne, czy siły odśrodkowej, ale najbardziej rozpowszechniona to wykorzystanie gazu obojętnego

– helu [9].

9

Cząsteczki złota (śrut złoty) o średnicy 1,6 µm zawieszone zostają w roztworze z dodatkiem

spermidyny. Związek ten powoduje iż kulki stają się naładowane dodatnio, co umożliwia ich związek

z ujemnie naładowanym DNA [10]. Następnie zostają zawieszone w roztworze DNA z dodatkiem

chlorku wapnia, który powoduje strącenie się DNA, co ułatwia przyłączanie się go do kulek. Kolejnym

etapem jest przemywanie etanolem i suszenie kulek. Suszenie odbywa się na specjalnym dysku, który

umieszcza się następnie w komorze strzelby, gdzie pełni on nośnika kulek z DNA. W momencie strzału

gaz o pożądanym ciśnieniu trafia na dysk z kulkami, rozpędzając go do prędkości ok. 400m/s. Dysk trafia

na porowaty ekran stopujący, który zatrzymuje go, lecz pozwala na przejście kulkom, które trafiają w ten

sposób wprost do komórek docelowych [11].

Parametrami podlegającymi kontroli są prędkość kulek, odległość strzału strzelby od tkanki

decydująca o długości lotu, wartość ciśnienia gazu. Parametry te powinny być dobierane do konkretnych

linii komórkowych, czy tkanek, pod kątem ich wrażliwości i wynikającej z tego przeżywalności pod

wpływem bombardowania.

Podstawową zaletą tej metody jest jej uniwersalność zarówno pod kątem linii komórkowej,

jak i rodzaju wprowadzanego materiału. Możliwe jest zatem wprowadzanie bardzo długich konstruktów,

a także kilku genów jednocześnie. Stwarza to sporą przewagę nad chemicznymi metodami transfekcji.

Natomiast niska wydajność tej metody połączona z wysoką ceną aparatury stanowi poważny

czynnik ograniczający jej zastosowanie. Użycie mikrowstrzeliwania niesie także ryzyko dezintegracji

komórek, a także rearanżacji, czy fragmentacji insertów pod wpływem znacznych sił ścinających

działających na cząsteczki w trakcie strzału. Nie ma także możliwości dokładnej kontroli dokąd dostają

się wprowadzone cząsteczki.

Mikrowstrzeliwanie znalazło zastosowanie przede wszystkim w modyfikacji roślin. W ten sposób

uzyskana została nowa odmiana kukurydzy MON 810 odporna na omacnicę – prosowiankę, oraz ryż

XA 21 odporny na zarazę bakteryjną.

Infiltracja próżniowa

Dla wprowadzania biomolekuł do wnętrza komórek infiltracja próżniowa wykorzystywana jest

jako metoda pomocnicza. Służy ona przede wszystkim do zwiększenia wydajności transformacji roślin

za pomocą bakterii z rodzaju Agrobacterium.

Metoda polega na umieszczeniu tkanki roślinnej pod próżnią. Zmniejszone ciśnienie powoduje, że

przestrzenie powietrzne między komórkami zostają zmniejszone, a zatem kontakt rośliny

z Agrobacterium staje się ściślejszy umożliwiając efektywną transformację.

10

Czynnikiem krytycznym jest tutaj czas, na który tkanka została poddana działaniu próżni, gdy jest

on zbyt długi komórki mogą wykazywać cechy patologiczne typowe dla komórek poddanych zbyt dużej

podaży wody (ang. hyperhydricity).

Szok termiczny

Metoda ta standardowo wykorzystywana jest do transformacji plazmidów do bakterii (np. E. coli).

Według standardowego protokołu polega ona na umieszczeniu zawiesiny komórek i wprowadzanego

DNA (np. plazmidu) na lodzie, a następnie przeniesienie jej na 35-45 sekund do łaźni wodnej

o temperaturze 42 ºC, po czym komórki ponownie umieszcza się na lodzie na krótki czas (ok. 2 minut).

Dalsza inkubacja odbywa się standardowo w 37 ºC z dodatkiem pożywki SOC, która ułatwia regenerację

komórek po transformacji, przywraca właściwy transport transbłonowy i ciśnienie osmotyczne zachwiane

przez utratę jonów potasu w trakcje transformacji [12].

Pod wpływem podwyższonej temperatury zwiększa się płynność błon komórkowych,

do przyczynia się do tworzenia na jej powierzchni porów umożliwiających przenikanie DNA do komórki.

Ponadto w zwiększonej temperaturze obserwuje się częściowy spadek potencjału elektrostatycznego

błony, co dodatkowo podnosi wydajność transformacji. Natomiast umieszczenie komórek na lodzie

umożliwia zasklepianie się porów na skutek utraty płynności błony komórkowej Mimo to dokładny

mechanizm w jaki cząsteczki przedostają się do wnętrza komórki nie jest do końca wyjaśniony [13]. Cykl

taki może zostać powtórzony kilkakrotnie w trakcie jednego eksperymentu, w celu zwiększenia

wydajności.

Parametry, wpływające na proces transformacji to przede wszystkim wartość czasu i temperatury

szoku cieplnego. Zbyt wysoka temperatura i zbyt długi czas ekspozycji spowoduje denaturację białek

i w konsekwencji śmierć komórek, a zbyt niska nie zagwarantuje odpowiedniej ich podatności

na transformację plazmidowym DNA. Komórki mające zostać poddane transformacji tą metodą muszą

wcześniej zostać wprowadzone w stan kompetencji poprzez inkubację w roztworach zawierających

kationy dwuwartościowe (najczęściej Ca

2+

lub Rb

2+

) w niskich temperaturach.

11

Rozdział II:

Metody fizykochemiczne

W metodach kwalifikowanych do grupy technik fizyko-chemicznych, wykorzystuje się

oddziaływania fizyczne pomiędzy wprowadzaną cząsteczką a molekułami komórki, które wymuszone

są obecnością odpowiednio dobranych związków chemicznych. Dzięki nim uzyskuje się zwiększenie

wydajności wprowadzania, a także kondensację i ochrona wprowadzanego materiału przed czynnikami

degradującymi (np. nukleazami). Podstawowym mechanizmem ułatwiania kontaktu materiału

wprowadzanego z komórką jest neutralizacja ujemnie naładowanych cząsteczek poprzez kationową

budowę nośnika (rys.1). Ograniczeniem stosowania odczynników chemicznych jest jednak ich

toksyczność w stosunku do komórki. Każda z metod zaliczanych do tej grupy opiera się na zastosowaniu

innego związku, lub grupy związków. Są to: fosforan wapnia, DEAE – dekstran, lipidy kationowe,

peptydy penetrujące komórkę.

Rysunek 1: Ogólny schemat wprowadzania plazmidów do komórek za pomocą kationowych nośników. (wg.

C. Masson, V. Escriou, M. Bessodes, D.
Scherman. Lipid reagents for DNA
transfer into mammalian cells, 2003
Elsevier Science).

