Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011

WYZNACZANIE WSPÓŁCZYNNIKA PODZIAŁU
(N-OKTANOL/WODA) METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)
DLA CHLOROTALONILU

M

AREK

M

ISZCZYK

Instytut Ochrony Roślin – Państwowy Instytut Badawczy
Oddział Sośnicowice
Gliwicka 29, 44-153 Sośnicowice
[e-mail]

I. WSTĘP

Współczynnik podziału n-oktanol/woda wyraża poziom stężenia monomerycznej,

neutralnej substancji w fazie organicznej (C

n-oktanol

) i fazie wodnej (C

woda

) w układzie

dwuskładnikowym w takich samych warunkach (Mannhold i wsp. 1998; Jóźwiak i wsp.
2001; OECD 117 2004):

P

ow

= C

n-oktanol

/C

woda

Współczynnik podziału n-oktanol/woda jest najczęściej stosowanym parametrem do

ilościowego opisu lipofilowości (Miszczyk i Pyka 2005). Opracowano różne metody
doświadczalne (metoda ekstrakcyjna, szereg metod wykorzystujących techniki chroma-
tograficzne) oraz teoretyczne metody obliczeniowe wyznaczania parametrów charakte-
ryzujących liofilowość. Spośród metod doświadczalnych, zastosowanie technik chroma-
tograficznych, daje szereg korzyści: mniejsza pracochłonność, prostota, możliwość
wyznaczania lipofilowości dla dużej ilości substancji jednocześnie, a także porówny-
wania bezpośredniego lipofilowości poprzez obserwację migracji analitów, nie wyma-
gana jest tak wysoka czystość próbek, jak w przypadku metod klasycznych, mniejsza
jest również ilość substancji potrzebnej do badania, możliwość pomiaru lipofilowości
w szerokim zakresie wartości (w tradycyjnych metodach niemożliwe lub obarczone
dużym błędem), brak potrzeby przeprowadzania analizy ilościowej, dobra odtwarzal-
ność, możliwość standaryzacji otrzymanych wyników, układy chromatograficzne (faza
ruchoma – faza stacjonarna) lepiej niż tradycyjny układ n-oktanol – woda modelują
oddziaływania w strukturach biologicznych (anizotropowość, możliwość wnikania
cząsteczek analitu na różną głębokość w hydrofobowy film, częściowe uwzględnienie
czynników sterycznych biologicznej lipofilowości poprzez parametry retencyjne, dy-
namiczny układ chromatograficzny powinien lepiej reprezentować biologiczną lipofi-
lowość niż statyczny i izotropowy układ ekstrakcyjny), możliwość wyznaczenia lipofi-

Wyznaczanie współczynnika podziału (n-oktanol/woda)…

1249

lowości dla substancji zjonizowanych i stosowanie szerokiego zakresu pH (technika
MEEKC), nie ma potrzeby stosowania dodatkowych układów odniesienia, jak dla ukła-
du n-oktanol – woda (możliwość stosowania retencji chromatograficznej jako bezpo-
średniego parametru lipofilowości) (Hanna i wsp. 1998; Kaliszan 1998; Jóźwiak i wsp.
2001).

Celem badania było zastosowanie opracowanych warunków chromatografowania

techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) dla chlorotalonilu do
oznaczenia współczynnika podziału (n-oktanol/woda) na podstawie wytycznych zawar-
tych w Przewodniku OECD 117: OECD Guidelines For The Testing of Chemicals –
Partition Coefficient (n-octanol/water), High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) Method (2004).

II. MATERIAŁ I METODY

Materiał

Jako materiał testowy zastosowano wzorzec analityczny chlorotalonilu o czystości

99,3% (Sigma-Aldrich) (rys. 1).

N

N

Cl

Cl

Cl

Cl

Rys. 1. Chlorotalonil – wzór strukturalny
Fig. 1. Chlorothalonil – a stuctural formula

Ze względu na dostępność danych literaturowych dotyczących wartości współczyn-

nika podziału – log P

ow

dla chlorotalonilu, pominięto etap z wykorzystaniem metod

obliczeniowych do wstępnego ustalenia jego wartości. Na podstawie danych literaturo-
wych dotyczących wartości log P

ow

dla chlorotalonilu, wybrano substancje wzorcowe

(tab. 1).