Kationowy

nośnik

neutralizuje

ujemnie

naładowane

plazmidy,

umożliwiając kontakt z komórką.

Transport do wnętrza komórki może

odbywać się na zasadzie endocytozy,

lub fuzji z błoną komórkową. Istnieje

ryzyko degradacji wprowadzonego

materiału w lizosomie, jednakże

możliwy jest transport do jądra i transkrypcja, oraz ekspresja wprowadzonego materiału.

12

Fosforan wapnia

Od kiedy wiadomo, że dodatek kationów dwuwartościowych zwiększa wydajność transformacji

u bakterii zaczęto poszukiwać wykorzystania tego mechanizmu również do wprowadzania DNA

do komórek zwierzęcych [14]. Użycie fosforanu wapnia to historycznie pierwsza metoda, stosowana do

zwiększenia wydajności transfekcji. Umożliwia wprowadzanie jedynie cząsteczek DNA; nie jest

stosowana do RNA, czy białek.

Metoda ta polega na rozpuszczeniu DNA w buforze (np. HEPES, z uwagi na jego niską

toksyczność) dla uzyskania kontroli poziomu pH, z dodatkiem jonów wapnia w postaci CaCl

2

.

Mieszaninę taką wkrapla się do roztworu fosforanu i inkubuje przez określony czas. W warunkach

odczynu pH z zakresu od 6,95 do 7,0 tworzą się niskocząsteczkowe strąty fosforanu wapnia, które

wykazują się najwyższą wydajnością transfekcji. Stężenie jonów wodorowych musi podlegać stałej

kontroli, gdyż w wypadku gdy osiąga wartość powyżej 7 tworzą się wysokocząsteczkowe kompleksy,

które wnikają do komórek z mniejszą wydajnością. Strąty fosforanu wapnia kompleksją z cząsteczkami

DNA. Układ taki podaje się następnie na powierzchnię nośnika zawierającego komórki i inkubuje przez

kilka godzin kiedy to strąty ulegają adhezji do powierzchni, a następnie wnikają do wnętrza komórek.

Sam mechanizm przedostawania się kompleksu fosforanu wapnia z DNA do komórek nie jest w pełni

poznany, ale istnieje teoria, że DNA przedostaje się do ich wnętrza na drodze endocytozy,

lub fagocytozy. Ponadto wydajność transfekcji może zostać podniesiona poprzez wywołanie warunków

stresowych dzięki zastosowaniu DMSO, lub glicerolu. [14]

Podstawowymi zaletami tej techniki są niskie koszty odczynników, oraz możliwość

wprowadzania kilku genów jednocześnie (poza podstawowym, wprowadzanie genu markerowego).

Metoda może być wykorzystywana do prowadzenia transfekcji stałej, jak i przejściowej. Odnotowuje się

także fakt, że fosforan wapnia pełni także funkcję ochronną wprowadzanego DNA, chroniąc go przed

nukleazami [15].

Istotnym ograniczeniem jest natomiast konieczność ścisłej kontroli pH, którego nawet niewielkie

wahania znacznie wpływają na wydajność. Wadą jest także niska powtarzalność wydajności transfekcji.

Natomiast niskie koszty odczynników zostają w pewnym stopniu przyćmione przez konieczność użycia

znacznych ilości DNA o wysokim stopniu czystości, by zagwarantować łatwe powstawanie strątów.

Pozorna uniwersalność tej metody także zostaje zachwiana, gdyż istnieją także linie komórkowe oporne

na transfekcję za pomocą fosforanu wapnia. Mimo licznym niedogodnościom metoda z użyciem

fosforanu wapnia stosowana jest nadal w wielu laboratoriach.

13

DEAE-dekstran, polietylenoimina

Transfekcja z wykorzystaniem dwuetyloaminoetylu (DEAE) – dekstranu także może być

zaliczana do metod klasycznych i referencyjnych. Jednak podobnie jak w przypadku metody

z fosforanem wapnia odznacza się niższą wydajnością i powtarzalnością, niż metody wykorzystujące

lipidy kationowe [16]. DEAE-dekstran to polisacharyd, który w warunkach fizjologicznych ma charakter

kationowy. A zatem łącząc się z ujemnie naładowanym DNA (lub RNA) umożliwia jego zbliżenie się

do powierzchni ujemnie naładowanej komórki, adhezję do jej powierzchni i wnikanie do wnętrza

na drodze endocytozy [16].

Metoda polega na zmieszaniu buforowanego roztworu DNA z zawiesiną DEAE-dekstranu

i aplikowaniu mieszaniny wprost do naczynia hodowlanego z komórkami. Komórki mogą znajdować się,

w przeciwieństwie do metody z fosforanem wapnia, także w hodowlach zawiesinowych. Po inkubacji

trwającej z reguły poniżej 30 minut komórki poddaje się działaniu glicerolu, lub DMSO w celu

zwiększenia efektywności transfekcji na drodze zmiany właściwości błony lub wywołania korzystnych

efektów osmotycznych. Czas pozostawania glicerolu (lub DMSO) w naczyniu z komórkami musi zostać

ściśle ustalony ze względu na jego toksyczność i ryzyko nieodwracalnego uszkodzenia błony. Końcowym

etapem jest przemywanie komórek czystym buforem. Alternatywną metodą transfekcji z użyciem DEAE-

dektranu jest eksponowanie komórek najpierw jedynie na roztwór dekstranu, przemyciu komórek

i ostatecznie dodaniu DNA. [17].

Metoda

gwarantuje

jedynie

przejściową

transfekcję

[17],

jednakże

wykorzystanie

DEAE-dekstranu można rozszerzyć o jego pomocnicze funkcje dla transfekcji za pomocą elektroporacji,

gdyż zastosowanie elektroporacji połączonej z dodatkiem DEAE-dekstranu wielokrotnie zwiększa

wydajność transfekcji, zmniejszając jednocześnie objętości DNA wymaganego do tego procesu [18].

Polietylenoimina (PEI) także zaliczana jest do polimerów kationowych. Podobnie

jak DEAE-dekstran opłaszcza DNA, natomiast cechą szczególną tego związku jest zdolność do

kondensacji wprowadzanego materiału, co umożliwia lepszą ochronę, oraz wprowadzanie dłuższych

konstruktów.

W przeciwieństwie do fosforanów, czy odczynników lipidowych PEI jak i jego kompleksy

są rozpuszczalne w wodzie co zwiększa stabilność DNA. Kompleks DNA/PEI wnika do komórki na

drodze endocytozy. W komórce we wnętrzu pęcherzyka endosomu wykazuje właściwości buforujące,

działając w jak „gąbka protonowa” powoduje napływ jonów wodorowych do wnętrza kompleksu.

Powstające w ten sposób wysokie ciśnienie osmotyczne prowadzi do napływu wody do wnętrza

endosomu, w konsekwencji czego następuje jego rozerwanie i uwolnienie DNA do cytoplazmy [19].

14

Polietylenoimina znajduje zastosowanie także w terapii genowej poprzez sprzężenie kompleksu

DNA/PEI z inaktywowanymi adenowirusami, czy poprzez zmieszanie go z polisacharydami [19]. Zabieg

ten poza zwiększeniem stabilności kompleksu umożliwia utworzenie go specyficznym do określonej

grupy komórek. Kompleks DNA/PEI połączony z kwasem hialuronowym (HA) stwarza możliwość

zachodzenia endocytozy zależnej od receptorów błonowych kierując w ten sposób materiał do określonej

grupy komórek. Powstają zatem możliwości zastosowania tych związków do prowadzenia doświadczeń,

czy terapii in vivo, na przykład w leczeniu nowotworów [20].

Lipidy kationowe

Lipidy kationowe wykorzystywane w transfekcji to głównie syntetycznie otrzymywane

cząsteczki, złożone z dodatnio naładowanej, hydrofilowej grupy połączonej hydrofobowymi łańcuchami

kwasów tłuszczowych. Lipidy kationowe podzielić można na klasy w zależności od typu grup kationowej

(Rys. 2). Wyróżnia się czwartorzędowe lipidowe sole amoniowe (DOTMA, DOTAP), rozgałęzione lub

liniowe lipopoliaminy (DOGS, DPPES), a także bardziej złożone cząsteczki posiadające elementy

zarówno soli amoniowej jak i poliaminy (DOSPA). Hydrofobowa część lipidów kationowych tworzona

jest przez nasycone, lub nienasycone łańcuchy dialkilowe o różnych długościach [21].

DOGS

DOTMA

15

DOSPA

Rys.2. Struktury cząsteczkowe lipidów kationowych stosowanych w transfekcji.

Cząsteczki takie w roztworach wodnych tworzą micele lub liposomy, czyli zbudowane podobnie

do błony biologicznej dwuwarstwowe pęcherzyki, w których kwasy tłuszczowe zwrócone są do wewnątrz

błony, natomiast grupy kationowe na zewnątrz. Transportowany ładunek może zostać przyłączony

zarówno wewnątrz pęcherzyka, a także do jego zewnętrznej powierzchni, gdyż w obu tych miejscach

znajdują się dodatnie części lipidów kationowych, które są w stanie oddziaływać elektrostatycznie

z ujemnie naładowanymi grupami fosforowymi pochodzącymi z DNA. Powstały w ten sposób kompleks

zwany lipopleksem, podobnie jak w pozostałych metodach fizyko-chemicznych, ma możliwość bliższego

kontaktu z komórką i wniknięcia do wnętrza. Transport do wnętrza komórki odbywa się na drodze

endocytozy, lub poprzez fuzję błony lipopleksu i komórki.

Lipopleksy tworzą się od wpływem wystawienia ich na działanie wody. Jedno z rozwiązań polega

na wytworzeniu cienkiej warstwy wysuszonych lipidów kationowych poprzez odparowanie

rozpuszczalnika, a następnie jego uwodnieniu roztworem DNA. Druga metoda polega na bezpośrednim

zmieszaniu DNA z liposomami, w tym wypadku wymagana jest jednak rozpuszczalność w wodzie

wszystkich odczynników. Stabilność lipopleksów, a co za tym idzie wydajność transfekcji może być

podniesiona dzięki zastosowaniu lipidów neutralnych (np. DOPE, cholesterol). Natomiast stosunek

między stężeniem DNA i lipidów wpływa na wydajność tworzenia lipopleksów, ich rozmiar, stabilność

koloidalną, czy stabilność biologiczną [22].Powierzchnia liposomów może zostać zmodyfikowana przez

przyłączenie określonych ligandów, które łącząc się z receptorami na powierzchni komórki umożliwiają

transport specyficzny [23].

Wykorzystanie lipidów kationowych jest ze względu na uzyskiwanie wysokich wydajności

metodą szeroko stosowną, gdyż charakteryzuje się szeregiem możliwości:

•

Umożliwiają transport DNA i RNA (o szerokich zakresach rozmiarów –

od oligonukleotydów do sztucznych chromosomów – YAC) oraz białek.

16

•

Łączenie

kompleksów

poliaminowych

(DNA/PEI)

z

liposomami

przyczynia

się do wzrostu wydajności takiej transfekcji

•

Istnieje szeroka gama komercyjnie dostępnych odczynników do transfekcji za pomocą

lipidów kationowych. Odczynniki te zostały poddane licznym badaniom i optymalizacjom

określającą warunki, dla których wykazują największe wydajności. Stąd korzystanie

z odczynników komercyjnych nie wymaga długotrwałych czynności przygotowawczych

związanych

z

doborem

optymalnych

parametrów

procesu,

gdyż

dostępne

są z dokumentacją a także szczegółowym protokołem postępowaniu, w którym podane

są parametry takie jak: czas ekspozycji komórek na odczynnik, ilość i stężenie

wymaganego DNA (lub innej biomolekuły) koniecznego do wydajnej transfekcji. Opisane

są ponadto także konkretne rodzaje linii komórkowych, dla których możliwe jest

prowadzenie wydajnej transfekcji

.

Jednakże transfekcja za pomocą lipidów znajduje zastosowanie głównie w metodach in vitro,

gdyż badania przeniesione in vivo wykazują się niskimi wydajnościami. Stan taki prawdopodobnie

wynika a braku dostatecznej wiedzy dotyczącej struktury kompleksów lipid kationowy/DNA, a także

oddziaływań z błoną komórkową, oraz mechanizmów prowadzących do uwolnienia DNA w cytoplazmie,

czy też jego transferu do jądra [23]. Ponadto in vivo dodatnio naładowane lipopleksy mogą być usuwane

niespecyficznie za pomocą ujemnie naładowanych białek poprzez układ siateczkowo- śródbłonkowy

ograniczając w ten sposób możliwość ich przenikania do komórek docelowych. Mimo wszystko

prowadzone są badania mające na celu efektywne wykorzystywanie lipidów kationowych w terapii

genowej [24].

Białka wnikające do komórek

CPP (ang. Cell Penetrating Peptides) to peptydy, które wykazują się zdolnością przenikania

do wnętrza komórki. Właściwość ta połączona z możliwością przyłączania do nich innych cząsteczek

umożliwia wykorzystanie ich, jako przenośników pokonujących barierę błony biologicznej. Peptydy

penetrujące komórki są bowiem w stanie łączyć się wiązaniami kowalencyjnymi, lub oddziaływaniami

elektrostatycznymi z transportowaną cząsteczką, której transport bez ich udziału byłby niemożliwy,

lub nisko wydajny. Ogólnie CPP to peptydy złożone z mniej niż 30 reszt aminokwasowych, z dużym

udziałem aminokwasów kationowych (lizyna, arginina), co umożliwia oddziaływania zarówno z komórką

jak i z kwasami nukleinowymi, czy innymi transportowanymi cząsteczkami o ujemnym ładunku.

Mechanizm translokacji tych peptydów przez błonę biologiczną jest tematem wielu badań i nadal

17

poszukiwana jest odpowiedź jak przenikają one do wnętrza komórki. Poza teorią obejmującą transport

na drodze endocytozy (lub fagocytozy przez np. makrofagi) uważa się, że są one w stanie bezpośrednio

przenikać przez błonę biologiczną [25].