Do wyznaczenia czasu substancji niezatrzymywanej wybrano metanol.

Tabela 1. Wzory strukturalne oraz wartości log P

ow

substancji wzorcowych

Table 1. Structural formulas and log P

ow

values for reference substances

Nazwa substancji

Name of substance

Wartość log P

ow

Log P

ow

value

Wzór strukturalny
Structural formula

1 2 3

Anilina
Aniline

0,9

NH

2

Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011

1250

1 2 3

Benzonitryl
Benzonitrile

1,6

N

Nitrobenzen
Nitrobenzene

1,9

N

O

O

Chlorobenzen
Chlorobenzene

2,7

Cl

Toluen
Toluene

2,8

CH

3

1,4-Dichlorobenzen
1,4-Dichlorobenzene

3,4

Cl

Cl

1,2,4-Trichlorobenzen
1,2,4-Trichlorobenzene

4,2

Cl

Cl

Cl

P

ow

– współczynnik podziału n-oktanol/woda

Metoda

1. Warunki badania

Badanie przeprowadzono w oparciu o wytyczne zawarte w Przewodniku OECD

117: OECD Guidelines For The Testing of Chemicals – Partition Coefficient
(n-octanol/water), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method (2004).

Zastosowano następujące warunki chromatografowania:

– zestaw do HPLC Agilent 1200 Series z podwójną pompą binarną oraz detekto-

rem UV-DAD,

– kolumna: Zorbax C 8 5u, 250 mm

× 4,6 mm,

– temperatura kolumny: 20°C,

Wyznaczanie współczynnika podziału (n-oktanol/woda)…

1251

– eluent: H

2

O/MeOH w stosunku objętościowym 30:70 (v/v),

– przepływ: 1 ml/min,
– objętość nastrzyku: 20 µl,
– detekcja: 210 nm (dla substancji wzorcowych), 240 nm (dla badanej substancji).

2. Współczynniki retencji chromatograficznej

Współczynniki retencji chromatograficznej – k, obliczono z wykorzystaniem rów-

nania:

k = (t

R

-t

0

)/t

0

,

gdzie:
t

R

– czas retencji badanej substancji,

t

0

– czas substancji niezatrzymywanej.

3. Przygotowanie roztworu substancji wzorcowych

W kolbach miarowych o pojemności 100 ml przygotowano metanolowe roztwory

substancji wzorcowych o stężeniu około 1 mg/ml, a następnie w celu sporządzenia
roztworu wzorcowego pobrano po 10 ml z każdego roztworu substancji wzorcowej
i umieszczono w kolbie o pojemności 100 ml. Roztwór uzupełniono eluentem do kreski.

4. Przygotowanie roztworu substancji badanej

W kolbie miarowej o pojemności 100 ml sporządzono metanolowy roztwór standar-

du analitycznego chlorotalonilu o stężeniu około 1 mg/ml, a następnie pobrano 1 ml
roztworu i umieszczono w kolbie o pojemności 100 ml. Roztwór uzupełniono do kreski
eluentem.

III. WYNIKI I DYSKUSJA

W tabeli 2. umieszczono otrzymane czasy retencji – t

R

, wartości współczynników

retencji – k oraz log k, a także wartości literaturowe współczynników podziału – log P

ow

dla substancji wzorcowych.

Średnia wartość czasu substancji niezatrzymywanej (metanolu) wynosiła 2,643 mi-

nut.

Na podstawie uzyskanych danych wyprowadzono zależność log k od log P

ow

dla

substancji wzorcowych charakteryzującą się następującymi parametrami:

y = 2,6094x + 1,7796; R

2

= 0,99

Dla badanej substancji – chlorotalonilu uzyskano następujące wartości:

– czas retencji (n = 5) – 9,959 minut,
– współczynnik retencji – k – 2,767,
– logarytm współczynnika retencji – log k – 0,442.

Wykorzystując uzyskaną dla substancji wzorcowych zależność obliczono wartość

logarytmu współczynnika podziału dla chlorotalonilu. Otrzymana wartość to 2,93.

Otrzymana w trakcie badania odtwarzalności metody wartość log P

ow

wyniosła 2,97.

Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011

1252

Tabela 2. Wartości czasów retencji, współczynników retencji, logarytmów współczynników re-

tencji oraz logarytmów współczynników podziału dla substancji wzorcowych

Table 2. Retention times, retention coefficients, logarithm of retention coefficients and logarithm

of partition coefficients for reference substances

Nazwa substancji

Name of substance

t

R

[min]

*

k

log k

log P

ow

Anilina
Aniline

3,811 0,442

−0,355

0,9

Benzonitryl
Benzonitrile

4,667 0,766

−0,116

1,6

Nitrobenzen
Nitrobenzene

5,775 1,185

0,074 1,9

Chlorobenzen
Chlorobenzene

9,612 2,636

0,421 2,8

Toluen
Toluene

9,883 2,739

0,438 2,7

1,4-Dichlorobenzen
1,4-Dichlorobenzene

13,395 4,067

0,609 3,4

1,2,4-Trichlorobenzen
1,2,4-Trichlorobenzene

21,889 7,280

0,862 4,2

* wartość średnia dla n = 5 – average value for n = 5
k – współczynnik retencji chromatograficznej
t

r

– czas retencji badanej substancji

P

ow

– współczynnik podziału n-oktanol/woda

IV. WNIOSKI

Wyznaczona w trakcie badania wartość logarytmu współczynnika podziału dla chlo-

rotalonilu wyniosła 2,93, natomiast dane literaturowe podają wartość 2,92. Zalecane
przez Przewodnik OECD 117 (2004) kryterium dla odtwarzalności wynosi ±0,5 jed-
nostki logarytmicznej, a dla zależności log

P

ow

od log k dla substancji wzorcowych

współczynnik korelacji powinien wynosić około 0,9.

Uzyskane wyniki świadczą o tym, że zastosowane warunki wyznaczenia współ-

czynnika podziału spełniają kryteria OECD, a tym samym mogą być zastosowane w ba-
daniach rejestracyjnych chlorotalonilu i być źródłem wiarygodnych informacji.

V. LITERATURA

Hanna M., de Biasi V., Bond B., Salter C., Hutt A.J., Comilleri P. 1998. Estimation of the parti-

tioning characteristics of drugs: a comparison of a large and diverse drug series utilising
chromatographic and electrophoretic methodology. Anal. Chem. 70: 2092

−2099.

Jóźwiak K., Szumiło H., Soczewiński E. 2001. Lipofilowość, metody wyznaczania i rola w dzia-

łaniu biologicznym substancji chemicznych. Wiad. Chem. 55: 1048

−1074.

Wyznaczanie współczynnika podziału (n-oktanol/woda)…

1253

Kaliszan R. 1998. Effect of separation condition on chromatographic determination of hydropho-

bicity of acidic xenobiotics. J. Chromatogr. B 717: 125

−134.

Mannhold R., Rekker R.F., Dross K., Bijloo G., de Vries G. 1998. The lipophilic behaviour of

organic compounds. 1. An updating of thehydrophobic fragmental approach. Quant. Struct.–
Act. Relat. 17: 517

−536.

Miszczyk M., Pyka A. 2005. Zależność wartości log P n-oktanol/woda od wartości pH dla wy-

branych pochodnych mocznika. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 45 (2): 919

−921.

OECD 117 2004. OECD Guidelines For The Testing of Chemicals – Partition Coefficient

(n-octanol/water), High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method.

M

AREK

M

ISZCZYK

DETERMINATION OF THE PARTITION COEFFICIENT N-OCTANOL/WATER

WITH THE USE OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC) FOR CHLOROTHALONIL

SUMMARY

Partition coefficient n-octanol/water is the most commonly used parameter for describing

lipophilicity. The aim of this study was the usefulness of high performance liquid chromatogra-
phy (HPLC) for determination of log P

ow

for chlorothalonil based on OECD 117: OECD Guide-

lines For The Testing of Chemicals – Partition Coefficient (n-octanol/water), High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) Method (2004). As reference substances: aniline, benzonitrile,
nitrobenzene, chlorobenzene, toluene, 1,4-dichlorobenzene, 1,2,4-trichlorobenzene were selected.
The dead time was measured by using methanol as an unretained substance. The obtained by
HPLC technique value of log P

ow

for chlorothalonil amounted to 2.93, and was comparable to

literature data 2.92. The results revealed the usefulness of presented method in registration studies
on chlorothalonil.
Key words: partition coefficient, chlorothalonil, HPLC