Istotnym zagadnieniem jest zależność transportu za pomocą CPP od energii. Jako że CPP

to cząsteczki silnie hydrofilowe ich swobodna dyfuzja przez błonę komórkową wymagałaby dostarczenia

dużych ilości energii swobodnej, aby przełamać hydrofobowe oddziaływania ze strony wnętrza błony.

Sytuacja taka negatywnie wpływałaby na wydajność transportu. Istnieją jednak hipotezy mówiące

o niezależności transportu za pomocą CPP od energii. W modelu takim białko jest zdolne do tworzenia

porów w błonie za pomocą oddziaływań elektrostatycznych. Umożliwia w ten sposób translokacje

kompleksu białka z ładunkiem. Pory są następnie usuwane przez system czaperonowy [26]. Niezależność

energetyczną potwierdza fakt iż zauważono wydajny transport do komórek nawet w 4º C.

Mimo niewielkich wielkości (do 30 reszt aminokwasowych) CPP są w stanie transportować

cząsteczki znacznych rozmiarów. Ułatwiają transfer dsDNA, wysokocząsteczkowych leków i, innych

białek. CPP znajdują zastosowanie zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo.

Pierwszym odkrytym CPP było białko TAT wirusa HIV-1. Za jego pośrednictwem

transportowano enzymy takie jak β-galaktozydaza, czy peroksydaza [25]. Najlepiej poznanym CPP jest

natomiast białko pAntp (ang. penetratin) pochodzące z Drosophilia melanogaster. Najbardziej

prawdopodobnym mechanizmem przenikania tego białka (wraz z transportowanym ładunkiem) jest

endocytoza, występuje tu zależność od białek błonowych, temperatury prowadzenia procesu, a także

substancji ograniczających endocytozę. Białko to wykazuje się jednak wysokim stopniem wydajności

transfekcji. Jest zatem wykorzystywane do wprowadzania PNA (kwas peptydonukleinowy), siRNA [27].

18

Rozdział III:

Metody biologiczne

Wydajność procesu wprowadzania cząsteczek do komórek jest zależna od wielu czynników,

których jednoznaczne określenie i kontrola jest utrudniona. Trudności napotykane są na wielu etapach

począwszy od samego wydzielenia i oczyszczenia wprowadzanego materiału, poprzez wprowadzenie

go do cytoplazmy, a następnie do jądra. Część z tych ograniczeń może zostać pokonana dzięki

wykorzystaniu naturalnych biologicznych mechanizmów infekcji stosowanych przez wirusy,

czy bakterie. Kodowane przez nie białka umożliwiają dostęp do szeregu specyficznych „odczynników”

które przeprowadzą proces w optymalny sposób. Białka wirulencji są w stanie ochraniać wprowadzany

materiał, pokonywać barierę błony biologicznej, kierować go do jądra, a także przeprowadzać integracje

wprowadzanego DNA z materiałem genetycznym gospodarza. Dzięki metodom biologicznym możliwe

jest także uzyskiwanie wysokich wydajności ekspresji transgenów co wykorzystywane jest przy produkcji

białek z nich pochodzących. Korzystanie z naturalnych mechanizmów transfekcji wiąże się jednak

z ryzykiem negatywnych aspektów infekcji, jako że umieszczamy w hodowli zjadliwe szczepy.

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens to bakteria glebowa powodująca chorobę zwaną guzowatością

korzeni. Dotyka ona głównie rośliny dwuliścienne, jednakże ze względu na korzyści płynące

z transformacji również zbóż prowadzone są prace mające na celu umożliwienie infekcji roślin

jednoliściennych takich jak jęczmień, kukurydza, pszenica [28], czy ryż [29]. Istnieje możliwość

stosowania specjalnie spreparowanych szczepów do prowadzenia transformacji grzybów strzępkowych

[30], czy drożdży [31],

Wnikająca przez skaleczone tkanki (np. pocięte liście) bakteria wprowadza do komórek rośliny

fragment swojego genomu wykorzystując w ten sposób roślinę jako bioreaktor produkujący dla niej

pożywkę. Fakt zainfekowania rośliny widoczny jest przez obecność charakterystycznych narośli

powstałych przez ekspresję wprowadzonych onkogenów. W naroślach tych produkowane są opiny

(pochodne aminokwasów) wykorzystywane przez bakterie.

19

Wprowadzany materiał zawierający geny kodujące syntezę opin znajduje się na plazmidzie Ti

(ang. tumor inductive) złożonym z podwójnej nici DNA w regionie T-DNA. Fragment jest ograniczony

sekwencjami granicznymi kontrolowanymi przez geny vir znajdującymi się na tym samym plazmidzie.

Zauważono, że transformacja nie jest zależna od rodzaju (treści) materiału genetycznego znajdującego się

pomiędzy sekwencjami granicznymi. A zatem możliwe jest zastąpienie, lub dodatkowe umieszczenie

pomiędzy nimi genów które mają znaleźć się w roślinie [32]. Region vir koduje natomiast szereg białek

odpowiedzialnych za transport regionu T-DNA do komórki docelowej.

Mechanizm infekcji przebiega kilkuetapowo. Pierwszy koniecznym punktem jest ekspresja genów

wirulencji. Sygnałem do rozpoczęcia ekspresji tych genów jest fenolowa cząsteczka sygnalna pochodząca

od komórek zranionej tkanki roślinnej – podatnej na transformację [33]. Powstałe białka odcinają region

T-DNA z plazmidu i w postaci jednoniciowej, eksportują go, do komórki docelowej. Zanim to nastąpi

białka bakteryjne muszą rozpoznać obecność komórki roślinnej do której możliwy jest transport. T-DNA

w połączeniu z białkiem ochronnym umożliwiającym kondensację DNA jest wtedy wydzielane poza

komórkę bakteryjną i wprowadzane do komórki roślinnej. Również tam dzięki właściwościom białek

pochodzących z bakterii może nastąpić integracja z genomem gospodarza. Przeprowadzenie

tej skomplikowanej procedury nie byłoby możliwe za pomocą czynników fizykochemicznych.

Ograniczeniem byłyby względy techniczne, a także brak wystarczającej wiedzy na temat poszczególnych

etapów transformacji której dokonuje Agrobacterium [33].

Wprowadzenie do komórek roślinnych regionu T-DNA skutkuje niekontrolowanym wzrostem

transformowanej tkanki (powstawanie guzów). Powstawanie guzów może być traktowane jako wskaźnik

udanej transformacji, najczęściej jednak jest to zjawisko niepożądane. Dlatego też konieczna jest

modyfikacja naturalnych fragmentów T-DNA (tzw. rozbrojenie plazmidu), co umożliwia regenerację

zakażonych fragmentów tkanki [34]. Z zakażonych komórek powstaje kalus, który z użyciem

odpowiednich hormonów roślinnych może zostać przekształcony w konkretną tkankę (np. liścia, korzenia

czy łodygi). Natomiast skuteczność transformacji potwierdzana się poprzez umieszczenie w regionie

T-DNA, dodatkowego genu (np. odporności na kanamycynę). Transformowane komórki umieszcza się na

pożywce zawierającej kanamycynę, dlatego też wyrosną jedynie te, w których skutecznie wprowadzone

zostały nowe geny.

Transformację z użyciem Agrobacterium prowadzi się na dwa sposoby. Klasyczny system

kointegracyjny polega na wprowadzeniu do bakterii plazmidu pomocniczego z wbudowanym weń genem

mającym zostać wprowadzonym do rośliny. Następuje integracja plazmidów, a następnie wycięcie

i wprowadzeni do rośliny T-DNA. Jednak ze względu na znaczne rozmiary plazmidu Ti i ryzyko

20

fragmentacji przez nukleazy opracowano alternatywną, obecnie częściej stosowną metodę

z wykorzystaniem małych plazmidów binarnych (BIBAC, ang. Binary Bacterial Artifical Chromosome).

Umożliwiają one wprowadzenie konstruktów zawierających nawet 150 tpz co oznacza możliwość

umieszczania nowych szlaków metabolicznych [35]. Plazmid taki powielany jest np. w E. coli, następnie

wprowadzany do Agrobacterium, gdzie za pomocą mechanizmu białkowego transportowany jest do

komórki docelowej z pominięciem regionu T-DNA.

Dodatkowo wydajność transformacji podniesiona została dzięki zastosowaniu infiltracji

próżniowej (patrz rozdz. I), czy dodatkowi fenolowej cząsteczki sygnalnej aktywującej ekspresję genów

vir.

Wektory wirusowe

Zastosowanie wektorów wirusowych opiera się na wykorzystaniu naturalnych mechanizmów

infekcji, którymi dysponują one w celu namnożenia się. Wirusy są bowiem w zmuszone wykorzystywać

infekowaną komórkę do ekspresji własnych genów, gdyż same nie prowadzą metabolizmu. Infekcja

wirusowa, jako metoda transfekcji ma zastosowanie zarówno w systemach in vitro, jak i in vivo

(np. terapia genowa). Umieszczenie w genomie wirusa dodatkowych, będących przedmiotem

zainteresowania genów możliwe jest wprowadzenie ich do komórki, oraz uzyskanie ekspresji. Najczęściej

używanymi do transfekcji rodzinami wirusów są: retrowirusy (genom w postaci ssRNA), adenowirusy

(dsDNA), oraz AAV (ang. adeno – associated virus) – wirusy pochodzące od andenowirusów (ssDNA).

Retrowirusy atakują wyłącznie komórki i organizmy eukariotyczne. Mechanizm infekcji

retrowirusowej podzielić można na kilka etapów:

•

Adsorpcja wirusa na powierzchni komórki, oraz transport do jej wnętrza.

Kapsyd retrowirusów składa się z dwóch rodzajów błon. Błona zewnętrzna pochodzi od błony komórki

w której wirus powstał – składa się z dwuwarstwy lipidowej, Zawiera glikoproteiny specyficzne dla

danego wirusa umożliwiające jego identyfikację przez komórkę i transport. Błona ta zostaje zintegrowana

z błoną infekowanej komórki, zatem do wnętrza przedostaje się jedynie wewnętrzna część wirusa

- osłonięta błoną wewnętrzną złożoną z białek wirusowych.

•

Utrata kapsysu, wiążące się z uwolnieniem do cytoplazmy RNA, oraz białek wirusowych.

•

Replikacja, oraz integracja kwasów nukleinowych wirusa z genomem komórki.

Wewnątrz kapsydu poza kwasami nukleinowymi znajdują się białka enzymatyczne. Ułatwiają one

replikację wirusa w komórce docelowej. Odwrotna transkryptaza przepisuje ssRNA na dsDNA, jako

21

matrycę może wykorzystywać zarówno RNA, jak i DNA. Integraza, umożliwiająca włączenie genomu

wirusowego do genomu komórki. W przypadku retrowirusów miejsce integracji jest jednak przypadkowe

•

Ekspresja genów wirusowych

Zintegrowany z genomem zainfekowanej komórki genom wirusowy może pozostawać w stanie

spoczynku przez długi czas (tzw. czas latencji). Natomiast podlegając transkrypcji i translacji

wykorzystuje do tego celu mechanizmy pochodzenia komórkowego (np. polimeraza RNA II). Stąd

w cytoplazmie znajdują się elementy tworzące cząstki wirusowe. Ponadto, komórka dzieląc się, także

przyczynia się do przekazania kopii wirusa kolejnej komórce.

•

Składanie i uwalnianie wirusów potomnych

Produkty ekspresji genów wirusowych, do których zalicza się białka (błonowe, a także integraza,

odwrotna tranksryptaza) oraz RNA wirusa zostają zamknięte w kapsydach. Uwalniane wirusy zostają

otoczone także fragmentem błony lipidowej komórki z wbudowanymi w nią wcześniej białkami

wirusowymi.

Przygotowanie retrowirusów (a także innych wirusów wykorzystywanych jako cząstki

transportujące geny) zawierających dany transgen wymaga zastosowania hodowli komórek pakujących.

Z genomem tych komórek zintegrowana zostaje część genów wirusa, umożliwiając ich ekspresję. Genom

poddany został jednak licznym delecjom w celu wyeliminowania ekspresji genów odpowiedzialnych

za niepożądane cechy. W cytoplazmie komórek znajdują się zatem poszczególne elementy składowe

wirusów potomnych – białka wirusowe (integraza, odwrotna transkryptaza), czy elementy kapsydu.

Jednakże w komórkach tych nie jest możliwe powstanie aktywnych wirusów, gdyż konieczna w tym celu

jest obecność sekwencji warunkującej pakowanie RNA do kapsydu. Sekwencja ta zostaje dostarczona do

komórki wraz z plazmidem zawierającym pożądany (terapeutyczny) gen. Transkrypcja plazmidu

w komórce powoduje powstanie cząsteczki RNA kodującej pożądane białko, a także cząsteczki sygnalnej

rozpoczynającej proces pakowania kapsydów. Dlatego wirusy potomne powstają dopiero wtedy,

gdy dostarczony zostanie plazmid zawierający informacje mające zostać umieszczone w genomie

wirusowym. Integracja wprowadzonego plazmidu z genomem komórki pakującej możliwe jest dzięki

umieszczeniu w nim promotora i terminatora pochodzenia wirusowego [36].

Infekcja retrowirusowa znajduje zastosowanie w prowadzeniu doświadczeń na eukariotycznych

liniach komórkowych (np. hodowla ludzkich komórek NK [37]), Warunkiem efektywnej transdukcji jest

jednak konieczność pracy na dzielących się komórkach. Retrowirusy wykorzystywane są także w terapii

genowej ex vivo przy leczeniu niedoboru w syntezie enzymu deaminazy adenozyny, co prowadzi

22

do obniżenia liczby limfocytów i wiążącym się z tym faktem spadku odporności (ADA-SCID

– ang. adenosine deaminase – serve combined immune deficency). Pobrane od pacjenta limfocyty

transdukowane są retrowirusem niosącym gen ADA in vitro, a następnie ponownie podawane pacjentowi,

który zdobywa w ten sposób zdolność produkcji enzymu ADA [38], [39]. Często wykorzystywany do

transfekcji retrowirus zaliczany do grupy lentiwirusów to HIV (ang. human immunodeficiency virus)

– ludzki wirus niedoboru odporności [40].

Adenowirusy (Ad) odpowiadają za większość infekcji górnych dróg oddechowych, stąd

identyfikowane są z chorobami nie wywołującymi istotnego zagrożenia dla zdrowia. Cykl replikacyjny

adenowirusów nie zakłada integracji ich genomu z genomem komórki infekowanej [41].

Jako wektory charakteryzują się szeregiem zalet: mogą infekować wiele linii komórkowych,

również niedzielących się, ponadto ich produkcja jest stosunkowa łatwa. Zaletą jest także możliwość

przeprowadzenia modyfikacji umożliwiających kierowanie wirusów do określonych tkanek. Białka

wirusowe są rozpoznawane przez receptory komórkowe (CAR), które oddziałując na siebie umożliwiają

wejście wirusa do komórki. Specyficzna transdukcja ma szczególne znaczenie w wypadku prowadzenia

terapii genowej in vivo, gdyż podana dawka wirusów infekuje jedynie pożądaną tkankę, nie wpływając na

inne. Nie ma zatem strat ilościowych wirusa, co zwiększa wydajność transdukcji.

Kolejną strategią w tworzeniu wektorów adenowirusowych jest obniżenie odpowiedzi

immunologicznej. Wydajność terapii genowej ograniczona jest wraz z wytwarzaniem przez organizm

odporności swoistej i wiążącej się z tym problemem w utrzymaniu wysokiej infekcyjności. Po podaniu

pierwszej dawki wirusa organizm zaczyna wytwarzać przeciwciała. Kolejne, później podane dawki

wirusa, zostają szybko zwalczane dzięki rozwiniętej już odporności.

Adenowirusy wykorzystywane są jako wektory do transfekcji komórek eukariotycznych w celu

produkcji białek. Wykazują także potencjał w ich wykorzystaniu w terapii genowej in vivo, ze względu na

infekcyjność komórek niedzielących się (np. wątroby [42]).

AAV czyli wirusy związane z adenowirusami (ang. adeno-associated virus), posiadają materiał

genetyczny w postaci jednoniciowego łańcucha DNA, zaledwie ok. 4,5 tpz. Imtegrują z genomem

gospodarza specyficznie na 19 chromosomie, jednakże pozostają w fazie „uśpienia” (latencji), gdyż nie

potrafią samodzielnie się replikować, aż do momentu infekcji komórki przez inny wirus (adenowirus).

Dopiero wtedy ulegają namnożeniu i uwolnieniu z komórki, wraz z wirusem pomocniczym.

Genom AAV zawiera dwa istotne ze względu wprowadzania genów fragmenty:

CAP – odpowiedzialne za syntezę składników wirusa oraz REP odpowiedzialne za integrację z genomem

23

gospodarza. Oba te fragmenty zostają usunięte, stąd wektory przygotowywane z AAV zostają

pozbawione zdolności do specyficznej integracji. Ich materiał genetyczny pozostaje w formie

episomalnej, lub integruje w przypadkowych miejscach, nadal możliwa jest jednak długotrwała ekspresja.

W celu przygotowania wektorów AAV do komórek przez nie zainfekowanych podaje się adenowirusy

umożliwiające ich replikację, oraz plazmidy: zawierające pożądany transgen, a także plazmid zawierający

sekwencje REP i CAP (konieczne do powstania aktywnych wirusów). Transgen zostaje włączony

do nowopowstających cząstek wirusowych.

Wektory tworzone na bazie AAV pozbawione są wszystkich jego genów, co zmniejsza jego

toksyczność wobec tkanek. Zaletami wektorów AAV są ponadto: brak patogenności (nie poznano dotąd

żadnych chorób wywoływanych przez AAV [43]), mogą transdukować zarówno komórki dzielące się jak

i niedzielące się.

Stosowanie metod wirusowego wprowadzanie genów do komórek wiąże się jednak zawsze

z ryzykiem indukcji procesów kancerogennych. Prowadzone są także badania mające na celu wyciszanie,

czy wycinanie fragmentów genomów wirusowych odpowiedzialnych za wywoływanie intensywnych

odpowiedzi immunologicznych. Niepożądane jest także doprowadzenie do śmierci komórki pod

wpływem namnażających się wirusów – stąd modyfikowane są geny odpowiedzialne za zdolność

do replikacji.

Transdukcja bakteryjna

Bakteriofagi to wirusy atakujące jedynie komórki bakteryjne. Podobnie jak w przypadku

pozostałych wirusów wykorzystują one metabolizm gospodarza do replikacji genomu, oraz wytworzenia

składników budujących cząstkę wirusa. Istnieją jednakże dwa cykle prowadzące do replikacji genomu

bakteriofaga.

Cykl lizogenny polega na włączeniu genomu faga do genomu bakteryjnego. Replikacja odbywa

się za pomocą bakteryjnego replisomu. Genom wirusowy zostaje dziedziczony przez kolejne generacje

bakterii, jednakże bakteriofag pozostaje nieaktywny.

Cykl lityczny prowadzi do namnażania się potomnych wirusów wewnątrz bakterii

i, w konsekwencji, do jej rozpadu z uwolnieniem wirusów potomnych na zewnątrz komórki.

Pod wpływem różnych czynników (np. promieniowanie ultrafioletowe) możliwe jest przejście

od cyklu lizogennego do litycznego. Fagi zdolne do prowadzenia obu cykli nazwane są fagami

łagodnymi.

24

Mechanizm infekcji bakteriofagami (czyli wirusami bakteryjnymi) składa się z kilku etapów:

•

Zaadsorbowanie faga na powierzchni komórki. Bakteriofagi wykazują się wysoką

specyficznością. Dany gatunek, a w niektórych wypadkach nawet szczep, posiada swój

charakterystyczny rodzaj bakteriofaga.

•

Wstrzyknięcie kwasów nukleinowych, oraz enzymów wirusowych do komórki (bakteriofag

pozostaje na zewnątrz).

•

Skutkiem działania enzymów wirusowych materiał genetyczny faga zostaje wielokrotnie

powielony. Powstaje tzw. konktamrer, czyli liniowa cząsteczka zawierająca po sobie wiele kopii

DNA infekującego faga.

•

By powstały nowe kopie wirusa konieczne jest pocięcie konktamera na fragmenty odpowiadające

jednej długości genomu infekującego faga. Odbywa się to dzięki wirusowemu enzymowi

endonukleazie. Jednakże brak specyficzności substratowej tego enzymu prowadzi do pocięcia

także materiału genetycznego bakterii.

•

Następuje pakowanie zsyntezowanych w komórce kapsydów fagowych materiałem genetycznym.

Odpowiedzialne za to enzymy wirusowe nie rozpoznają jednak pochodzenia kwasów

nukleinowych, a umieszczają w kapsydzie jedynie fragmenty o odpowiedniej długości. Dlatego

powstają wirusy o materiale pochodzącym zarówno od infekującego faga (większość)

jak i z bakterii.

•

Następuje uwolnienie wirusów potomnych najczęściej związane rozpadem komórki gospodarza.

Występują jednak wyjątki (fag M13), gdzie uwolnienie potomnych wirusów nie prowadzi do lizy

komórki gospodarza.

•

Tak powstałe bakteriofagi umożliwiają transfer genów pomiędzy komórkami bakteryjnymi,

gdyż fag niosący materiał genetyczny pochodzący z bakterii infekując kolejną komórkę

wprowadza do jej wnętrza fragment genomu innego organizmu. Odzwierciedlone jest to w

zmianie fenotypowej zainfekowanej komórki. Co więcej fag niosący materiał genetyczny

pochodzący z bakterii nie wykazuje się zdolnością do fragmentacji kwasów nukleinowych

gospodarza, natomiast istnieje szansa na włączenie materiału do genomu bakterii.

Za pomocą bakteriofagów możliwa jest wymiana materiału genetycznego pomiędzy dwiema

komórkami bakteryjnymi. W przyrodzie zjawisko to uznaje się za proces parapłciowy, gdyż prowadząc

do transformacji nadaje komórce nowe cechy [44]. W ten sposób bakterie mogą uzyskiwać nowe,

25

objawiające się fenotypowo cechy, na przykład powstanie form patogennych z dotąd łagodnych szczepów

np. przecinkowca cholery, czy maczugowca błonicy. Proces taki nosi nazwę konwersji fagowej. Fakt

zmiany fenotypowej spowodowany jest wprowadzeniem do genomu bakteryjnego genów pochodzących

z faga kodujących nowe białka.

W biologii molekularnej jako wektor często wykorzystywany jest fag lambda. Jest on w stanie

integrować swój genom z genomem gospodarza (np. E. coli). Zaletą tego faga jest to, że integruje on

zawsze w tym samym, określonym miejscu genomu infekowanej bakterii. Gdy w bakteriofagu

umieszczone są obce geny umożliwia on transformację. Jako fag łagodny w zależności od stężenia

charakterystycznych białek w komórce (CRO i CI) może on prowadzić zarówno cykl lityczny

jak i lizogenny [45]. Użycie faga polegać może także na stosowaniu metod inżynierii genetycznej in vivo

(ang. recombineering – recombination-mediated genetic engineering). Metoda ta ma zastosowanie

do konstrukcji wektorów umożliwiających modyfikację genomu (wyciszanie genów np. knockout mouse),

lub w przypadku pracy na genomach bakteryjnych, bezpośredniej ingerencji w genom przeprowadzonej

wewnątrz komórki [46]. Modyfikacje takie byłyby niemożliwe, lub bardzo trudne do przeprowadzenia

w stanie in vitro.

26

Podsumowanie

Przedstawione metody wprowadzania biomolekuł do komórek wykorzystują szereg różnorodnych

mechanizmów prowadzących do wprowadzenia badanych cząsteczek do wnętrza komórek. Jednakże

żadna z tych metod nie może być uznana za doskonałą. Stwierdzenie to potwierdzone jest przez szereg

badań, które nadal prowadzone są w celu optymalizacji istniejących już metod. Bez względu na wybraną

metodę transfekcja jest czynnikiem stresowym, a znaczna część poddawanych eksperymentowi komórek

ginie, lub nie uzyskuje się oczekiwanych rezultatów. Istnieją naturalne mechanizmy obrony przed obcym

materiałem genetycznym, które często prowadzą do śmierci komórki poprzez apoptozę. Komórka stara

się wyciszyć wprowadzony DNA poprzez metylację, co prowadzi do zmiany ekspresji wielu genów.

Dlatego aby skutecznie prowadzić transfekcję konieczne jest prowadzenie badań na komórkach

w możliwie najlepszym stanie – będących w fazie logarytmicznego wzrostu, w stężeniu, które nie

wpływa na nie stresowo.

Niska wydajność wprowadzania, oraz niska powtarzalność wyników wynikać może z nadal

niedostatecznej wiedzy. Nieznane są dokładne mechanizmy w jaki wprowadzane cząsteczki potrafią

przenikać barierę błony (czy ściany) komórkowej. Konieczne jest stosowanie odczynników o wysokim

stopniu czystości (np. oczyszczanie DNA poprzez wirowanie w gradiencie CsCl), oraz zachowanie

wysokiego stopnia sterylności laboratorium.

Rozwój metod wprowadzania biomolekuł do komórek jest konieczny, gdyż związany jest

z produkcją organizmów transgenicznych, czy białek pochodzących z zrekombinowanych genów.

Podnoszenie wydajności transfekcji (czy transformacji) wiąże się zatem pośrednio z rozwojem dziedzin

takich jak rolnictwo (produkcja odmian odpornych na szkodniki), medycyna (terapia genowa zarówno

in, jak i ex vivo), czy farmacja (np. produkcja insuliny).

27

Bibliografia

1.

Fukui, Y., Microinjection technique for Dictyostelium in “Cell Biology: A Laboratory Handbook”

(1998).

2.

Lacal, J. C., Perona, R., Feramisco J. (ed.) Microinjection Berlin, Birkhauser 1999

3.

Evans, T. C., ed. Transformation and microinjection (April 6, 2006), WormBook, ed. The C.

elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.108.1

4.

Wang W., Liu X., Gelinas D., Ciruna B., Sun Y. (2007) A Fully Automated Robotic System for

Microinjection of Zebrafish Embryos. PLoS ONE 2(9):

5.

Shigekawa, K., Dower, W.J. (1988) Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: a general

approach to the introduction of macromolecules into cells. BioTechniques

6

, 742–51.

6.

Norton, P. A., Pachuk, C. J. Methods for DNA introduction into mammalian cells, in Gene

Transfer and Expression in Mammalian Cells, S.C. Makrides (ed.), 2003 Elsevier Science B.V.

7.

Nickoloff J.A. 1995. Preface. In: Nickoloff JA, editor. Electroporation Protocols for

Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p v-vi.

8.

Weaver J.C. 1995. Electroporation Theory: Concepts and Mechanisms. In: Nickoloff JA, editor.

Electroporation Protocols for Microorganisms. Totowa, New Jersey: Humana Press. p 1-26.

9.

Christou, P., McCabe, D. Particle Gun Transformation of Crop Plants Using Electric Discharge

(ACCELL™ Technology). Agracetus Inc., Middleton, WI; 1992.

10.

Woods G., Zito K. (2008). Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons

in Slice Culture. JoVE. 12. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=675, doi:

11.

Alemzadeh, A., Ghareyazie, G., Tabatabaie, S. B. E., Biolistic transformation of rice (Oryza

sativa L.) using hpt and Gus genes, Iranian Journal of Agricultural Sciences. 35, (2): 483-491,

2004.

12.

Froger A, Hall JE Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis

Exp. 2007;(6):253. Epub 2007 Aug 1.

13.

Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. How does plasmid DNA penetrate cell membranes in artificial

transformation process of Escherichia coli? Mol Membr Biol. 2008 Aug;25(5):411-22.

28

14.

Kingston R.E., Chen C.A., Okayama H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol.

2001 May;Chapter 10:Unit 10.13. Review.

15.

Loytner, S. et al. (1982) Mechanisms of DNA uptake by mammalian cells: Fate of exogenously

added DNA monitored by the use of fluorescent dyes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

79

, 422–6.

16.

Tanner F.C., Carr DP, Nabel GJ, Nabel EG. Transfection of human endothelial cells. Cardiovasc

Res. 1997 Sep;35(3):522-8.

17.

Schenborn E.T., Goiffon V., DEAE- dextran transfection of mammalian cultured cells., Methods

Mol Biol 130: 147-153

18.

Gauss, G.H., Lieber, M.R. DEAE-dextran enhances electroporation of mammalian cells. in

Nucleic Acids Res. 1992 December 25; 20(24): 6739–6740..

19.

Pathak, A., Patnaik, S., Gupta, G.C. Poliethylenimine derived nanoparticles for efficient gene

delivery. in Nucleic Acids Symposium series no. 53 57-58.

20.

Jiang G, Park K, Kim J, Kim KS, Hahn SK. Target specific intracellular delivery of siRNA/PEI-

HA complex by receptor mediated endocytosis. Mol Pharm. 2009 May-Jun;6(3):727-37.

21.

Masson, C., Escriou, V., Bessodes, M., Scherman, D. Lipid reagents for DNA transfer into

mammalian cells. In Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, S.C. Makerides (Ed.),

2003 Elsevier Science B.V.

22.

Pitard B, Aguerre O, Airiau M, Lachagès AM, Boukhnikachvili T, Byk G, Dubertret C, Herviou

C, Scherman D, Mayaux JF, Crouzet J Virus-sized self-assembling lamellar complexes between

plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Dec

23;94(26):14412-7.

23.

C. Masson, V. Escriou, M. Bessodes, D. Scherman. Lipid reagents for DNA transfer into

mammalian cells. In: Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, S.C. Makerides (ed.),

2003 Elsevier Science.

24.

Resina, S., Prevot, P., Thierry, A.R. Physico-Chemical Characteristics of Lipoplexes Influence

Cell Uptake Mechanisms and Transfection Efficacy in PLoS One. 2009; 4(6): e6058. Published

online 2009 June 26.

25.

Veldhoen, S., Laufer, S.D., Restle, T. Recent Developments in Peptide-Based Nucleic Acid

Delivery International Journal of Molecular Sciences

26.

Henry D. Herce & Angel E. Garcia Cell Penetrating Peptides: How Do They Do It? Received: 12

November 2007 / Accepted: 7 April 2008 /

29

27.

Eudes, F., Chugh, A. Cell-penetrating peptides From mammalian to plant cells Plant Signal

Behav. 2008 August;3(8): 549–550.

28.

Hensel, G., Kastner, C., Oleszczuk, S., Riechen, J., Kumlehn, J. Agrobacterium-Mediated Gene

Transfer to Cereal Crop Plants: Current Protocols for Barley, Wheat, Triticale, and Maize. Int J

Plant Genomics. 2009; 2009: 835608. Published online 2009 June 21. doi: 10.1155/2009/835608.

29.

Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)

mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6:

271–282

30.

de Groot MJ, Bundock P, Hooykaas PJJ, Beijersbergen AG (1998) Agrobacterium tumefaciens-

mediated transformation of filamentous fungi. Nat Biotechnol 16: 839–842; erratum de Groot MJ,

Bundock P, Hooykaas PJJ, Beijersbergen AG (1998) Nat Biotechnol 16:

31.

Bundock P, den Dulk-Ras A, Beijersbergen A, Hooykaas PJJ (1995) Transkingdom T-DNA

transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 14: 3206–3214

32.

Tzfira, T., Citovsky, V.

The Agrobacterium-Plant Cell Interaction. Taking Biology Lessons

from a Bug, Plant Physiology 133:943-947 (2003)

© 2003

33.

Stachel SE, Messens E, Van Montagu M, Zambryski PC (1985) Identification of the signal

molecules produced by wounded plant cell that activate T-DNA transfer in Agrobacterium

tumefaciens. Nature 318: 624–629

34.

Stanton B. Gelvin

Agrobacterium in the Genomics Age Plant Physiology 150:1665-1676 (2009)

© 2009

35.

Bartoszewski G, Niemirowicz-Szczytt K 1997: Transformacja pomidora za pomocą

Agrobacterium tumefaciens. Biotechnologia, 1 (40) 43-63, 1998

36.

Parolin, C., Palu, G. Virus-based vectors for gene expression in mammalian celle: Retrovirus,

2003, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells

37.

Shahjahan Miah SM, Campbell KS., Expression of cDNAs in Human Natural Killer Cell Lines by

Retroviral Transduction, Methods Mol Biol. 2010;612:199-208.

38.

Aiuti, A., Roncarolo, M.G.

Ten years of gene therapy for primary immune deficiencies in

Hematology 2009

39.

Cassani B, Montini E, Maruggi G, Ambrosi A, Mirolo M, Selleri S, Biral E, Frugnoli I,

Hernandez-Trujillo V, Di Serio C, Roncarolo MG, Naldini L, Mavilio F, Aiuti A., Integration of

30

retroviral vectors induces minor changes in the transcriptional activity of T cells from ADA-SCID

patients treated with gene therapy. Blood. 2009 Oct 22;114(17):3546-56. Epub 2009 Aug 3.

40.

Pluta, K., Kacprzak, M.M. Use of HIV as a gene transfer vector, Acta Biologica Polonica, Vol. 56

No. 4/2009

41.

D. Bourbeau, Y. Zeng, B. Massie, Virus-based vectors for gene expression in mammalian cells:

Adenovirus. In: Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, S.C. Makrides, (ed.) 2003

Elsevier Science.

42.

Di Paolo NC, Shayakhmetov DM. Adenovirus de-targeting from the liver. Curr Opin Mol Ther.

2009 Oct;11(5):523-31.

43.

Xiao Xiao Virus-based vectors for gene expression in mammalian cells: Adeno-associated virus.,

2003, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells

44.

Lederberg J, Tatum EL. Sex in bacteria; genetic studies, 1945-1952. Science. 1953 Aug

14;118(3059):169-75.

45.

Court, D. L., Oppenheim, Amos, B., Adhya, S.L. A New Look at Bacteriophage λ Genetic

Networks J Bacteriol. 2007 January; 189(2): 298–304

46.

Sawitzke JA, Thomason LC, Costantino N, Bubunenko M, Datta S, Court DL., Recombineering:

in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond., Methods Enzymol. 2007;421:171-

99.